槐杞黃顆粒對糖尿病腎病大鼠及高糖環境下腎細胞的保護機制

王利元， 劉紅， 李晶， 白夢婷， 吳悠

（武漢市中西醫結合醫院，湖北武漢 430030）

糖尿病腎病（diabetic kidney disease，DKD）是糖尿病最重要的微血管并發癥之一，是終末期腎病（ESRD）的主要病因，伴有尿微量白蛋白分泌逐漸增加和腎小球硬化，是公認的心血管疾病的獨立危險因素[1]。盡管糖尿病患者血糖、血脂、血壓控制較好，但進展至ESRD 時，除腎臟替代治療外，目前DKD仍缺乏有效的治療手段[2]。因此，探索DKD 新的藥物或治療方法具有重要意義。槐杞黃顆粒是由槐耳菌質、枸杞子、黃精配制的中成藥，既往臨床觀察發現，其可有效改善DKD 患者尿蛋白水平[3]。前期藥理研究表明槐杞黃顆粒可通過保護腎小球足細胞、抑制腎小球系膜細胞增殖、抗腎間質纖維化、減輕腎臟炎癥反應、抗氧化應激、調控腎臟細胞凋亡及調節免疫系統功能等多種機制干預慢性腎臟病的進展[4]；但其具體作用機制尚不完全明確。因此，本研究構建DKD 大鼠模型以及對體外高糖暴露的腎細胞HK2 模型，進一步觀察槐杞黃顆粒的腎保護作用機制，以期為槐杞黃顆粒臨床應用于DKD 的治療提供理論依據。現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SPF 級4～5 周齡雄性SD 大鼠，體質量110 ～150 g，購自于北京卓凱生物技術有限公司，動物質量合格證號：SYXK（京）2021-0025。所有動物飼養在SPF 房間，溫度為（25 ±1）℃，相對濕度55% ～60%，光照/黑暗循環12 h，均可自由獲得食物和飲用水。所有涉及動物的程序均嚴格按照武漢市中西醫結合醫院動物倫理委員會批準的指導方針和方案進行（批準號：20230015）。高脂肪飼料（40 kJ/kg，脂肪含量占20%）購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司。

1.2 細胞株人近端腎小管上皮細胞（HK2），購自中國典型培養物保藏中心。以添加100 U/mL青霉素/鏈霉素混合物和10%胎牛血清的RPMI-1640 培養基，在37 ℃、5%CO2的潮濕環境中培養。

1.3 藥物、試劑與儀器槐杞黃顆粒（啟東蓋天力藥業有限公司生產，批號：國藥準字B20020074）；氯沙坦（美國MCE 公司，CAS：114798-26-4，純度：99.67%）。RPMI-1640 培養基（上海哈靈生物科技有限公司）；胎牛血清（德國Capricorn Scientific GmbH 公司）；鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）（美國Sigma公司）；尿微量白蛋白酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（上海江萊生物科技有限公司）；空腹血糖、血清肌酐、總膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇等檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所有限公司）；纖維連接蛋白（FN）抗體、Ⅳ型膠原蛋白（Col Ⅳ）抗體（美國Abcam 公司）；NOD 樣受體蛋白3（NLRP3）抗體（美國Epitomics公司）；裂解型半胱天冬酶3（cleaved-Caspase-3）抗體、白細胞介素1β（IL-1β）抗體和β-actin 抗體（美國Cell Signaling Technology 公司）；二抗包括過氧化物酶偶聯山羊抗兔和抗小鼠免疫球蛋白G（IgG）（美國Jackson ImmunoResearch Laboratory 公司）；2’，7’-二氫二氯熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）（Beyotime 公司）；聚偏氟乙烯（PVDF）膜（美國Millipore 公司）。ACCU-CHEK血糖測定儀（瑞士Roche公司）。

1.4 體內實驗

1.4.1 分組、造模與給藥 大鼠適應性喂養1 周后，隨機分為2組：正常組（10只）、造模組（63只）。造模組大鼠采用高脂肪飼料喂養結合STZ腹腔注射法構建DKD模型[5]。方法：造模組大鼠飼喂高脂肪飼料（40 kJ/kg，脂肪含量占20%）4 周，同期正常組大鼠飼喂正常顆粒飼料（20 kJ/kg，脂肪含量占5%），然后造模組大鼠單次腹腔注射30 mg/kg STZ[溶解于冰冷的檸檬酸鈉緩沖液（0.1 mol/L，pH 4.4）]，正常組大鼠注射等體積的檸檬酸鈉緩沖液。STZ 注射后第3 天，采用血糖測定儀測定大鼠尾尖空腹血糖，若血糖＞16.7 mmol/L，再結合腎組織病理結果，則判斷DKD 模型構建成功。將造模成功的大鼠隨機分為5 組，即模型組，槐杞黃顆粒低、中、高劑量組及氯沙坦組，每組10 只。槐杞黃顆粒低、中、高劑量組大鼠分別給予25、50、100 mg·kg-1·d-1槐杞黃顆粒生理鹽水混懸液灌胃，氯沙坦組以20 mg·kg-1·d-1氯沙坦生理鹽水混懸液灌胃，模型組和正常組給予等體積生理鹽水灌胃。療程均為12 周。動物劑量按成人與大鼠的體表面積換算。每2周測定一次體質量和空腹血糖。干預結束后，測定尿微量白蛋白，然后稱體質量，麻醉處死，快速采集血液、腎臟等樣本。

1.4.2 血清與尿液生化指標分析 干預結束后，收集24 h 尿液，采用ELISA 法測定尿微量白蛋白水平。采用葡萄糖氧化酶（GOD）/過氧化物酶（POD）法測定空腹血糖，采用肌氨酸氧化酶（SOX）法測定血清肌酐，甘油磷酸氧化酶（GPO）-PAP法測定血清總膽固醇，雙試劑直接法檢測血清低密度脂蛋白膽固醇。

1.4.3 腎指數 稱體質量、腎臟質量，計算腎指數，公式：腎指數（mg/g）=腎質量（mg）/體質量（g）。

1.4.4 腎組織病理學觀察 取腎臟組織，在4%多聚甲醛溶液中固定24 h，石蠟包埋，4μm 切片。采用蘇木素-伊紅（HE）染色法進行一般病理形態學分析，采用高碘酸希夫（PAS）染色法進行腎小球硬化評估，采用馬松（Masson）染色法進行膠原沉積和間質病變評估。每組隨機選取20 個腎小球，用ImageJ軟件（National Institute of Health，美國）評估腎小球中PAS陽性面積的百分比，記為系膜指數。

1.5 體外實驗

1.5.1 采用四甲基偶氮唑鹽（MTT）法測定細胞增殖能力 將細胞以4 000 個/孔接種于96 孔板中，每組設6 個平行孔。將細胞暴露于正常葡萄糖（5 mmol/L）或高糖（30 mmol/L）[6]中，每孔分別加入終濃度為10、20、40、80μmol/L 的槐杞黃顆粒培養48、72 h。加入MTT 溶液（0.5 mg/mL），37 ℃孵育4 h，應用酶標儀于570 nm 波長處測定吸光度（OD）值。

1.5.2 細胞內ROS 生成和線粒體ROS 生成的檢測 將細胞以4 000 個/孔接種于96 孔板中，每組設6 個平行孔，暴露于正常葡萄糖（5 mmol/L）或高糖（30 mmol/L）中，每孔分別加入5、10、20 μmol/L 槐杞黃顆粒孵育24 h。加入10μmol/L 的ROS 熒光探針DCFH-DA 避光培養20 min 后，應用熒光分光光度計檢測。

為了觀察線粒體ROS 生成情況，將細胞以1×105個/mL 的密度接種于直徑35 mm 培養皿的蓋玻片上。貼壁后，將細胞暴露于正常葡萄糖（5 mmol/L）或高糖（30 mmol/L）中，同時用或不用20μmol/L 槐杞黃顆粒處理24 h。同時段，甘露醇組不加槐杞黃顆粒以排除滲透壓影響：5 mmol/L葡萄糖+25 mmol/L甘露醇。進行MitoSOX（呈紅色）/Hoechst 33342（呈藍色）染色。所有實驗過程均在避光條件下進行，應用激光掃描共聚焦顯微鏡對樣品進行觀察。

1.5.3 蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測炎癥小體相關蛋白NLRP3、cleaved-Caspase-3 和IL-1β及腎纖維化相關蛋白FN 和Col Ⅳ的表達 將細胞以8×104個/孔接種在6 孔板，每組設3 個平行孔。細胞貼壁后，暴露于正常葡萄糖（5 mmol/L）或高糖（30 mmol/L）下，每孔中加入槐杞黃顆粒，最終濃度分別為5、10、20 μmol/L，培養72 h。同時段，不加槐杞黃顆粒的甘露醇組（5 mmol/L 葡萄糖+25 mmol/L 甘露醇）排除滲透影響。然后收集細胞，裂解、提取蛋白，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，并轉移到PVDF 膜上。3%牛血清白蛋白封閉，加入一抗和二抗孵育，顯色，顯影。采用ImageJ 軟件進行半定量分析。

1.6 統計方法采用GraphPad Prism 6 統計軟件進行數據分析。至少3 個獨立實驗的結果以均數±標準差 （±s）表示。2 組間比較采用Studentt檢驗（雙尾），多組間的比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 槐杞黃顆粒對DKD 大鼠尿微量白蛋白排泄、血清肌酐水平，高血糖和脂質代謝紊亂及腎臟組織病理病變的影響在槐杞黃顆粒給藥12 周結束時，檢測反映腎損傷的24 h 尿微量白蛋白排泄量和反映腎功能的血清肌酐水平。如圖1-A～B 結果所示：與正常組比較，模型組尿微量白蛋白和血清肌酐水平顯著升高（P＜0.05）；而與模型組比較，50、100 mg/kg 槐杞黃顆粒組的尿微量白蛋白和血清肌酐水平顯著降低（P＜0.05）。測定空腹血糖以評價槐杞黃顆粒對糖代謝的影響，如圖1-C 結果所示：與模型組比較，25、50 mg/kg槐杞黃顆粒組大鼠空腹血糖水平顯著降低（P＜0.05）。觀察槐杞黃顆粒對脂質代謝紊亂的調節作用，如圖1-D～E結果所示：與正常組比較，模型組低密度脂蛋白膽固醇和總膽固醇的水平顯著升高（P＜0.05）；50、100 mg/kg槐杞黃顆粒組的低密度脂蛋白膽固醇和總膽固醇水平水平顯著低于模型組（P＜0.05）。此外，與正常組比較，模型組腎指數顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，50、100 mg/kg 槐杞黃顆粒組腎指數顯著下降（P＜0.05）。槐杞黃顆粒各劑量組以上各指標與氯沙坦組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。見圖1-F。

圖1 各組大鼠24 h尿微量白蛋白、血清肌酐、血糖、血脂及腎指數水平比較Figure 1 Comparison of 24-hour urinary albumin，serum creatinine，blood glucose，blood lipids and renal index levels in rats among various groups

腎組織切片分別進行HE、PAS 和Masson 染色，結果顯示：與正常組比較，模型組大鼠出現腎臟病理改變， 包括HE 染色可見系膜基質增加，PAS 染色可見明顯的節段性腎小球硬化。由于DKD 動物模型的局限性，所有DKD 大鼠Masson 染色均未見間質病變。與模型組比較，槐杞黃顆粒各劑量組腎臟病變明顯減輕，特別是100 mg/kg 槐杞黃顆粒。見圖2。各組PAS 染色量化腎小球系膜基質擴張情況見圖3，結果顯示：模型組腎小球系膜指數顯著高于正常組（P＜0.05），50、100 mg/kg槐杞黃顆粒組腎小球系膜指數顯著低于模型組（P＜0.05），且與氯沙坦組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。表明槐杞黃顆粒可抑制DKD 大鼠的細胞外基質積累和系膜基質擴張，減輕腎纖維化。

圖2 各組大鼠腎臟組織病理病變比較（×400）Figure 2 Comparison of features of renal histopathological lesions in rats among various groups（×400）

圖3 各組PAS染色量化腎小球系膜基質擴張比較Figure 3 Comparison of PAS staining quantitative glomerular mesangial matrix expansion among various groups

2.2 槐杞黃顆粒對高糖誘導HK2細胞增殖活力的影響采用MTT 法檢測槐杞黃顆粒對HK2 細胞增殖的影響，如圖4所示：與正常糖組比較，高糖暴露48、72 h 后HK2 細胞增殖活力增加（P＜0.05）。與不含槐杞黃顆粒的高糖組比較，高于20μmol/L槐杞黃顆粒處理48 h 和72 h 后細胞增殖活力顯著降低（P＜0.05）。

圖4 槐杞黃顆粒對高糖誘導人腎近端小管上皮細胞（HK2）48、72 h增殖情況的影響（n=6）Figure 4 Effect of Huaiqihuang Granules on the proliferation of human renal proximal tubular epithelial cells（HK2）induced by high glucose for 48 and 72 hours（n=6）

2.3 槐杞黃顆粒對高糖誘導HK2細胞內ROS生成和線粒體ROS生成的影響采用熒光探針DCFHDA 法和MitoSOX/Hoechst 33342 染色法分別檢測HK2 細胞胞內ROS 生成和線粒體ROS 生成。結果如圖5-A 所示：與正常糖組比較，高糖組細胞內ROS 水平顯著升高（P＜0.05）；與高糖組比較，槐杞黃顆粒處理后ROS 水平呈濃度依賴性降低，特別是10μmol/L和20μmol/L濃度的槐杞黃顆粒處理組HK2 細胞中ROS 的產生顯著減少（P＜0.05）。如圖5-B 所示，在高糖組中觀察到線粒體ROS 生成增加，但被20μmol/L 的槐杞黃顆粒處理后顯著抑制。此外，正常糖組和甘露醇組線粒體ROS 生成無明顯差異。這2個ROS檢測實驗證實了槐杞黃顆粒可增強高糖誘導腎細胞的抗氧化能力。

圖5 槐杞黃顆粒對高糖誘導HK2細胞內ROS生成和線粒體ROS生成的影響Figure 5 Effects of Huaiqihuang Granules on intracellular ROS generation and mitochondrial ROS generation in HK2 cells induced by high glucose

2.4 槐杞黃顆粒對高糖誘導HK2細胞NLRP3炎癥小體活化的影響如圖6 所示：與正常糖組比較，高糖組的NLRP3、cleaved-Caspase-1和IL-1β 的蛋白表達水平顯著提高；而與高糖組比較，槐杞黃顆粒組的NLRP3、cleaved-Caspase-1和IL-1β 的蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05）。

圖6 槐杞黃顆粒對高糖誘導HK2細胞NLRP3炎癥小體活化的影響Figure 6 Effect of Huaiqihuang Granules on NLRP3 inflammasome activation in HK2 cells induced by high glucose

2.5 槐杞黃顆粒對高糖誘導HK2 細胞腎纖維化相關蛋白FN、Col Ⅳ表達的影響如圖7 所示：HK2 細胞中FN、Col Ⅳ的蛋白表達水平在高糖作用下升高，但在槐杞黃顆粒處理后逐漸降低。高糖組HK2 細胞中FN、Col Ⅳ的蛋白表達水平顯著高于正常糖組（P＜0.05）；10、20μmol·L-1槐杞黃顆粒組細胞中FN、Col Ⅳ的蛋白表達水平顯著低于高糖組（P＜0.05）。

圖7 槐杞黃顆粒對高糖誘導HK2細胞纖維連接蛋白（FN）和Ⅳ型膠原蛋白（Col Ⅳ）表達的影響Figure 7 Effects of Huaiqihuang Granules on the expression of fibronectin（FN）and collagen Ⅳ（Col Ⅳ）in HK2 cells induced by high glucose

3 討論

糖尿病腎病（DKD）屬中醫消渴病并發癥，其病因歸同消渴病。糖尿病腎病的基本病機為本虛標實，氣陰兩虛是發病根本，病變初期以陰虛為主，遷延日久陰傷及氣，終致氣陰兩虛，貫穿始終，其他變證均由氣陰兩虛所致，只有氣陰兩虛得到有效控制，疾病才能有所緩解[6]。槐杞黃顆粒正具有益氣養陰功效。本研究結果表明，槐杞黃顆粒可顯著改善DKD 大鼠的尿微量白蛋白排泄、血清肌酐水平，高血糖及脂質代謝紊亂，并可通過抑制細胞外基質積聚和系膜基質擴張而減輕腎臟纖維化，從而減輕DKD 大鼠的腎損害，提示槐杞黃顆粒可能成為治療DKD的一種新藥物。

氧化應激和慢性低度炎癥在DKD 中起著至關重要的作用[7]。高糖不僅促進ROS的生成和NLRP3炎癥小體的激活[8]，也會刺激包括纖維連接蛋白（FN）和Ⅳ型膠原蛋白（Col Ⅳ）在內的細胞外基質蛋白在DKD 中的積累增加，從而導致腎小球硬化和小管間質纖維化[9]。在經典DKD發病機制的初始激活和核心事件中，ROS 的產生可以通過PI3K 途徑激活炎癥介質，從而促進巨噬細胞中Caspase-1 的激活和IL-1β 的分泌[10-11]。高血糖或高糖誘導的NLRP3 炎癥介質的關鍵調節因子硫氧還蛋白相互作用蛋白（TXNIP），與NLRP3 共同構成細胞應激傳感器，識別過度氧化應激或危險信號，觸發炎癥反應。ROS 刺激后，氧化的硫氧還蛋白（Trx）釋放出硫氧還蛋白相互作用蛋白，直接結合NLRP3的LRR 結構域，介導炎癥小體的組裝[12]。ROS 還可以引起核轉錄因子κB（NF-κB）和p38 絲裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）信號激活NLRP3 炎癥小體[13]。激活的NLRP3 炎癥小體刺激促炎細胞因子的分泌，隨后Caspase-1 激活，引發慢性低度炎癥。此外，ROS 通過促進腎臟炎性細胞因子的產生，加速細胞外基質的過度積累。本研究結果表明，高糖刺激誘導HK2 細胞增殖，過量的ROS 生成，激活NLRP3炎癥小體和細胞外基質蛋白表達。槐杞黃顆粒抑制高糖誘導的HK2 細胞增殖、細胞內和線粒體ROS 過量生成，顯著降低高糖誘導的HK2 細胞腎纖維化標志蛋白FN、Col Ⅳ，NLRP3炎癥小體活化及cleaved-Caspase-1 和IL-1β表達。

綜上所述，槐杞黃顆粒可以降低DKD 大鼠的尿微量白蛋白排泄、血清肌酐水平，改善糖脂代謝紊亂，減輕腎臟組織病理損害。槐杞黃顆粒可能通過抑制高糖誘導HK2 細胞ROS 生成、減輕NLRP3 炎癥小體的激活和腎纖維化相關蛋白的表達發揮腎保護作用。