紅茶菌發酵液宏基因組分析

趙平 劉慶靜 楊光 郭瑩瑩 鄒積宏

摘要? 對3個發酵批次的紅茶菌發酵液進行宏基因組序列分析，采用數據庫進行比對，發現紅茶菌發酵液中存在短乳桿菌、植物乳桿菌、食竇魏斯氏菌、發酵乳桿菌、戊糖乳桿菌、融合魏斯氏菌、羅伊氏乳桿菌、檸檬明串珠菌、類植物乳桿、副干酪乳桿菌、乳酸片球菌等具有益生功能的細菌。宏基因組注釋到的功能基因共有76 512個，其中與代謝過程注釋到的功能基因數最多，且這些代謝途徑上注釋得到的菌株多數是益生菌株，主要參與了與碳水化合物代謝相關的三羧酸循環、檸檬酸循環、磷酸戊糖途徑、糖酵解等；與氨基酸代謝相關主要有丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝途徑、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸等代謝途徑。

關鍵詞? 紅茶菌；益生菌；宏基因組；分析

中圖分類號? TS272.7? 文獻標識碼? A? 文章編號? 0517-6611（2024）09-0071-08

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.09.016

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Metagenomic Analysis of Kombucha Fermentation Broth

ZHAO Ping1，LIU Qing-jing2， YANG Guang3 et al

（1.Heilongjiang Green Food Science Research Institute， Harbin， Heilongjiang 150028;2.Heilongjiang University， Harbin， Heilongjiang 150008;3.Quality Supervision and Testing Institute of Heilongjiang Province， Harbin， Heilongjiang 150028）

Abstract? The metagenomic sequence analysis of the fermentation broth of three fermentation batches of kombucha was carried out， and the database was used for comparison. It was found that there were mainly Lactobacillus brevis， Lactobacillus plantarum， Weisseria sinusosus， Lactobacillus fermentatum， Lactobacillus pentosus， Weisseria fused， Lactobacillus reuteri， Nebulococci citronicum， Lactobacillus paracasei， Lococci lactate and other bacteria with probiotic function in the fermentation broth of tea fungus. A total of 76 512 functional genes were annotated by metagenomes， among which the most functional genes were annotated by metabolic processes. Most of the strains annotated by these metabolic pathways were probiotic strains， which were mainly involved in the tricarboxylic acid cycle， citric acid cycle， pentose phosphate pathway， glycolysis and so on related to carbohydrate metabolism. The metabolic pathways of alanine， aspartate and glutamate， glycine， serine and threonine are mainly related to amino acid metabolism.

Key words? Kombucha;Probiotics;Metagenome;Analysis

基金項目? 國家市場監督管理總局技術保障專項項目（2020YJ010）；黑龍江省財政支持項目。

作者簡介? 趙平（1985—），男，黑龍江哈爾濱人，副研究員，從事生物產品開發、食品微生物檢測研究。

*通信作者，教授，從事食品和藥物物質功能的挖掘及開發研究。

收稿日期? 2023-06-02；修回日期? 2023-07-08

紅茶菌是民間用茶糖水與微生物培育菌苔或菌液而成，因多用紅茶，菌液呈紅色而得名。由于自然發酵過程而產生對人體有益的活性物質，不僅留有紅茶本身的飲用價值，而且還具有獨特的保健作用，曾風靡一時作為飲品流行至今［1］。紅茶菌液發酵一定時間后，會形成苔狀似海蜇皮，又稱“海寶”［2］、“紅茶菇”等［3-4］。紅茶菌最早發現于約公元前220年，因具有解毒提神、助消化、抑菌、抗氧化、護肝、防癌、抗癌、降血糖、降血脂、調節血壓、分解有毒物質等藥用價值被視為珍寶，稱為“胃寶”［5-24］。

紅茶菌的菌群結構、發酵產物和化學成分隨著現代分子生物學技術的快速發展而被逐步深入研究。目前研究表明，紅茶菌是由多年來人工培養馴化多種共生益生菌組成，其中包括細菌和真菌［25］。在我國紅茶菌雖然有很長的飲用歷史，但仍停留在作坊式階段，易染雜菌、風味變化大等問題導致無市場競爭力［26］。因此，探索紅茶菌發酵液中微生物的群落結構，從基因層面解釋微生物與發酵液風味及安全性之間的聯系十分重要。近年來，宏基因組（Metagenome）測序廣泛應用于奶酪、普洱茶、可可豆、發酵香腸、酒、醬油、食醋等發酵食品，且取得了一系列的研究成果，這對研究菌群結構及挖掘其功能基因至關重要［27］。

筆者利用宏基因組學，對紅茶菌發酵液中微生物進行測序，對結果序列進行優化、組裝、去冗余后注釋物種，對微生物的群落結構、功能基因、代謝通路進行探索，從基因層面探討微生物與紅茶菌發酵液中的碳水化合物、氨基酸等代謝通路，闡明微生物在風味物質產生與形成過程中的作用。

1? 材料與方法

1.1? 主要材料

紅茶菌，黑龍江質量監督檢測研究院微生物與分子生物學檢測研究中心保藏。

1.2? 主要儀器和設備

AOEA580型HiSeq 2 500 高通量測序系統，美國 Illumina 公司；2266型潔凈工作臺，上海拜艾斯凈化設備有限公司。

1.3? 試驗方法

1.3.1? 樣品檢測。

分別取3批次實驗室發酵7 d所得的紅茶菌發酵液，進行宏基因組測序。

1.3.2? 測序數據預處理及質量評估。

測序數據預處理后將符合要求的產物用 Illumina HiSeq 高通量測序平臺進行測序。篩查下機的原始數據質量，去除非目的序列，獲得高質量可用于宏基因組分析的數據集（Clean data），再對篩查出的Clean data拼接、校正與組裝，構建宏基因組疊連群（Contigs）序列集，進行去冗余基因預測，獲得非冗余氨基酸序列集，用于后續分析。

1.3.3? 紅茶菌微生物多樣性分析。

物種α分析時首先對全體樣本種水平的組成譜，在最低測序深度下進行隨機重抽樣，從而校正測序深度引起的多樣性差異。隨后，利用QIIME軟件計算每個樣本上述4種多樣性指數（Chao1、ACE、Shannon、Simpson），對各樣本在不同測序深度下的種水平豐度分布隨機抽樣，以各深度下抽取到的序列數與其對應的物種數繪制稀疏曲線。β多樣性分析法，主要采用主成分分析法，通過QIIME和R軟件對樣本進行PCA分析，并描述樣本間的差異分布特征。根據各樣本在種水平的組成譜，使用R軟件可計算共有、獨有物種的數量，并通過Venn圖直觀地呈現各樣本所共有和獨有的物種數量。

1.3.4? 紅茶菌微生物功能基因分析。

1.3.4.1? 紅茶菌eggNOG數據庫注釋。

將預測得到的蛋白序列集與EggNOG數據庫（http：//eggnog.embl.de/version_5.0/，v5.0）的參考蛋白序列進行比對。比對軟件使用MMseqs2，設置靈敏度參數為5.7，選擇alignment得分最高的參考蛋白序列作為比對結果。通過eggnog-mapper將比對結果映射到EggNOG的數據庫中，提取其分類信息及后續的GO注釋結果。將注釋得到的eggNOG結果及基因的豐度矩陣整合，可以獲取各蛋白對應的eggNOG直系同源基因簇的豐度。再根據每個直系同源基因簇所屬的分類就能統計不同水平的EggNOG功能類群豐度。

1.3.4.2? 紅茶菌KEGG代謝通路注釋。

將預測得到的蛋白序列集與KOBAS軟件的蛋白數據庫（v2020_10_20）進行相似比對，比對軟件使用MMseqs2，設置靈敏度參數為5.7，選擇alignment得分最高的參考蛋白序列作為比對結果。KOBAS參考序列帶有KO注釋，通過將蛋白序列與之比對，即可獲得蛋白序列的KO信息。將注釋得到的KO結果及基因的豐度矩陣整合，可以獲取各蛋白對應的KO豐度。最后再使用MinPath推斷存在的代謝通路（KEGG pathway），并統計其豐度。

1.3.4.3? 紅茶菌GO功能注釋。

蛋白編碼基因的GO注釋采用eggnog-mapper軟件完成，得到的GO編號通過map2slim得到GOSlim注釋結果，這一注釋過程參考了記錄GO信息的go-basic.obo文件（http：//purl.obolibrary.org/obo/go/go-basic.obo）。將注釋得到的GO結果及基因豐度矩陣整合，可以獲取各蛋白對應的GO豐度。再根據每個GO所屬的分類，可以統計不同水平的GO功能類群豐度。

1.3.4.4? 紅茶菌CAZy功能注釋。

將預測得到的蛋白序列集與dbCAN（DataBase for automated Carbohydrate-active enzyme Annotation）中的參考蛋白序列（v2021_09_24）進行相似比對。比對軟件使用MMseqs2，設置靈敏度參數為5.7，選擇alignment得分最高的參考蛋白序列作為比對結果。將注釋得到的CAZy功能類群結果及基因的豐度矩陣整合，可以獲取各蛋白對應的CAZy酶家族的豐度。再依據酶所屬的功能模塊統計不同模塊的CAZy酶家族豐度。

2? 結果與分析

2.1? 紅茶菌微生物物種豐度及多樣性

2.1.1? 物種豐度。

圖1為選取種水平上的相對豐度柱狀圖，可直觀反映出A1、A2、A3種水平上豐度排名前20的物種及比例。由圖1可知，3個樣品主要包括短乳桿菌、植物乳桿菌、食竇魏斯氏菌、亞洲腸球菌、香腸乳桿菌等。其中，短乳桿菌豐度最高，占總菌數的70.46%，A1、A2、A3中短乳桿菌分別占70.48%、70.34%、70.57%，說明發酵不同批次的短乳桿菌豐度差異較小，也再次證明了紅茶菌發酵工藝的穩定性。紅茶菌發酵液中還包含植物乳桿菌、食竇魏斯氏菌、亞洲腸球菌，分別占總菌數的13.34%、3.19%、0.65%，除此之外還有香腸乳桿菌、類食品乳桿菌、萊蒂亞駒形桿菌等。表1為對應圖1整理出的相對豐度前十并被世界公認的益生菌。益生菌是一類對人體有益，可在腸道定殖并在腸道具有益生功能的一類微生物。由表1可知，紅茶菌中的益生菌主要集中在短乳桿菌、植物乳桿菌、類植物乳桿菌、發酵乳桿菌，在人體中主要起抑菌、降膽固醇、調節機體免疫、維持腸道菌群等作用；食竇魏斯氏菌、副干酪乳桿菌、乳酸片球菌主要起抗氧化作用；戊糖乳桿菌可降血脂血糖、降尿酸，羅伊氏乳桿菌也可防潰瘍、緩解過敏等癥狀。

2.1.2? Alpha 多樣性。

為比較3個發酵批次紅茶菌發酵液的多樣性與豐富度，對Alpha多樣性指數進行比較分析，結果見表2和圖2。由表2和圖2可知，3個樣本中，A3樣本菌群中實際存在的物種數最多，菌群豐度和多樣性指數相對較高，A2的Simpson指數最高，這說明紅茶菌菌種穩定，發酵條件控制較好。

2.1.3? Beta 多樣性。

β多樣性分析主要用于從菌群功能以及物種組成2個層面考察樣本之間的差異。對宏基因組樣本在數據庫中注釋得到的種水平的組成譜分別進行PCA分析。PCA分析將原始的高維數據通過線性變換組合，投影到維度較低的空間坐標系（即主成分）中，從而達到降維、簡化數據結構的目的，展現樣本的自然分布，樣品的組成越

近，在PCA圖中反映的距離就越近（圖3）。前2個主成分

貢獻率分別是96.11%、3.89%，符合主成分分析要求。圖中3個點之間距離較近，表明2個樣本的物種組差異較小，有較高相似度。Venn圖顯示，3個樣本之間存在組間差異，但差異較小。

2.2? 紅茶菌發酵液微生物功能基因

2.2.1? eggNOG數據庫功能注釋。

為了探索紅茶菌發酵液微生物群落的遺傳組成和功能，利用eggNOG數據庫序列對宏基因組學鑒定的基因進行了分析，由圖4可知，共有19 390個基因被注釋。從圖4中可觀察到代謝功能較為豐富，說明發酵液中微生物代謝較為旺盛，是與發酵液風味形成最直接的功能分類，共有5 607條基因被注釋，其中氨基酸運輸和代謝（1 351個基因，6.97%）、能量生產和轉化（920個基因，4.74%）和碳水化合物運輸和代謝（1 638個基因，8.45%）是前三大功能分類，說明氨基酸代謝與碳水化合物代謝均是發酵的重要過程，功能不明為 4 770條，占 24.60%。

2.2.2? KEGG數據庫功能注釋。

將KEGG 代謝通路與蛋白序列利用數據庫進行比對，可以對預測得到的基因進行代謝通路注釋分類，具體信息如圖5所示。從圖5可知，紅茶菌發酵液在糖代謝（carbohydrate metabolism）、氨基酸代謝（amino acid metabolism）和核苷酸代謝（nucleotide metabolism）中發揮重要作用，并且碳水化合物相關的基因數目最多，高達2 971條。注釋到翻譯（translation）和復制和修復（replication and repair）的基因占遺傳信息分類基因比例高達80.69%。發酵液中在 KEGG 代謝通路注釋信息統計結果見表3。由表3可知，與新陳代謝相關的基因數高達10 087條，其次為遺傳信息傳遞（2 211）、環境信息處理（1 800）、人類疾病（925）、細胞過程（878）、生物體系統（512），表明在發酵過程中發酵液中的微生物具有代謝活動旺盛的特點。

2.2.3? GO數據庫功能注釋。

基于GO數據庫對發酵液樣品功能統計結果如圖6所示，注釋到53個功能類別共有38 309個基因。其中，生物學途徑（biological process）包括26個分支，代謝過程（metabolic process）、細胞過程（cellular process）、發育（growth）注釋到的基因數目排名前3，分別為4 055（28.13%）、3 996（27.72%）、1 034（7.17%）個；細胞組件（cellular component）包括17個功能類別，細胞（cell）和細胞部分（cell part）共注釋到11 971條基因，占該部分的83.06%；催化活性（catalytic activity）在分子功能（molecular function）中注釋到3 160條基因。

2.2.4? CAZy 蛋白功能注釋。

圖7為CAZy 數據庫的具體注釋信息。由圖7可知，CAZy 數據庫將這些碳水化合物活性酶分為六大蛋白功能模塊：輔助氧化還原酶（AA）、碳水化合物酯酶（CE）、糖苷水解酶（GH）、糖基轉移酶（GT）、多糖裂解酶（PL）以及碳水化合物結合模塊（CBM）。碳水化合物活性酶中GH的占比最高，其次為GT。GH可以分解碳水化合物分子之間的糖苷鍵，在生物體中多糖的水解和合成中發揮重要作用。GT則能夠催化活化的糖連接到蛋白、核酸、寡糖等不同的受體分子上產生具有很多生物學功能的糖基化產物。

2.3? 營養風味物質代謝通路

2.3.1? 碳水化合物相關代謝通路及途徑。

通過KEGG注釋結果可知，注釋到碳水化合物代謝相關基因高達2 971條，碳水化合物是發酵液中發揮營養作用的主要物質。表4中序號從大到小所注釋到的基因數越來越少，注釋到糖酵解/糖異生的基因數在碳水化合物代謝途徑中最豐富，因為紅茶菌發酵液中都含有糖類物質，分解為葡萄糖后通過糖酵解途徑生成發酵中產物乳酸（如圖8所示），乳酸對許多發酵食品的風味形成有重要影響，除乳酸外，甲酸、乙醇乙酸和二氧化碳等也是糖酵解途徑的主要產物。此外，4-磷酸赤鮮糖和磷酸烯醇式丙酮酸也能參與芳香族氨基酸的合成。 另外，檸檬酸循環也是碳水化合物代謝中的主要途徑。研究表明，某些微生物能通過檸檬酸水解酶將檸檬酸轉化為草酰乙酸和乙酸酯，進而產生乙酸等風味物質。此外，檸檬酸代謝中間產物也能夠參與氨基酸代謝途徑合成氨基酸等風味物質。

2.3.2? 氨基酸代謝相關代謝通路及途徑。

氨基酸代謝是風味形成途徑中最關鍵的途徑之一。KEGG 代謝通路注釋到的氨基酸代謝途徑見表5。在紅茶菌發酵過程中，代謝較為活躍的是天冬氨酸、谷氨酸和丙氨酸。由圖9可知，天冬氨酸、谷氨酸和丙氨酸之間能夠互相轉化，谷氨酸與草酰乙酸在天冬氨酸轉氨酶催化下轉氨基可形成天冬氨酸。而在氨基酸合成中，都是以天冬氨酸為前體。另外，谷氨酸在丙氨酸轉氨酶的催化作用下可與丙酮酸形成 α-酮戊二酸和丙氨酸，而乙偶姻和雙乙酰等物質可經丙氨酸或天冬氨酸進一步分解代謝生成，而且谷氨酸經脫羧后能形成一種抑制性神經遞質——γ-氨基丁酸。 其次是絲氨酸、蘇氨酸和甘氨酸代謝，其中蘇氨酸和絲氨酸可參與合成蛋氨酸和甘氨酸，而甘氨酸會形成丙酮酸，從而促進產生乙醇與乙酸等風味物質。紅茶菌發酵過程中，異亮氨酸、亮氨酸和纈氨酸等支鏈氨基酸降解途徑的相對豐度逐漸降低，色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸等芳香氨基酸代謝途徑的相對豐度也逐漸降低。研究表明，支鏈氨基酸經脫羧與轉氨后，可還原為 2-甲基丁醇、異丁醇和乙酸異戊酯等風味物質。而苯香草醛、苯乙酸、乙醛和苯乳酸等風味物質的前體物質主要為苯丙氨酸，酪氨酸降解可形成苯酚。

3? 結論

通過對紅茶菌發酵液微生物功能基因注釋結果可知，新陳代謝被注釋的基因數最多，且新陳代謝決定著紅茶菌發酵液的風味和營養。該研究與 KEGG數據庫進行比對，找出紅茶菌發酵液中主要營養成分及風味物質的代謝通路，并對關鍵代謝通路中的酶、基因、微生物等進行分析，從基因層面，揭示發酵液風味與微生物及安全性之間的聯系，為紅茶菌發酵液風味物質的形成機制提供參考。另外，發酵液中還發現了少量的真菌與噬菌體病毒，大多為發酵液中常見的微生物，如接合酵母菌屬（Zygosaccharomyces）添加到醬油釀造過程中，顯著提高醬油的風味物質成分；片球菌屬（Pediococcus）具有產生多種胞外多糖酶，提高抗氧化等作用。

通過對發酵液中微生物 KEGG 注釋的功能基因進行分析得知，注釋功能最多的是代謝方面，其中參與碳水化合物代謝途徑相關的基因含量最多，氨基酸次之，得到相關代謝通路的具體信息，發現發酵乳桿菌、植物乳桿菌、短乳桿菌、食竇魏斯氏菌是紅茶菌發酵液中風味物質的關鍵菌種，說明該代謝通路微生物活動最為旺盛，這也是構成紅茶菌發酵液風味物質的主要成分。試驗結果表明，通過 KEGG 代謝通路，注釋到的功能基因在Nr 數據庫中能夠匹配到相應的菌種，但在發酵液中未找到該菌種，說明在菌種鑒定領域宏基因組數據庫存在著局限性。在基因組測序研究中還需更完善的數據庫及測序技術來完成研究。

參考文獻

［1］ 徐家豪，林靜嫦，張舒寧，等.柑橘紅茶菌飲料發酵工藝的優化［J］.現代食品科技，2022，38（4）：106-113，274.

［2］ 趙平，郭瑩瑩，楊光，等.紅茶菌研究現狀［J］.現代食品，2020（21）：1-4.

［3］ 呂晴.以藜麥為基料的紅茶菌發酵工藝及抗氧化活性研究［D］.天津：天津農學院，2020.

［4］ LAUREYS D，BRITTON S J，DE CLIPPELEER J.Kombucha tea fermentation：A review［J］.Journal of the American society of brewing chemists，2020，78（3）：165-174.

［5］ 王國增，林娟，葉秀云，等.“紅茶菌”的抑菌作用及抗氧化性［J］.中國食品學報，2015，15（9）：173-179.

［6］ BHATTACHAＲYA D，GHOSH D，BHATTACHAＲYA S，et al.Antibacterial activity of polyphenolic fraction of Kombucha against Vibrio cholerae：Targeting cell membrane［J］.Lett Appl Microbiol，2018，66（2）：145-152.

［7］ 申瑞瑞，李亞柯，王伯華.紅茶菌發酵液抑菌活性的研究［J］.湖南文理學院學報（自然科學版），2013，25（4）：29-32.

［8］ 王恩智，繆漢強，周新輝，等.茶多酚對金黃色葡萄球菌的抑制作用［J］.中國藥師，2010，13（5）：740-742.

［9］ WATAWANA M I，JAYAWARDENA N，GUNAWARDHANA C B，et al.Health，wellness，and safety aspects of the consumption of Kombucha［J］.J Chem，2015，2015：1-11.

［10］ CHOW R，BRUERA E，CHIU L，et al.Enteral and parenteral nutrition in cancer patients：A systematic review and meta-analysis［J］.Ann Palliat Med，2016，5（1）：30-41.

［11］ 俸毅，張偉敏，蔣盛軍，等.紅茶菌飲料澄清度與抗氧化性能力的研究［J］.茶葉科學，2009，29（6）：426-429.

［12］ JAYABALAN R，MALINI K，SATHISHKUMAR M，et al.Biochemical characteristics of tea fungus produced during Kombucha fermentation［J］.Food Sci Biotechnol，2010，19（3）：843-847.

［13］ MARSH A J，OSULLIVAN O，HILL C，et al.Sequence-based analysis of the bacterial and fungal compositions of multiple Kombucha（tea fungus）samples［J］.Food Microbiol，2014，38：171-178.

［14］ WANG Y，JI B P，WU W，et al.Hepatoprotective effects of Kombucha tea：Identification of functional strains and quantification of functional components［J］.J Sci Food Agric，2014，94（2）：265-272.

［15］ WATAWANA M I，JAYAWARDENA N，CHOO C，et al.RETRACTED：Application of the Kombucha ‘tea fungus for the enhancement of antioxidant and starch hydrolase inhibitory properties of ten herbal teas”［J］.Food Chem，2016，194：304-311.

［16］ 唐思頡，涂傳海，胡文秀，等.紅茶菌發酵黃漿水的體外抗氧化活性［J］.食品科學，2019，40（17）：1-6.

［17］ S·RIHARI T，KARTHIKESAN K，ASHOKKUMAR N，et al.Antihyperglycaemic efficacy of kombucha in streptozotocin-induced rats［J］.J Funct Food，2013，5（4）：1794-1802.

［18］ SHENOY C.Hypoglycemic activity of bio-tea in mice［J］.Indian J Exp Biol，2000，38（3）：278-279.

［19］ BHATTACHARYA S，GACHHUI R，SIL P C.Effect of Kombucha，a fermented black tea in attenuating oxidative stress mediated tissue damage in alloxan induced diabetic rats［J］.Food Chem Toxicol，2013，60：328-340.

［20］ KALLEL L，DESSEAUX V，HAMDI M，et al.Insights into the fermentation biochemistry of Kombucha teas and potential impacts of Kombucha drinking on starch digestion［J］.Food Res Int，2012，49（1）：226-232.

［21］ YANG Z W，JI B P，ZHOU F，et al.Hypocholesterolaemic and antioxidant effects of kombucha tea in high-cholesterol fed mice［J］.J Sci Food Agric，2009，89（1）：150-156.

［22］ SOARES M G，DE LIMA M，REOLON SCHMIDT V C.Technological aspects of kombucha，its applications and the symbiotic culture（SCOBY），and extraction of compounds of interest：A literature review［J］.Trends Food Sci Technol，2021，110：539-550.

［23］ KIM Y，WEST G A，RAY G，et al.Layilin is critical for mediating hyaluronan 35kDa-induced intestinal epithelial tight junction protein ZO-1 in vitro and in vivo［J］.Matrix Biol，2018，66：93-109.

［24］ 張虎成，范海濤，楊國偉，等.紅茶菌發酵液抑菌活性研究［J］.安徽農業科學，2012，40（9）：5340-5342.

［25］ TRAN T，VERDIER F，MARTIN A，et al.Oxygen management during kombucha production：Roles of the matrix，microbial activity，and process parameters［J］.Food Microbiol，2022，105：1-11.

［26］ BORTOLOMEDI B M，PAGLARINI C S，BROD F C A.Bioactive compounds in kombucha：A review of substrate effect and fermentation conditions［J］.Food Chem，2022，385：1-16.

［27］ XIE M X，WU J，AN F，et al.An integrated metagenomic/metaproteomic investigation of microbiota in dajiang-meju，a traditional fermented soybean product in Northeast China［J］.Food Res Int，2019，115：414-424.