流式細胞技術在抗生素抑菌實驗中的應用

蔣海霞， 許 杰

（上海交通大學生命科學技術學院，上海 200240）

0 引 言

在抗生素抑菌能力研究中，快速檢測靶標細菌的生長或活力狀態至關重要［1］。目前檢測細菌生長和活力的經典方法主要是平板抑菌圈法和細菌細胞透性檢測法（包括膜電勢測量法和Ca2+濃度測量法等）［2-4］。盡管這些方法比較成熟，但是存在耗時長、誤差大、操作繁瑣等問題，難以滿足抗生素抑菌能力實驗中快速、準確地檢測細菌生長狀態的要求，因此尋找可用于抗生素抑菌檢測的新方法很有必要。

流式細胞儀（FCM）已廣泛應用于分子生物學、遺傳學、生物化學、免疫學、藥理學、營養學、腫瘤醫學和臨床檢驗等領域［5-6］。流式細胞儀具有靈敏、精確、高效、樣品前處理簡單等優勢，可快速采集多參數數據［7］。目前流式細胞儀在真核細胞凋亡方面的檢測已經比較成熟，可以實現對活細胞和死細胞的有效區分［8］。原核細胞和真核細胞存在固有差異（如細胞的大小、細胞壁組成、細胞核的有無、染色質狀態等），而流式細胞技術在區分原核細胞（如細菌）生長狀態方面的研究還相對較少。近年來，隨著各類熒光染料的出現與流式細胞儀等技術的發展，通過流式細胞儀檢測不同熒光信號來分析細菌等微生物成為可能。李森［9］通過系統分析影響流式細胞儀定量檢測結果的各種因素，優化進樣濃度、進樣速率、SYBR GreenⅠ和碘化丙啶（PI）染料濃度、染色溫度和染色時間，建立了適用于水環境樣品細菌活性分析的快速定量檢測方法。鄧穎［10］通過研究染料熒光團SYTO 9 和PI 的細菌染色特性、染色濃度和染色時間，評估流式細胞儀定量檢測大腸桿菌活性的效果。以上研究表明，利用流式細胞技術可實現細菌死活狀態的檢測，但是流式細胞技術在抗生素抑菌實驗中的研究幾乎沒有相關文獻。

黃單胞菌屬病原細菌可以侵染超過400 種植物，是我國目前防治的重點病害微生物之一［11］。申嗪霉素（Shenqinmycin）是假單胞菌Pseudomonas 代謝產物吩嗪-1-羧酸（Phenazine-1-Carboxylic Acid，PCA）的商業名稱，由上海交通大學生命科學技術學院與上海農樂生物制品股份有限公司自主研發、具有廣譜抗菌活性的一種新型微生物源殺菌劑（農用抗生素），前期研究表明申嗪霉素在黃單胞菌的防治中起到較好的作用［12-13］。因此，以申嗪霉素對黃單胞菌抑菌效果為例，利用流式細胞技術開發細菌凋亡的快速檢測方法，尤其精準分析細菌的活力狀態，為抗生素等藥物抑菌機理檢測提供支持。

1 材料與方法

1.1 申嗪霉素溶液配制和處理時間

采用甲醇配制申嗪霉素母液（200 mg/mL），以最大水溶度進行梯度稀釋：20、2、0.2、0.02 mg/mL，分別加入對數生長期的黃單胞菌培養液里，1 和2 h后分別取樣檢測。

1.2 細菌樣品準備

取不同質量濃度申嗪霉素、處理1 h和2 h后的黃單胞菌培養菌液，采用分光光度計檢測，在光密度值為1 的基礎上再稀釋10 倍，重懸的菌液顆粒含量為1 ×107個/mL。

1.3 樣本制備

樣本采用碧云天Annexin-V-FITC 凋亡檢測試劑盒進行染色處理。按照產品說明書將處理后的細菌離心，采用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌一次，再將試劑盒中組分Annexin-V-FITC 和PI 按照20∶1比例重懸，室溫避光孵育15 min后上機檢測。

1.4 流式細胞技術檢測方法及參數設置

本實驗測試儀器是美國Beckman Coulter 公司的Cytoflex流式細胞儀。

鑒于原核細胞的體積較小，設置反映細胞直徑大小的前向散射光（FSC）和側向散射光（SSC）的信號值為對數放大，同時設置FSC信號閾值為5 ×103。建立雙參數FSC-A和SSC-A散點圖以及雙參數FITC-A和PE-A散點圖（硫氰酸熒光素，FITC；藻紅蛋白，PE；面積，A），采用未經染色的對照樣品調節光電倍增管電壓，將Annexin-V-FITC和PI分別單獨染色的對照樣品調節熒光補償（通過互補矩陣里的參數設置），得到合適的流式細胞圖。在雙參數FSC-A 和SSC-A 散點圖中找到細菌最集中的區域設門P1，圈出所需分析的細菌（見圖1，FSC-A 和SSC-A 表示散射光強度的相對值）。收集1 ×104個細菌進行流式分析。FITC 通道檢測波長為530/30 nm，PE 通道檢測波長為586/15 nm，FITC 通道收集Annexin-V-FITC 綠色熒光，PE 通道收集PI紅色熒光，獲得FITC-A和PE-A散點圖。

圖1 基于FSC-A和SSC-A散點圖的細菌設門

2 結果與分析

2.1 對照設置和染色分析

在細菌凋亡早期，細胞膜內側的磷脂酰絲氨酸外翻到細胞表面，Annexin-V-FITC與之結合呈現陽性，此時細胞膜還是完整的，PI 無法穿透細胞膜染色而呈現陰性；在細菌凋亡晚期，細胞膜的完整性已經喪失，Annexin-V-FITC和PI 都可以對細胞染色而呈現雙陽性；已經死亡的細菌因細胞膜已經被破壞、Annexin-VFITC無法結合磷脂酰絲氨酸而呈現陰性，PI可以對細胞染色而呈現陽性。因此，取未經染色的菌體PBS 懸液作為雙陰性對照，經申嗪霉素處理（20 mg/mL 處理1 h）的細菌用Annexin-V-FITC單獨染色作為單陽性對照，質量分數75%乙醇處理30 min 的細菌用PI 單獨染色作為另一單陽性對照。FITC-A 和PE-A 散點圖（FITC-A 和PE-A 代表熒光強度的相對值）分析結果表明：未經染色雙陰性細菌位于四象限的左下象限Q1-LL［見圖2（a）］，經申嗪霉素處理和Annexin-VFITC染色為陽性的細菌位于四象限的右下象限Q1-LR［見圖2（b）］，經質量分數75%乙醇處理30 min和PI染色為陽性的細菌位于四象限的左上象限Q1-UL［見圖2（c）］。結果表明，流式細胞技術能夠較好地區分凋亡不同階段或不同狀態的黃單胞菌。

圖2 對照組的FITC-A和PE-A散點圖分析

2.2 時間和梯度分析

為了進一步探究流式細胞儀在檢測黃單胞菌凋亡中的靈敏度和準確度，采用2 個處理時間和4 個梯度質量濃度的雙因素疊加分析（見圖3）。橫向對比不同質量濃度的抑菌效果。結果表明：處理1 h 后，隨著申嗪霉素質量濃度的逐漸增加（0.02 ～20 mg/mL），Annexin-V-FITC和PI 雙陽性的細胞位于四象限的右上象限Q1-UR，凋亡晚期的壞死細胞百分比逐漸增加，從4.30%、6.18%、12.81%增加到20.61%［見圖3（a）～（d）］；處理2 h后得到類似的結論，凋亡晚期的壞死細胞百分比從18.82%、23.43%，29.64%增加到37.95%［見圖3（e）～（h）］。這表明申嗪霉素質量濃度越高，抑菌（黃單胞菌）能力越強。

圖3 實驗組的FITC-A和PE-A散點圖

進一步兩兩縱向分析相同質量濃度和不同處理時間下的效果［見圖3（a）、（e），圖3（b）、（f），圖3（c）、（g），圖3（d）、（h）］。結果表明：相同申嗪霉素質量濃度時，隨著處理時間的增加，Annexin-V-FITC 和PI 雙陽性細胞凋亡晚期的壞死細胞百分比相應增加，0.02 mg/mL下為4.30% ～18.82%［見圖3（a）、（e）］，0.2 mg/mL 下為6.18% ～23.43%［見圖3（b）、（f）］，2 mg/mL下為12.81% ～29.64%［見圖3（c）、（g）］，20 mg/mL下為20.61% ～37.95%［圖3（d）、（h）］。以上數據表明，相同質量濃度下，隨著處理時間的延長，申嗪霉素抑菌（黃單胞菌）能力越強。

3 討 論

經典的平板抑菌圈法檢測申嗪霉素對黃單胞菌的抑菌效果難以量化［14-15］，而且也難以快速、準確地檢測細菌的生長狀態。本研究基于細胞凋亡過程中細胞膜完整性和通透性的改變所導致的Annexin-V-FITC和PI染色差異，提出通過流式細胞技術建立細胞凋亡的快速檢測方法，可以有效地解決細胞凋亡快速檢測問題。

本研究重點分析時間和濃度雙層因素下，流式細胞技術檢測申嗪霉素對黃單胞菌抑制的變化。相同處理時間下，申嗪霉素質量濃度越高，凋亡晚期的壞死細胞越多，但是死亡細胞的比例（Q1-UL）變化不明顯（見圖3）。以處理時間1 h 和2 h 為例，隨著申嗪霉素質量濃度（0.02 ～20 mg/mL）的逐漸增加，Annexin-VFITC陰性而PI 陽性的細胞位于四象限的左上象限Q1-UL，死亡細胞百分比變化不明顯（見圖3）。相同申嗪霉素質量濃度下，隨著處理時間的增加（1 h 和2 h），死亡細胞百分比（Q1-UL）明顯增加（見圖3）。本研究進一步量化了不同質量濃度和不同處理時間下申嗪霉素對黃單胞菌的抑菌效果，也為實際用藥量和作用時間提供了數據支撐。

4 結 語

流式細胞儀在動物細胞研究領域使用頻率很高，但在微生物領域使用較少。上海交通大學生命科學技術學院儀器共享與技術服務平臺依托微生物代謝國家重點實驗室，進一步拓展了流式細胞儀在微生物研究領域的應用，以期為抗生素等藥物抑菌機理研究檢測技術提供支持。