高效液相色譜法測定β-內酰胺抗生素中殘留乙酸的含量

馮艷春?裴文莉?王晨?朱俐?田冶?崇小萌?宋暤昀?姚尚辰?寧保明

摘要：目的 建立測定β-內酰胺類抗生素原料中乙酸殘留量的HPLC方法。方法 采用多因素組內設計方法，確定色譜流動相的組成、比例和pH值。參考ICH Q2，從專屬性、檢出限和定量限、線性、準確度、精密度和耐用性等6個方面對方法進行驗證。用所建立的方法對19種β-內酰胺類抗生素原料進行了測定。結果 采用C18色譜柱，流動相：甲醇-0.02 mol/L磷酸二氫鉀，梯度洗脫；柱溫25 ℃；檢測波長220 nm。供試品、溶劑和流動相對乙酸測定沒有明顯干擾；乙酸的最低檢出限約為0.029 μg，

最低定量限約0.12 μg；從定量限到限度2倍濃度范圍內，方法的線性關系良好，擬合直線方程為y=388866.7186x-177.5720，r2=0.9999；低中高濃度加樣回收率平均分別為93%，96%和99%；方法的重復性和中間精密度分別為2.37%和2.11%；在3根不同C18色譜柱上的耐用性良好。19種β-內酰胺抗生素原料中有3種篩查出殘留乙酸。結論 所建方法可以實現對β-內酰胺類抗生素原料中殘留乙酸的準確定量，為該類原料的生產過程控制和標準物質研制提供了依據。

關鍵詞：β-內酰胺類抗生素；原料；乙酸；反相高效液相色譜法

中圖分類號：R978.1，R917 文獻標志碼：A

Determination of residual acetic acid in the raw materials of β-lactam antibiotics using high performance liquid chromatography

Feng Yanchun， Pei Wenli， Wang Chen， Zhu Li， Tian Ye， Chong Xiaomeng，?Song Haoyun， Yao Shangchen， and Ning Baoming

（National Institutes for Food and Drug Control， Beijing 102629）

Abstract Objective To establish high performance liquid chromatography （HPLC） for the determination of residual acetic acid in β-lactam raw materials. Methods? ? A multifactorial within-group design method was used to determine the composition， ratio， and pH of the chromatographic mobile phase. The established method was validated in terms of specificity， limit of detection， limit of quantification， linearity， accuracy， precision， and robustness with reference to ICH Q2. This developed method identified 19 β-lactam antibiotic raw materials. Results? ? The separation was carried out on a C18 column with the mobile phase of methanol-0.02 mol/L potassium dihydrogen phosphate solution in gradient elution; the column temperature was 25 ℃， and the detection wavelength was 220 nm. There was no obvious interference with the determination of acetic acid by the test samples， solvent， or mobile phase. The lowest detection limit of acetic acid was about 0.029 μg and the lowest limit of quantification was about 0.12 μg. The linearity of the method was good in the range of concentration from the limit of quantification to 2 times the limit concentration of acetic acid. And the fitted linear equation was y=388866.7186x-177.5720， r2=0.9999. The average recoveries of the spiked samples at low， medium， and high concentrations were 93%， 96% and 99% respectively; the repeatability and intermediate precision of the method were 2.37% and 2.11% respectively. The robustness of the method was good on the three different kinds of C18 columns. Residual acetic acid was tested in three out of the 19 β-lactam antibiotics raw materials. Conclusion? ? The proposed method could achieve accurate quantification of residual acetic acid in β-lactam raw materials， which provided a reference for process control and the content assignment of standard substances for such raw materials.

Key words β-lactam antibiotics; Raw materials; Acetic acid; RP-HPLC

β-內酰胺類抗生素是臨床中應用最為廣泛的一類抗感染藥物，占全球抗感染藥物使用量的60%[1]。按其結構特點，可細分為青霉素類、頭孢類和非典型β-內酰胺類（氧頭孢類、碳青霉烯類以及β-內酰胺酶抑制劑等）。β-內酰胺類藥物多為有機酸，難溶于水，易與堿金屬離子成鹽；成鹽后通過改善溶解性，改善其生物學特性，還利于生產中的精制純化。臨床中常見的β-內酰胺類抗生素多為鈉鹽或鉀鹽。生產過程中使用的成鹽劑主要有異辛酸鈉（鉀），乙酸鈉和乳酸鈉[2-4]等。按質量源于設計（QbD）的理念，成鹽過程中殘留的有機酸不僅影響終產品的質量[5]，更是藥品過程控制的重要依據。異辛酸鈉（鉀）作為較早使用的成鹽劑[6-9]，《中國藥典》已設置有專門的氣相色譜檢查法（通則0873）。近年來發現采用乙酸鈉作為成鹽劑，在產品質量和收率等方面明顯優于異辛酸鈉[10-12]；越來越多的生產企業選擇乙酸鈉作為成鹽劑，使得對β-內酰胺類抗生素原料中乙酸殘留量的控制越來越受到重視[13-14]。另外，殘留的乙酸作為終產品中的一個雜質，直接影響對β-內酰胺類抗生素標準物質含量的準確賦值。至今尚未見一種通用、簡便易行的可以篩查β-內酰胺類抗生素原料中乙酸殘留量的方法報道。本研究參考文獻[14-16]，建立了一種HPLC（High Performance Liquid Chromatography）測定β-內酰胺類抗生素原料中乙酸殘留量的方法，并對《中國藥典》中涉及的19種β-內酰胺鹽原料進行了篩查。

1 儀器與試藥

Waters 2695 HPLC色譜儀，Waters 2998 PAD檢測器；色譜柱：資生堂MGⅡCAPCELL PAK C18柱（4.6 mm×250 mm， 5 μm，Col. No. A4AD 22092）、菲羅門Titank C18柱（4.6 mm×250 mm， 5 μm， Ser. No.125HB00071）、月旭科技Ultimate?OAA有機酸專用柱（4.6 mm×300 mm， 5 μm， Ser. No. 60211202455， Lot No.2201.53）；數據處理軟件：Empower 3，美國Millipore milli-Q水凈化系統。賽多利斯電子天平，0.1 mg分度值。

甲醇，色譜純（Netherlands公司），LOTA0368508，乙酸鈉對照品：100735-202003（中國食品藥品檢定研究院），含量99.8%；乳酸鈉對照品：100911-202003（中國食品藥品檢定研究院），含量99.7%；磷酸二氫鉀：分析純（國藥集團化學試劑有限公司），批號20220105。本研究共收集到β-內酰胺類鉀、鈉鹽共計19個品種的原料藥，均為中國食品藥品檢定研究院留樣。

2 實驗方法

2.1 方法的建立

2.1.1 溶液的配置

《中國藥典》中乙酸的殘留限度設定為0.5%，乙酸在原料中的實際殘留量一般在較低水平。乙酸為液體，考慮到稱量方便，選擇乙酸鈉為對照品，精密稱取10 mg對照品至10 mL量瓶中，加水溶解，精密量取1 mL至50 mL量瓶，加水稀釋定容作為對照品溶液。精密稱取100 mg供試品至10 mL量瓶中，加水溶解，作為供試品溶液。進樣量為20 ul。

HPLC法分離有機酸時，乳酸與乙酸是一對較難分離物質對[15-16]。分別精密稱取10 mg乳酸鈉和乙酸鈉標準物質至50 mL量瓶，加水稀釋定容作為系統適用性溶液。

2.1.2 流動相的篩選

流動相的pH與C18色譜柱對pH的耐受性是一對制約因素。常用C18色譜柱耐受pH值的下限是2；乙酸的pKa為4.76，乳酸的pKa為3.86，從分離角度，較低的pH有利于有機酸的分離；一般認為流動相的pH值在2～2.8之間較為理想[17]。采用多因素組內設計篩選色譜流動相：設置流動相水相pH分別為2.1、2.4和2.8；同時為了得到較好的峰型效果，嘗試向水相中加入一定濃度的鹽溶液（表1），在不同因素水平下分別進樣系統適用性溶液，以乙酸峰和乳酸峰保留時間、分離度和峰型（拖尾因子）為評價指標，選擇最優組合作為流動相。

2.1.3 檢測波長的選擇

乙酸水溶液的最大紫外吸收波長在190 nm附近（圖1），但該波長一般為HPLC紫外檢測器的最低檢測波長，加之乙酸本身的濃度可能較低，采用此檢測波長易受到噪音信號的干擾，因此選擇220 nm為檢測波長。

2.1.4 洗脫條件的選擇

乙酸和乳酸的極性較大，保留時間均在4～5 min內，而β-內酰胺類抗生素多為中等極性，因此選擇梯度洗脫（表2），在10 min內實現對乙酸的有效檢出，然后通過加大甲醇比例，使得β-內酰胺類抗生素主成分約在15～20 min出峰，整體分析時間為30 min。

2.2 方法驗證

參考ICH Q2從專屬性、檢出限和定量限、線性、準確度、精密度和耐用性等6個方面進行方法的驗證。

2.2.1 專屬性

分別取系統適用性溶液、空白溶劑和供試品溶液，在確定的色譜條件下進行測定，檢查體系中是否存在干擾乙酸測定的因素。

2.2.2 檢出限和定量限

以相當于0.50 mg/mL乙酸水溶液為儲備液，逐級稀釋，測定信噪比和重復性，以確定檢出限和定量限。

2.2.3 線性

以相當于0.50 mg/mL乙酸水溶液為儲備液，精密移取一定體積的儲備液，配置成濃度分別為0.006（定量限）、0.008、0.01、0.02、0.05、0.06、0.10和0.20 mg/mL的溶液共8份，折合成乙酸在供試品中的濃度分別為0.06%、0.08%、0.10%、0.20%、0.50%、0.60%、1.00%和2.00%。檢測這些樣品，得到相應的色譜峰面積，以色譜峰面積對乙酸濃度（mg/mL）作圖，以最小二乘法擬合直線方程，求取相關系數。

2.2.4 準確度

以一批殘留有乙酸的拉氧頭孢鈉原料進行回收率實驗。精密稱取13.5 mg乙酸鈉至50 mL量瓶，加水溶解稀釋至刻度制成儲備液，約相當于乙酸0.20 mg/mL。

配制10 mg/mL的拉氧頭孢鈉供試品溶液約100 mL，分別精密移取0.5、1.5和2.5 mL的儲備液至10 mL量瓶，用拉氧頭孢鈉供試品溶液定容至刻度，制成低、中、高3個乙酸濃度的溶液（相當于乙酸在供試品中濃度分別為0.10%、0.30%和0.50%），每個濃度溶液平行制備3份，分別測定乙酸回收率。

2.2.5 精密度

平行稱取含乙酸的拉氧頭孢鈉供試品6份，測定該供試品中乙酸的殘留量，更換實驗日期和實驗人員，重復上述操作，以每人6份以及兩人12份實驗結果的相對標準偏差（relative standard deviation， RSD）來考察方法的重復性和中間精密度。

2.2.6 耐用性

將乙酸鈉對照品和供試品溶液在不同間隔時間進樣，考察溶液的穩定性。更換不同品牌的色譜柱，測定供試品中乙酸殘留量，考察方法是否耐用。

2.3 供試品測定

應用建立好的方法對收集到的19種β-內酰胺類鉀、鈉鹽產品進行乙酸的篩查。

3 實驗結果

3.1 HPLC方法的確定

多因素組內設計篩選實驗顯示，流動相的pH越高，乳酸的峰型越差，當pH達到2.8時，在所有實驗條件下乳酸均裂分為兩個峰；向水相中加入一定濃度的磷酸二氫鉀，有改善峰型的作用，且鹽濃度越高，乳酸和乙酸的峰型對稱性越好；隨著流動相中有機相比例的升高，溶質的保留時間縮短，保留時間從長到短為無有機相>1%甲醇>5%甲醇≈1%乙腈>5%乙腈。當流動相含5%的乙腈時，溶質的保留時間均小于4 min，有可能受到溶劑峰的干擾；流動相中無有機相時，色譜柱的穩定性變差；而流動相中含1%甲醇或1%乙腈時，由于有機相比例較少，易產生操作誤差；最終流動相選擇5%甲醇，用磷酸調節水相pH值至2.4。

按上述色譜條件進行系統適用性實驗（圖2），乳酸的保留時間約為4.6 min，拖尾因子約為1.5；乙酸的保留時間約為4.9 min，拖尾因子約為1.3；兩者的分離度約為2.0。

3.2 方法驗證

3.2.1 專屬性

分別取系統適用性溶液、空白溶劑水、所有供試品的水溶液，參照上述色譜條件進行測定。所有供試品主成分的出峰時間均在14～16 min；且溶劑水和所有供試品溶液在乳酸、乙酸保留時間均無色譜峰。說明水、所有供試品溶液對乙酸和乳酸的測定無干擾，專屬性良好。

3.2.2 最低檢出限和最低定量限

當乙酸的進樣量為0.029 μg時，信噪比約等于3，折合成方法中乙酸的濃度為0.001 mg/mL（相當于供試品中乙酸含量為0.01%），為方法的最低檢出限。當乙酸的進樣量為0.12 μg時，信噪比約等于10，折合成方法中乙酸的濃度為0.006 mg/mL（相當于供試品中乙酸含量為0.06%），為方法的最低定量限；連續進樣該濃度樣品6次，相對標準偏差為3.26%。

3.2.3 線性

配制從定量限到限度2倍乙酸濃度范圍的溶液共8份，以峰面積（微伏×秒）對乙酸溶液濃度（mg/mL）作圖，通過最小二乘法擬合直線方程，乙酸的濃度在0.006（定量限）-0.20 mg/mL范圍線性關系良好，y=388866.7186x-177.5720，r2=0.9999。

3.2.4 準確度

以加樣回收率來評價方法的準確性，當添加乙酸在供試品中的含量分別為0.10%，0.30%和0.50%時，回收率分別為93%（SD=3.91%），96%（SD=1.48%）和99%（SD=0.86%）。

3.2.5 精密度

測定拉氧頭孢鈉中乙酸的含量，平行配制6份樣品，同一份乙酸鈉標準溶液重復進樣6次，平均相對標準偏差為1.91%；6份樣品測定結果之間RSD為2.37%。更換實驗人員，在不同天進行同樣實驗，結果為同一份乙酸鈉標準溶液重復進樣6次，平均相對標準偏差為1.41%；6份樣品測定結果之間RSD為1.50%。兩人共12份樣品測定結果的RSD為2.11%。

3.2.6 耐用性

分別在0、6、12和16 h進樣含有乙酸殘留的拉氧頭孢鈉、舒巴坦鈉和苯唑西林鈉原料配制成的供試品溶液，考察這些原料中含有乙酸的供試品溶液隨時間的變化，結果顯示供試品溶液中乙酸色譜峰的大小在16 h內穩定性良好，峰面積RSD分別為：拉氧頭孢鈉為0.67%；舒巴坦鈉為2.77%，苯唑西林鈉為1.74%。

考察三根不同品牌C18色譜柱，具體型號詳見“儀器與試藥”部分，系統適用性溶液的分離度、峰型以及供試品含量沒有顯著差別（表3）。

3.3 供試品的測定

本研究共收集到β-內酰胺抗生素鈉（鉀）鹽原料19個品種，分別進行乙酸的篩查（表4），發現其中一批苯唑西林鈉中乙酸的含量約為1.51%，一批拉氧頭孢鈉中乙酸的含量為1.37%，遠高于《中國藥典》標準限度0.5%，另一批舒巴坦鈉中含有乙酸0.39%。另外在一批頭孢呋辛鈉原料中還檢測到微量乳酸的存在。

4 討論與結論

本文在文獻調研的基礎上，建立了可以篩查β-內酰胺類鈉、鉀鹽原料的通用HPLC方法，并對19種β-內酰胺類抗生素進行了篩查，發現3種原料中殘留有乙酸，其中兩種原料的乙酸殘留量遠高于《中國藥典》標準；另外，實驗中還在一批頭孢呋辛鈉原料中檢測到有微量乳酸的存在，提示應加強相關品種原料生產工藝的控制。

《中國藥典》2020年版共收錄β-內酰胺抗生素鈉（鉀）鹽共計5個亞類32個品種，本研究中的19個品種涵蓋了全部5個亞類，其他品種均為與該19個品種色譜行為較為接近的結構類似物[18]，因而所建立的方法有一定的代表性。不僅可用于對β-內酰胺抗生素鈉（鉀）鹽中殘留乙酸的測定，也可能用于對其中殘留乳酸的快速篩查，有關的研究在補充完善中。該方法對β-內酰胺抗生素對照品采用照質量平衡法進行準確賦值亦有重要作用。

參 考 文 獻

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作者簡介：馮艷春，女，生于1978年，研究員，主要從事化學藥品標準物質研制及質量分析工作。E-mail： fyc@nifdc.org.cn

*通信作者，E-mail： ningbm@nifdc.org.cn

第一作者：馮艷春，博士，中國食品藥品檢定研究院抗生素室研究員。主要從事化學藥品質量分析、標準物質研制以及近紅外光譜技術在藥物分析領域的應用等研究工作。工作以來，在國內外期刊發表學術論文70余篇，合作出版專著12部，參與發明專利20余項，主持或參與完成國家課題5項。

通信作者：寧保明，博士，研究員，現任中國食品藥品檢定研究院抗生素室主任。主要從事化學藥品質量研究、標準物質、緩控釋制劑體外質量與體內相關性研究、外用半固體制劑、吸入制劑質控技術研究工作。作為主要負責人或技術專家參與國家科技重大專項、仿制藥一致性評價、國家藥典委員會標準提高等科研課題十余項。發表論著和譯著20余部，論文60篇。