滅活卷曲乳桿菌CCFM1118緩解幽門螺桿菌感染的作用評(píng)價(jià)

陳峰,李敏玉,劉玲,于雷雷*,耿芊*,田豐偉,翟齊嘯

1(江南大學(xué) 食品學(xué)院,江蘇 無(wú)錫,214122)2(海軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院,上海,200433)

幽門螺桿菌(Helicobacterpylori)是一種常見(jiàn)的革蘭氏陰性致病細(xì)菌。作為一種在世界范圍內(nèi)傳播的感染菌,H.pylori感染了世界上約50%的人口[1]。H.pylori的廣泛傳播與其傳播途徑密不可分,H.pylori可通過(guò)口口、糞口和胃口途徑在人與人之間傳播[2]。H.pylori可以適應(yīng)胃中惡劣的酸性環(huán)境,并可與宿主細(xì)胞受體相互作用以定殖胃黏膜[3];定殖后,H.pylori通過(guò)形成生物膜、干擾宿主代謝途徑、誘導(dǎo)神經(jīng)免疫串?dāng)_及擾亂胃屏障穩(wěn)態(tài)等方式來(lái)提高其在胃內(nèi)的生存能力,實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)久、穩(wěn)定的定殖[4]。H.pylori與許多胃腸道疾病的發(fā)展密切相關(guān),幾乎所有H.pylori感染者都有不同程度的胃炎,隨著時(shí)間的推移,胃炎則可能會(huì)發(fā)展為更嚴(yán)重的癥狀。研究表明,25%～30%的H.pylori感染者會(huì)由普通的感染發(fā)展為消化不良、消化性潰瘍甚至是胃癌等胃腸道疾病[5]。

根除H.pylori感染具有重要意義。目前常見(jiàn)的H.pylori治療方式是三聯(lián)療法和四聯(lián)療法,這2種療法的H.pylori醫(yī)學(xué)根除成功率可以達(dá)到70%～95%[6]。然而,由于抗生素耐藥性的增加,這一比率一直在下降,且因?yàn)榭股啬退幮?藥物治療不能被長(zhǎng)期使用。此外,藥物治療存在著嚴(yán)重的副作用,如抗生素治療(特別是反復(fù)、長(zhǎng)期使用抗生素)會(huì)嚴(yán)重?cái)_亂腸道微生態(tài)環(huán)境。因此,需要更加有效、溫和的治療方案來(lái)控制H.pylori。

益生菌是對(duì)人體健康有益的微生物。大量基礎(chǔ)和臨床研究證明,益生菌是根除H.pylori和減少藥物副作用的替代或輔助治療方法[7]。后生元是對(duì)宿主健康有益的無(wú)生命微生物或其成分[8]。研究表明,后生元具有調(diào)節(jié)免疫、抗炎、抗氧化和抗癌等作用,使用后生元來(lái)治療和預(yù)防疾病是一種新穎、有效的策略[9]。在益生菌根除H.pylori的報(bào)道中,有研究表明來(lái)自于益生菌的后生元發(fā)揮了重要的抗H.pylori作用[10]。同時(shí),相比于益生菌,后生元作為非活成分,對(duì)人體具有更高的安全性[11]。使用后生元根除H.pylori感染可能是一種非常好的H.pylori治療方案。

卷曲乳桿菌CCFM1118已經(jīng)被證實(shí)具有緩解H.pylori感染的作用[12],本研究對(duì)來(lái)自卷曲乳桿菌CCFM1118的后生元——1118-Inactivated Bacteria(CCFM1118-IB)進(jìn)行體外及臨床測(cè)評(píng),評(píng)價(jià)其對(duì)H.pylori感染的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與細(xì)胞

卷曲乳桿菌CCFM1118,江南大學(xué)食品學(xué)院食品生物技術(shù)中心菌種保藏庫(kù)。細(xì)胞試驗(yàn)所采用的細(xì)胞為人胃腺癌(AGS)細(xì)胞,中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。H.pylori菌株為國(guó)際常用的H.pylori研究用菌株H.pyloriSS1。

1.1.2 主要試劑

F-12液體培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶,美國(guó)Gibco公司;苯酚紅、尿素,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司;腦心浸出液肉湯(brain-heart infusion, BHI)培養(yǎng)基、哥倫比亞血瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基,青島海博生物技術(shù)有限公司;細(xì)胞白介素-8(interleukin-8,IL-8)、IL-6和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)ELISA檢測(cè)試劑盒及無(wú)菌脫纖維綿羊血,南京森貝伽公司;PGⅠ及PGⅡ ELISA檢測(cè)試劑盒,上海酶聯(lián)生物科技有限公司;超薄瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒、細(xì)菌基因組提取試劑盒,北京天根生化科技有限公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備

EL204分析天平、FE20 pH計(jì),上海梅特勒-托利多公司;MULTISCAN GO全波長(zhǎng)多功能自動(dòng)酶標(biāo)儀、i160三氣培養(yǎng)箱,美國(guó)Thermo fisher公司;SW-CJ-1FD超凈工作臺(tái),蘇州安泰公司;GRP-9080恒溫恒濕培養(yǎng)箱、DK-8D電熱恒溫水浴鍋,上海森信公司;TOMY SX-700全自動(dòng)高壓滅菌鍋,上海鼎謙生物公司。

1.2 體外實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)菌體的制備與細(xì)胞培養(yǎng)

卷曲乳桿菌CCFM1118在MRS培養(yǎng)基中活化3代。將乳桿菌菌液離心得菌體用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。體外實(shí)驗(yàn)所用的后生元為乳桿菌菌體熱殺滅所得,熱殺滅條件65 ℃,30 min。在含有體積分?jǐn)?shù)5%胎牛血清的BHI培養(yǎng)基中培養(yǎng)H.pylor,活化3代后,將H.pylori菌液離心,得到H.pylori菌體用于后續(xù)實(shí)驗(yàn);H.pylori培養(yǎng)均是在三氣培養(yǎng)箱中按85% N2、10% CO2、5% O2(均為體積分?jǐn)?shù))及37 ℃條件培養(yǎng)。

取冷凍的AGS細(xì)胞解凍(37 ℃,1 min),解凍后用4 mL F-12完全培養(yǎng)基[V(F-12培養(yǎng)基)∶V(胎牛血清)∶V(雙抗)=89∶10∶1]重懸,1 000×g離心5 min,棄上清液,將細(xì)胞沉淀用F-12完全培養(yǎng)基重懸,37 ℃,5% CO2條件下培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞貼壁率達(dá)到80%面積比時(shí),用0.25%的胰酶消化液消化(37 ℃,5 min),按1份培養(yǎng)好的細(xì)胞均等分為3份傳代。

1.2.2 菌株共聚集能力測(cè)定

菌株共聚集實(shí)驗(yàn)參考HOLZ等[13]的方法進(jìn)行:將乳桿菌與H.pylori分別用無(wú)菌PBS洗滌2次,人工胃液重懸,調(diào)整菌體終濃度至1×109CFU/mL,取等體積乳桿菌菌懸液和H.pylori菌懸液混勻,置于37 ℃孵育2 h。同時(shí)做只有乳桿菌或只有H.pylori的對(duì)照。從最上層吸取200 μL液體,測(cè)定OD600nm。乳桿菌與H.pylori的共聚集能力的計(jì)算如公式(1)所示,相對(duì)共聚集能力為2株菌株共聚集能力之比。

(1)

1.2.3 細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)

參考張美怡等[14]的方法進(jìn)行:將AGS細(xì)胞接種于96孔板中培養(yǎng)(2×104個(gè)細(xì)胞/孔),待細(xì)胞貼壁后用無(wú)菌PBS洗滌3次,加入F-12培養(yǎng)基重懸的H.pylori菌懸液共培養(yǎng)2 h;之后再以無(wú)菌PBS洗滌3次,加入F-12培養(yǎng)基重懸的乳桿菌菌懸液共培養(yǎng),2 h后洗滌3次,加入200 μL尿素酶指示劑培養(yǎng)3 h;培養(yǎng)完成后測(cè)定體系OD550nm。

1.2.4 抑菌圈實(shí)驗(yàn)

對(duì)張美怡等[14]的方法做一定調(diào)整:取活化后的CCFM1118培養(yǎng)液,離心分離上清液及菌體沉淀,其中上清液再以0.22 μm的無(wú)菌濾膜過(guò)濾備用。將活化后的H.pylori菌懸液濃度調(diào)整為108CFU/mL,取100 μL涂布在含有體積分?jǐn)?shù)7.5%無(wú)菌脫纖維綿羊血的哥倫比亞血平板上,放上并輕壓牛津杯,加入150 μL乳桿菌發(fā)酵上清液,以MRS培養(yǎng)基為陰性對(duì)照,培養(yǎng)96 h,測(cè)定抑菌圈直徑。同時(shí)取離心后的乳桿菌沉淀,生理鹽水重懸(菌體濃度為109CFU/mL),熱殺滅,以上清液相同的方式做菌體抑菌效果,生理鹽水為對(duì)照。實(shí)驗(yàn)以一株具有抑制H.pylori生長(zhǎng)效果的益生菌鼠李糖乳桿菌GG(LactobacillusrhamnosusGG,LGG)為陽(yáng)性對(duì)照[14]。

1.3 臨床試驗(yàn)

1.3.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及干預(yù)

本研究的臨床試驗(yàn)于上海長(zhǎng)海醫(yī)院進(jìn)行,臨床倫理批號(hào)CHEC2021-099,所有受試者均在研究開(kāi)始前已簽署知情同意書(shū)。招募人員為入組一個(gè)月內(nèi)(實(shí)驗(yàn)正式開(kāi)始前)經(jīng)過(guò)13C尿素呼氣實(shí)驗(yàn)(urea breath test,UBT)診斷為H.pylori感染,且未進(jìn)行過(guò)H.pylori根除治療的患者。受試者不可存在其他胃腸道疾病且參與期間不服用益生菌相關(guān)食品。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為雙盲型、隨機(jī)對(duì)照實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)共招募符合條件的受試者55名,通過(guò)計(jì)算機(jī)產(chǎn)生的隨機(jī)數(shù)字序列隨機(jī)分為2組,益生菌服用組35人,安慰劑組20人。

本研究所使用的益生菌菌粉產(chǎn)品規(guī)格為2 g每袋,其中卷曲乳桿菌CCFM1118為滅活菌,菌數(shù)為5×109CFU/袋;益生菌服用方式為溫水(水溫≤37 ℃)沖服,1條/次,2次/d,干預(yù)30 d。安慰劑采用麥芽糊精。

1.3.2 樣品采集與檢測(cè)

入組受試者在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前一天登記及結(jié)束后一天復(fù)查。在登記及復(fù)查時(shí),由長(zhǎng)海醫(yī)院相關(guān)人員對(duì)受試者進(jìn)行13C-UBT檢測(cè),并采集受試者血清、糞便樣本。

1.3.2.113C-UBT呼氣值分析

中國(guó)文化倡導(dǎo)知恩圖報(bào)為美德。受各種因素影響，特別是受傳統(tǒng)文化制約，和男性相比，女性成長(zhǎng)、成才除需自身特別努力外，更離不開(kāi)家庭培養(yǎng)和家人的特別關(guān)懷，甚至是親人的巨大付出與犧牲。因而，知恩圖報(bào)觀念對(duì)中國(guó)女性，特別是女官員、女干部、女領(lǐng)導(dǎo)的影響尤甚。

分析益生菌產(chǎn)品干預(yù)前后的呼氣值變化,超基準(zhǔn)值(delta over baseline,DOB)、降低率的計(jì)算如公式(2)、公式(3)所示:

變化值(ΔDOB)=受試后呼氣值-受試前呼氣值

(2)

(3)

1.3.2.2 血清生化指標(biāo)及細(xì)胞因子的檢測(cè)

血清樣品用于測(cè)定IL-6、IL-8、TNF-α、PGⅠ及PGⅡ,檢測(cè)方法參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。同時(shí)取80 μL血清加入120 μL無(wú)菌生理鹽水稀釋2.5倍,由BS-480全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase,AST)、C反應(yīng)蛋白、堿性磷酸酶及谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase,ALT)的酶活力或水平。

1.3.2.3 腸道菌群測(cè)定

菌群測(cè)序方法參考張華月[15]的方法:稱取糞便樣品,按試劑盒說(shuō)明書(shū)方法提取糞便中細(xì)菌總DNA并進(jìn)行16S rDNA的V3～V4區(qū)擴(kuò)增。00分離擴(kuò)增產(chǎn)物并回收、純化。測(cè)量樣品的DNA濃度,等量混合,構(gòu)建文庫(kù),利用Illumina Miseq進(jìn)行高通量測(cè)序。使用QIIME 2分析下機(jī)數(shù)據(jù)。根據(jù)DADA2法去噪去嵌合,利用最小樣品深度計(jì)算樣品多樣性,并對(duì)樣品中的物種進(jìn)行分類注釋。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 26.0和GraphPad Prism 9.5進(jìn)行分析,計(jì)量數(shù)據(jù)表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差”,采用單因素方差分析(One-way ANOVA)或者t檢驗(yàn)進(jìn)行差異性比較,采用GraphPad Prism 9.5繪圖。*、**、***及****分別代表P小于0.05、0.01、0.001及0.000 1。

2 結(jié)果與分析

2.1 體外實(shí)驗(yàn)測(cè)評(píng)

2.1.1 CCFM1118-IB與H.pylori之間的共聚集

本項(xiàng)實(shí)驗(yàn)采用一具有抗幽門功效的益生菌菌株羅伊氏乳桿菌DSM17648[13, 16](死菌)作為陽(yáng)性對(duì)照,以其共聚集能力為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行菌株共聚集能力評(píng)價(jià),結(jié)果如圖1-a。卷曲乳桿菌CCFM1118活菌、CCFM1118-IB與羅伊氏乳桿菌DSM17648的H.pylori共聚集能力存在顯著差異,CCFM1118-IB的共聚集能力為DSM17648的45%左右;并且卷曲乳桿菌CCFM1118與1118-IB相比較,兩者的H.pylori共聚集能力并無(wú)顯著差異。結(jié)果表明,卷曲乳桿菌CCFM1118與1118-IB具備一定的與H.pylori共聚集的能力。

a-CCFM1118-IB與H.pylori的共聚集能力;b-CCFM1118-IB干預(yù)對(duì)H.pylori細(xì)胞黏附能力的影響

2.1.2 CCFM1118-IB對(duì)H.pylori黏附AGS細(xì)胞的影響

2.1.3 CCFM1118-IB對(duì)H.pylori的生長(zhǎng)抑制作用

取菌株發(fā)酵上清液及CCFM1118-IB分別進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。發(fā)酵上清液抑菌圈直徑達(dá)13.63 mm,抑菌效果明顯;CCFM1118-IB同樣出現(xiàn)了抑菌圈,但是與上清液相比,抑菌圈較小,抑菌圈直徑在12.25 mm左右。結(jié)果表明,CCFM1118-IB對(duì)H.pylori具有生長(zhǎng)抑制作用。

表1 CCFM1118-IB對(duì)幽門螺桿菌的抑菌效果Table 1 Bacteriostatic effect of CCFM1118-IB against Helicobacter pylori

2.2 臨床試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 CCFM1118-IB對(duì)受試者H.pylori定殖量的影響

本實(shí)驗(yàn)共招募55人,排除失聯(lián)、未按要求完成實(shí)驗(yàn)者,最終40人符合要求。以符合要求的40名感染者的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,結(jié)果如表2、圖2所示。安慰劑組(Placebo)12個(gè)人中在干預(yù)前后均為H.pylori陽(yáng)性,4人存在DOB值降低的情況(比例33.33%)。CCFM1118-IB組中,28個(gè)人中有2個(gè)人轉(zhuǎn)為H.pylori陰性,19人存在DOB值降低的情況,降低率67.86%,顯著高于安慰劑組。進(jìn)一步分析患者DOB值的變化情況,發(fā)現(xiàn),盡管安慰劑組存在降低的情況,但是降低數(shù)值并不是很高,相反,CCFM1118-IB受試組的DOB值降低較為明顯。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,CCFM1118-IB可降低H.pylori感染者體內(nèi)H.pylori的載量。

表2 CCFM1118-IB對(duì)幽門螺桿菌的根除作用Table 2 Effectiveness of CCFM1118-IB in the eradication of H. pylori

a-尿素呼氣試驗(yàn)呼氣值變化值;b-尿素呼氣試驗(yàn)呼氣值變化率

2.2.2 CCFM1118-IB對(duì)受試者血清PG的影響

PG可以在一定程度上反映胃黏膜的情況,CCFM1118-IB干預(yù)對(duì)患者血清PG的影響結(jié)果如表3所示。

表3 CCFM1118-IB對(duì)幽門螺桿菌感染者血清PG的影響Table 3 Effect of CCFM1118-IB on serum PG in patients with H. pylori

在本研究中,各組治療前PG的基線水平無(wú)顯著差異。受試者食用一個(gè)月的益生菌產(chǎn)品后,CCFM1118-IB干預(yù)組受試前后PGⅠ/PGⅡ比值并無(wú)顯著差異,但安慰劑組受試前后的PGⅠ/PGⅡ比值卻顯著下降。

2.2.3 CCFM1118-IB對(duì)受試者血清細(xì)胞因子水平的影響

CCFM1118-IB對(duì)H.pylori感染者血清炎癥因子的影響如表4所示。治療前,兩組的IL-8、IL-6及TNF-α血清含量均在相似的水平,組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CCFM1118-IB干預(yù)一個(gè)月后,無(wú)論是干預(yù)前后對(duì)比還是CCFM1118-IB干預(yù)組與安慰劑組相比,各組間均不存在顯著差異。

表4 CCFM1118-IB對(duì)幽門螺桿菌感染者血清細(xì)胞因子的影響 單位:ng/L

2.2.4 CCFM1118-IB對(duì)受試者部分血清生化指標(biāo)的影響

血清生化是反映機(jī)體狀態(tài)的一項(xiàng)基礎(chǔ)指標(biāo)。本研究分析了受試者部分血清生化指標(biāo),結(jié)果見(jiàn)表5。無(wú)論是干預(yù)前后還是CCFM1118-IB干預(yù)與否,H.pylori感染者的各項(xiàng)血清生化指標(biāo)均未發(fā)生顯著變化。

表5 CCFM1118-IB對(duì)幽門螺桿菌感染者血清生化的影響Table 5 Effect of CCFM1118-IB on blood biochemistry in patients with H. pylori

2.2.5 CCFM1118-IB對(duì)受試者腸道菌群的影響

腸道微生物對(duì)維持健康具有重要作用。本研究分析了CCFM1118-IB對(duì)患者腸道菌群的影響。本研究以Shannon指數(shù)、Chao1指數(shù)及Pielou指數(shù)來(lái)表征CCFM1118-IB干預(yù)后受試者腸道菌群的α多樣性,以主坐標(biāo)分析(principal co-ordinates analysis,PCoA)來(lái)表征β多樣性,結(jié)果如圖3-a、圖3-b所示。CCFM1118-IB干預(yù)并沒(méi)有對(duì)H.pylori感染者的腸道菌群多樣性造成顯著的影響。門水平上,2組的主要菌門均為厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)及變形菌門(Proteobacteria)(圖3-c),且2組的菌群在門水平上沒(méi)有顯著差異(P>0.05,圖3-d)。在屬水平上進(jìn)一步分析兩組的腸道菌群,發(fā)現(xiàn)安慰劑組與CCFM1118-IB組的腸道菌群都以經(jīng)黏液真桿菌屬(Blautia)、糞腸桿菌屬(Faecalibacterium)、真桿菌屬(Eubacterium)及雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)為優(yōu)勢(shì)菌屬(圖4-a);通過(guò)線性判別分析(linear discriminant analysis effect size,LEfSe)發(fā)現(xiàn)(LDA評(píng)分≥3.0,P<0.05),兩組間一共有11個(gè)顯著差異屬,其中Bacteroides、RuminococcaceaeUCG-002及Clostridiumsensustricto1在CCFM1118-IB組為優(yōu)勢(shì)屬,而B(niǎo)acillus、Catenibacterium、Holdemanella、Gemella、Tyzzerella4、Vagococcus及Granulicatella則對(duì)安慰劑組具有顯著影響(圖4-b、圖4-c)。

a-菌群的α多樣性表示,分別為Shannon指數(shù)、Chao 1指數(shù)及Pielou指數(shù);b-菌群的β多樣性表示,PCoA圖;c-菌群的門水平豐度柱狀圖;d-兩組間的門水平差異

同時(shí),本研究對(duì)腸道菌群進(jìn)行了PICRUSt2功能預(yù)測(cè)。通過(guò)LEfSe分析發(fā)現(xiàn),有9條KEGG通路在CCFM1118干預(yù)前后發(fā)生了顯著變化(圖5,LDA評(píng)分≥2,P<0.05)。在這些變化的通路中,安慰劑組主要涉及蔗糖降解、磷壁酸的生物合成、葡萄球菌肽聚糖生物合成及乳糖和半乳糖降解通路,而CCFM1118-IB主要涉及戊二酰CoA的降解、丙酮酸發(fā)酵成丙酸、硫酸軟骨素降解(細(xì)菌類)、不完全還原的三羧酸循環(huán)及丙酮酸發(fā)酵成丙酮的通路。

圖5 CCFM1118-IB對(duì)幽門螺桿菌感染者腸道菌群功能的影響Fig.5 Effect of CCFM1118-IB on gut microbiota function of patients with H. pylori

3 結(jié)論與討論

本研究分析了卷曲乳桿菌CCFM1118制備的后生元CCFM1118-IB對(duì)H.pylori感染的緩解作用。研究的臨床結(jié)果顯示,盡管CCFM1118-IB不能有效的促進(jìn)H.pylori感染者轉(zhuǎn)陰,但是CCFM1118-IB展現(xiàn)出了良好的降低H.pylori感染者體內(nèi)的H.pylori載量的作用,具備緩解H.pylori感染的功效。

益生菌具有緩解H.pylori感染的作用已被大量的研究報(bào)道所證實(shí)。益生菌改善H.pylori感染的潛在作用機(jī)制主要包括以下3方面:1)益生菌有助于增強(qiáng)胃部的屏障效應(yīng)而抵御H.pylori感染[17]。2)益生菌可以分泌抗菌物質(zhì)抑制H.pylori生長(zhǎng),如乳酸、短鏈脂肪酸(short-chain fatty acid,SCFA)和細(xì)菌素[18]。3)益生菌可干擾H.pylori的定殖[7]。研究分析了CCFM1118-IB緩解H.pylori感染的作用機(jī)制。分析CCFM1118-IB對(duì)H.pylori定殖的影響,發(fā)現(xiàn)CCFM1118-IB具備與H.pylori共聚集的能力,但不具備抑制H.pylori與AGS細(xì)胞黏附的能力。H.pylori在胃黏膜細(xì)胞上的黏附需要受體,一旦乳桿菌優(yōu)先結(jié)合這些受體(如黏蛋白、糖蛋白或糖脂等),H.pylori的定殖就將受到很大的阻礙;而結(jié)合黏附受體一般需要活菌來(lái)發(fā)揮作用,CCFM1118-IB作為滅活菌體,可能無(wú)法與黏附受體結(jié)合而不具備抑制黏附的作用。H.pylori最初進(jìn)入體內(nèi)時(shí)是具有活性的游離狀態(tài),依靠自身的鞭毛在胃黏膜表面進(jìn)行游動(dòng),如果在該階段補(bǔ)充具有聚集H.pylori能力的益生菌,則可以對(duì)H.pylori進(jìn)行精準(zhǔn)的“捕捉”并形成可以排出體外的聚集體,從而可達(dá)到降低H.pylori感染的目的。共聚集作用主要與菌體上的物質(zhì)相關(guān),如細(xì)胞壁所含有的磷壁酸、蛋白質(zhì)等[19];且熱處理只會(huì)降低菌株之間的共聚集,不會(huì)使共聚集效果完全消失[20]。本研究所使用的CCFM1118-IB為65 ℃處理,處理后的共聚集能力并未發(fā)生顯著變化。此外,本研究也分析了卷曲乳桿菌CCFM1118相關(guān)的抑菌效果,發(fā)現(xiàn)CCFM1118發(fā)酵上清液及CCFM1118-IB均可以抑制H.pylori的生長(zhǎng),但是CCFM1118-IB的抑菌效果相對(duì)較弱。這個(gè)現(xiàn)象表明,卷曲乳桿菌CCFM1118可能代謝產(chǎn)生有機(jī)酸、細(xì)菌素等物質(zhì)而對(duì)H.pylori產(chǎn)生生長(zhǎng)抑制作用;而CCFM1118-IB是僅剩余了死菌體的混合物,其中可能包含了細(xì)菌素之類的物質(zhì)而具有抑制H.pylori生長(zhǎng)的作用。

本研究的臨床試驗(yàn)分析了H.pylori感染者的血清PG變化。PG由泌酸腺的細(xì)胞合成,胃黏膜分泌的PG是血清PG的唯一來(lái)源。胃部的不同病變階段血清PG含量不同,故PG可以反映胃黏膜分泌功能的強(qiáng)弱及胃底和胃體的黏膜狀態(tài)。臨床數(shù)據(jù)顯示,H.pylori感染的胃炎患者PGⅠ和PGⅡ在黏膜免疫的情況下升高,而PGⅡ升高更多,故PGⅠ/PGⅡ的比值會(huì)下降。本研究的結(jié)果顯示,在不加干預(yù)的情況下,患者的PGⅠ/PGⅡ出現(xiàn)下降,但CCFM1118-IB干預(yù)則會(huì)阻止PGⅠ/PGⅡ下降。這表明,如果不加干預(yù),H.pylori可能會(huì)持續(xù)損傷感染者的胃黏膜,而CCFM1118-IB干預(yù)可緩解這種損傷作用。

除了以上闡述的非免疫作用外,一些益生菌還可以減少H.pylori感染引起的宿主炎癥反應(yīng)[21]。H.pylori感染后定殖在胃部,其會(huì)通過(guò)毒力因子釋放細(xì)胞毒素刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng),IL-8和TNF-α等炎癥因子則在H.pylori相關(guān)的胃炎的發(fā)展進(jìn)程中起到了十分重要的作用。益生菌可以抑制促炎因子的表達(dá),改善胃中的炎癥反應(yīng)。在本研究中,CCFM1118-IB干預(yù)并沒(méi)有顯著影響H.pylori感染者的血清IL-6、IL-8及TNF-α水平。證明CCFM1118-IB可能并不具備緩解H.pylori誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的作用。本研究也發(fā)現(xiàn),在CCFM1118-IB的干預(yù)下,感染者的生化指標(biāo)并沒(méi)有顯著的差異,這表明CCFM1118-IB不會(huì)影響受試者的基本生理狀況。

腸道菌群是人體的一個(gè)重要組成部分,其可能受到各種因素的影響,包括宿主生活方式、抗生素的使用和H.pylori感染等[22]。研究證明,H.pylori的感染和根除與腸道微生物之間存在相互作用,并影響相關(guān)疾病的發(fā)生、發(fā)展,如H.pylori感染和根除治療都可能導(dǎo)致腸道微生物群紊亂,從而促進(jìn)胃癌和腫瘤的發(fā)生[23]。本研究發(fā)現(xiàn),CCFM1118-IB干預(yù)后患者的腸道菌群多樣性并沒(méi)有發(fā)生顯著變化。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),CCFM1118-IB干預(yù)組與安慰劑組的腸道菌群在門水平上不存在顯著差異。這些結(jié)果表明,CCFM1118-IB根除H.pylori不會(huì)顯著干擾腸道微生物的組成和結(jié)構(gòu),這也與其他研究的結(jié)果一致[24]。與抗生素治療相比,益生菌產(chǎn)品治療H.pylori感染一個(gè)突出的優(yōu)點(diǎn)是可以避免腸道菌群的損傷、減少治療副作用,本研究的臨床結(jié)果也反映出了這一點(diǎn)——CCFM1118-IB在干預(yù)過(guò)程中沒(méi)有對(duì)腸道菌群造成過(guò)大的損傷,從而可能避免了腸道菌群波動(dòng)過(guò)大而帶來(lái)的副作用。盡管腸道菌群多樣性沒(méi)有顯著的變化,但是CCFM1118-IB還是改變了一些腸道菌群菌屬的豐度。FROST等[25]發(fā)現(xiàn),H.pylori感染者和對(duì)照組之間,部分腸道微生物的相對(duì)豐度存在差異,如擬桿菌屬。在本研究中,擬桿菌屬的豐度在CCFM1118-IB干預(yù)組有所提高,證明了CCFM1118-IB可能逆轉(zhuǎn)了H.pylori造成的擬桿菌屬減少。擬桿菌是人體腸道中SCFAs的主要產(chǎn)生者,其產(chǎn)生的乙酸、丙酸等SCFAs對(duì)維持腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài)具有重要作用。CCFM1118-IB的干預(yù)也顯著改變了瘤胃球菌科的一個(gè)菌屬(RuminococcaceaeUCG-002)的相對(duì)豐度;瘤胃球菌科是一種重要的丁酸產(chǎn)生菌家族,丁酸鹽則在維持腸道內(nèi)環(huán)境平衡方面具有核心作用。這表明,CCFM1118-IB可能通過(guò)調(diào)控腸道菌群來(lái)調(diào)節(jié)腸道中SCFAs的產(chǎn)生,進(jìn)而產(chǎn)生不同的益生作用。這也得到了PICRUSt2功能預(yù)測(cè)分析結(jié)果的證明。功能預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn),CCFM1118-IB干預(yù)顯著增強(qiáng)了丙酮酸發(fā)酵成丙酸這一代謝通路,表明CCFM1118-IB可能會(huì)影響腸道中SCFAs的產(chǎn)生。本研究的結(jié)果表明,CCFM1118-IB可能會(huì)調(diào)節(jié)腸道菌群中的某些菌屬、菌科并影響腸道菌的代謝進(jìn)而對(duì)H.pylori感染產(chǎn)生作用。

本研究證實(shí),來(lái)自卷曲乳桿菌CCFM1118的后生元CCFM1118-IB具備與H.pylori形成聚集體、抑制H.pylori生長(zhǎng)的能力,但是無(wú)法抑制H.pylori對(duì)細(xì)胞的黏附。通過(guò)臨床研究進(jìn)一步分析CCFM1118-IB在H.pylori感染上的作用,發(fā)現(xiàn)CCFM1118-IB可以降低患者的H.pylori載量、減輕H.pylori對(duì)胃黏膜的損傷,并且CCFM1118-IB可能通過(guò)調(diào)節(jié)特定腸道菌、影響腸道菌的代謝來(lái)對(duì)H.pylori感染產(chǎn)生有益作用;而且在具備緩解H.pylori感染作用的同時(shí),CCFM1118-IB并不會(huì)顯著影響患者的正常生理狀況及腸道菌群多樣性。本研究的發(fā)現(xiàn)可以為卷曲乳桿菌CCFM1118的應(yīng)用及H.pylori的益生菌治療提供一定的理論指導(dǎo)。