生鮮乳中黃曲霉M1膠體金法的推廣研究

文│杜春雷 （河北省張家口市農產品質量安全監督檢驗中心）

一、黃曲霉毒素

黃曲霉毒素（Aflatoxin）是一類結構包括二呋喃環和香豆素的化合物。黃曲霉毒素可以在長波紫外光照射下產生熒光反應，依據其熒光顏色、RF值高低及化學結構的不同，分別命名為B1、B2、G1、G2、M1、M2、P1、R1、GM和毒醇。

黃曲霉毒素M1（Aflatoxin M1，AFM1）是一類哺乳動物因采食黃曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFB1）后在其機體內羥基化產生的有毒代謝轉化產物，世界衛生組織（WHO）已將其列為ⅡB類致癌物。黃曲霉毒素M1進入人體或其他哺乳動物有機體內后顯著抑制肝組織蛋白質的正常合成，導致肝中毒，表現為損害肝組織；致癌、致畸、致突變，引發多種肝病，進一步誘發肝癌等，毒性是砒霜毒性的近70倍。

生鮮乳中黃曲霉毒素超標，一是產品長期儲存方法不當，或原料、產品在二次加工、運輸儲存過程中受到污染所致；二是養殖戶把那些長了霉菌的糧谷當作動物的飼料，其中會含有極大量的黃曲霉毒素，這些毒素會在24小時后代謝富集轉移到奶中。黃曲霉毒素被哺乳動物直接采食后，一部分會殘留在動物體內，另一部分會釋放到哺乳動物的乳汁和尿液中。

黃曲霉毒素M1一旦形成難以消除，因為黃曲霉毒素M1對光熱和酸特別穩定，裂解溫度將近300℃，生鮮乳常見的消毒方式均不能將其完全消除。

目前，世界已有很多國家，包括亞洲、歐洲等均對黃曲霉毒素M1的含量制定了嚴格的國家國際限量指標。我國發布的國標《食品中真菌毒素限量》（GB 2761-2017）中明確規定黃曲霉毒素M1在乳及乳制品中的殘留限量為0.5微克/千克。

二、相關檢測技術

黃曲霉毒素的檢測方法一般分為兩類：一類是基于氣相色譜或液相色譜分離技術的各種物理化學分析方法，包括薄層層析法（TLC）、高壓液相色譜法（HPLC）、液相色譜-聯用質譜檢測法（LC-MS）；另一類是免疫化學分析檢測方法，包括酶聯免疫吸附法（ELISA）、膠體金法。

1.薄層層析法（TLC）。薄層層析法（TLC）是一項最初用來測定黃曲霉毒素的試驗方法，基本原理是將待測樣品提取、層析、洗脫、濃縮和分離，然后在波長365納米的紫外光下產生特殊熒光，最終即可計算出黃曲霉毒素的含量，如GB 5009.22-2016的第五法薄層色譜法，檢出限5微克/千克，但存在靈敏度低、污染大、干擾因素多等缺點，更多用于黃曲霉毒素樣品的初步篩查和定性判斷。

2.液相色譜法（HPLC）。液相色譜法（HPLC）的基本原理是樣品中多種化合物在色譜柱的流動相和固定相之間有不同程度的吸附，從而實現目標物的分離。再通過柱后電化學衍生作用后釋放產生特征熒光，通過紫外熒光檢測器檢測進行定性和定量。具有高分辨率、分析時間較短等優點，如GB 5009.22-2016的第三代高效液相色譜-柱后衍生法，檢出限0.003～0.03微克/千克，但需要昂貴的儀器設備，較高的分析技術。

3.液相色譜-聯用質譜法（LCMS）。液相色譜-聯用質譜法（LCMS）基本原理是將待測樣品中的M1和M2用甲醇-水溶液進行提取，再用水或磷酸鹽緩沖液進行稀釋，經過免疫親和柱凈化，氮吹濃縮、用流動相定容和過針式濾膜后上液相色譜分離，質譜儀進行分析檢測，內標法定量。液相色譜-聯用質譜法（LCMS）具有前處理操作簡單、檢測速度快、靈敏度響應高，能滿足大批量樣品檢測等優點，但對檢測儀器和操作人員的技術要求較高。

4.酶聯免疫吸附法（ELISA）。

酶聯免疫法（ELISA）是抗原（或抗體）吸附劑和用酶標記的抗體（或抗原）與標本中的目標物發生特異的免疫學結合反應，通過測定相應酶活力的方法進行定性或定量的技術方法。主要包括雙抗體夾心法和競爭法兩種試驗方法。酶聯免疫吸附法具有所用試劑少、操作簡便、快捷，如GB 5009.22-2016中第五法酶聯免疫吸附篩查法，檢出限1微克/千克，具有適合大批量樣品篩查的主要優點。

5.膠體金法。膠體金法基于競爭免疫技術，將待測樣品提取液滴加到速測卡的樣品孔中，提取液中的M1和速測卡上的抗體結合產生復合抗體化合物，如果提取液中M1濃度比檢測靈敏度低，沒有結合的抗體會轉移到T區，被膜上相應的抗原捕獲，形成一條肉眼可見的T線；如果提取液中M1濃度比檢測靈敏度高，抗體就不會和T線處的抗原結合，T線自然就消失不見。C線是一條質控線，出現才能證明速測卡的有效性。該方法方便快捷，特別適合現場快速檢測。

孫翠萍等用膠體金標記黃曲霉毒素M1抗體，獲得了一種靈敏度為0.3納克/毫克的膠體金免疫標記快速檢測試紙條，檢測時間僅需l0分鐘，并對10份牛奶樣品進行了黃曲霉毒素M1檢測，其檢測值與ELISA（酶聯免疫吸附測定）檢測值一致，表明在黃曲霉毒素M1快速現場篩中是一種不錯的選擇。

三、膠體金法檢測生鮮乳中黃曲霉M1在張家口地區的推廣

1.張家口地區奶業現狀。張家口市位于內蒙古高原的最南端，北方農牧交錯帶，總面積3.7萬余平方千米，飼草資源較為豐富，畜牧家禽養殖歷史悠久，2003年被農業農村部列為全國7個奶業發展優勢產業帶，發展成為河北省四大奶牛優勢產區之一。特別是近幾年在市委、市政府正確領導下，畜牧養殖業已成為張家口市調整農業產業結構、轉變經濟增長方式和增加農民收入的主導產業。至2021年底，年內存欄26.59萬頭，生鮮乳產量121萬噸，存欄和奶產量位居全省第二。全市有蒙牛、伊利、君樂寶、長城乳業等乳品加工企業11家，年實際處理生鮮乳95.2萬噸左右。

2023年作為張家口市奶業振興的關鍵之年，全市奶業振興的總體思路是以習近平新時代中國特色社會主義思想為指導，全面貫徹落實中央、省關于畜牧業發展的決策部署，以奶產業建設為主線，立足“首都兩區”功能定位，圍繞以水定產、以水定畜總要求，以鄉村振興戰略為統領，以特色農牧產業發展為依托，應變局、開新局，堅持穩中求進、整鏈推進，強化利益聯結、引導乳品消費，建設百億級奶業工程，提升全產業鏈競爭力，全市奶牛存欄、生鮮乳產量、乳制品產量分別達到29萬頭、116萬噸和77萬噸，奶業全產業鏈產值105億元，為群眾乳制品消費和鄉村振興提供保障和支撐。

眾多優勢使張家口乳業前景十分樂觀，但鮮奶質量安全問題依舊是重中之重。目前張家口生鮮乳由于受養殖加工方式落后、科學技術投入較少等因素的影響，質量安全令人擔憂。同時張家口市缺少大氣、水源、土壤等環境監測，不能更全面地保證農業及產品的環境和質量安全。

2.采用膠體金法檢測的必要性。現場快速檢測技術是保障乳制品質量安全的核心手段。現有各種大型儀器檢測技術卻因為操作過程復雜、需要昂貴精密儀器和專業分析技術人員難以滿足現場快速檢測的需求，各檢測方法對比詳見表1。

表1 檢測方法對比表

薄層色譜法的操作過程煩瑣、污染干擾大、耗時較長；液相色譜法和液相質譜法結果雖然可靠準確，但前處理過程復雜，需要大型精密儀器，對人員操作和分析要求較高；酶聯免疫法用時較短，但也需要酶標儀和操作熟練的技術人員，同樣不適合現場快速檢測；膠體金法檢測時間短、操作過程簡單、無需其他儀器設備、結果直觀容易判別，完美滿足現場快速檢測的要求。

在張家口市各縣區推廣生鮮乳中黃曲霉M1快速篩查膠體金法，涉及現代牧場、規模養殖場、奶農專業合作社和乳品加工企業15家以上，覆蓋奶牛3萬頭以上，在生產運輸環節進行生鮮乳抽樣檢測，并形成完善的養殖、抽樣檔案記錄，生鮮乳抽樣檢測覆蓋在1萬噸以上。采用此方法的生產主體可節省較大的時間、人力、物力成本。主要表現在以下幾個方面。

（1）經濟效益。與實驗室檢測相比，企業、養殖主體采用膠體金免疫層析法可節省實驗室高效液相色譜儀采購費用約40萬元，每批次檢測可節省成本約3000元。膠體金免疫層析法對溫度環境容忍度較高，相比一般快速檢測手段可節省便攜冷藏設備約2000元。

（2）生產效益。與實驗室液相色譜法相比，膠體金免疫層析法操作簡單，可極大降低檢測技術人員的培訓成本，每批次檢測時間從2小時壓縮至10分鐘左右，極大提升了生產、存儲、運輸各環節的流通效率。

（3）社會效益。膠體金免疫層析法成本低、靈敏度高、反應快速，依托對該方法的研究與總結，對保障生鮮乳和乳制品的質量安全以及消費者健康安全具有非常重大的意義。

四、結語

生鮮乳作為一種保鮮期短，不宜長途運輸的食品，建立生鮮乳和乳制品中黃曲霉毒素M1快速檢測技術，推廣膠體金法對保障生鮮乳、乳制品的質量安全和消費者的健康安全具有非常重大的意義。膠體金法具有靈敏快速、操作過程簡單、不需要使用其他試劑和大型精密儀器等多個優點，大大提高了現場檢測效率，滿足現場對快速準確檢測的需求。現場快速檢測可以作為行政執法依據，還可以提高行政監管的效率和力度。對發現檢測超標有問題的樣品進一步送往實驗室進行復檢，達到提高檢測檢驗和監督執法的效率，實現現場快速檢測與實驗室精準檢測的高效互補，對保障生鮮乳的質量安全極為重要。