氨基酸分析在重組蛋白類生物制品質量控制中的應用研究

◎ 魏 欣

（華北制藥金坦生物技術股份有限公司，河北 石家莊 050035）

1 氨基酸分析基本原理和方法綜述

氨基酸分析是用化學或者生物化學方法準確地確定蛋白質或者多肽的氨基酸成分、順序和含量。氨基酸分析方法包括高效液相色譜法（HPLC）、毛細管電泳法、氨基酸自動分析儀法和質譜法等。這些方法可以實現樣品的定性與定量分析，從而為深入了解蛋白質結構與功能，提供關鍵信息[1]。

2 重組蛋白類生物制品的意義及其挑戰

重組蛋白類生物制品被廣泛用于醫學治療、疫苗開發和診斷試劑中，其結構復雜，且容易受到生產過程的影響，導致產品質量發生變異。因此，保證這類產品的安全非常重要。同時，重組蛋白分子量較大、穩定性較差，且翻譯后修飾種類繁多，給其質量控制帶來了嚴峻的挑戰。因此，相關機構有必要建立一種嚴格而有效的檢測手段。氨基酸分析能夠直觀地反映蛋白質一級結構特征，評價重組蛋白類生物制品的純度、完整性，以及折疊和翻譯后的修飾狀態。基于此，本研究探索了氨基酸分析技術在重組蛋白類生物制品質量控制方面的運用，以揭示該技術的潛在價值，為重組蛋白類生物制品質量控制體系的進一步優化，提供理論依據與技術支持。

3 氨基酸分析用于重組蛋白類生物制品的質量控制

3.1 序列確認

氨基酸組成及序列分析，對于重組蛋白精確性及一致性的檢驗至關重要。通過將實際測得氨基酸序列同預期設計理論序列進行比對，能夠準確判斷蛋白質表達的正確性，評價批次之間的一致性，保證藥物有效安全。在重組蛋白類生物制品質量控制過程中，序列確認是保證產品結構正確一致的核心步驟，氨基酸分析技術對這一進程有著至關重要的作用[2]。

3.2 純度評估

氨基酸含量的比例分析，可以有效反映重組蛋白的純度高低。通過準確測定目標蛋白各氨基酸的含量，可計算目標蛋白和其他雜質（如宿主細胞的蛋白、降解產物）之間的配比，定量評價產品質量。

3.3 端點氨基酸識別

通過識別N 端、C 端的氨基酸，可以識別重組蛋白能否完成適當的翻譯，以及有無截短、延長等現象。同時，N/C 端氨基酸狀態可揭示乙酰化和甲基化等翻譯、修飾對蛋白質活性的意義。

3.4 疏水性

電荷分布及其他理化性質分析表明，氨基酸組成決定了蛋白質三維結構與功能特性。利用氨基酸分析得到的疏水性和電荷分布等數據，可以間接推測重組蛋白空間構象及穩定性，這對于優化生產工藝、提高產品質量，具有重要參考意義。

3.5 差異性糖基化或者磷酸化位點的檢測

蛋白質翻譯、修飾后，會顯著影響重組蛋白活性、穩定性、藥代動力學等。因此，對其進行檢測和定量，尤為重要。氨基酸分析可通過對實測氨基酸序列和理論序列進行比較，定位可能存在的糖基化或者磷酸化部位，以保證產品的均一性及臨床療效[3]。

4 將氨基酸分析技術運用于實際案例

4.1 具體事例簡介

以重組蛋白食品為例，在此過程中，需先對樣品進行提取和純化，再利用高效液相色譜或者質譜（MS）技術，酶解蛋白質，使蛋白質轉化成游離氨基酸混合物。接著，對這幾種氨基酸進行定量與定性分析，并測定其組成、順序及具體氨基酸殘基含量。有研究以重組人胰島素為例，準確測定了各氨基酸所占比例及C 端蘇氨酸與A 鏈、B 鏈之間二硫鍵的狀態，保證了產物符合天然胰島素的結構[4]。

4.2 案例研究

根據氨基酸分析數據，可綜合評價產品質量。有研究對特定批重組生長激素進行了氨基酸分析，結果表明，目標蛋白具有較高純度，且氨基酸組成完全符合預期設計，但是疏水性氨基酸所占比例比理論值略大，可能影響藥物穩定性。在此基礎上，研究學者提出要優化生產工藝，如調節細胞培養條件、完善純化步驟等，以減少疏水氨基酸片段生成，進而提高產物穩定性及活性。另外，如果檢測到有異常糖基化位點時，需要進一步探究糖基化修飾過程中的影響因素，并對生產流程進行調整，以保證產品質量達到預定標準。

5 氨基酸分析技術發展動向及前景

5.1 新型氨基酸分析技術研究與發展動態

近幾年，氨基酸分析技術發展迅速。例如，高效液相色譜技術分辨率、靈敏度高，將其與熒光檢測及紫外檢測相結合，可實現復雜樣品氨基酸的準確測定；質譜技術，包括液相色譜-質譜聯用（LC-MS）和毛細管電泳-質譜聯用（CE-MS）等，可以提供更為全面的氨基酸序列信息及翻譯后修飾狀態等信息，具有高通量、高精度等特點。此外，串聯質譜（MS/MS）、多維蛋白質組學技術等生物質譜新技術，也為氨基酸分析提供了更深入的可能。

①液相色譜-質譜聯用技術，將高效液相色譜技術與質譜技術相結合，是氨基酸定量和定性分析的重要方法，其經過樣品預處理，衍生化技術及色譜分離條件等優化后，可準確確定蛋白質水解產物氨基酸成分。同時，串聯質譜技術進一步增強了對氨基酸序列信息和翻譯后修飾位點的識別能力。②毛細管電泳-質譜聯用技術，對氨基酸等小分子的快速分離，具有高分辨率、靈敏度高的特點，特別適合復雜生物樣品痕量氨基酸的測定，以及對異構體、同分異構體和其他精細結構的判別[5]。③以芯片為核心的微流控技術，可以對樣品進行微型化處理分析，極大地減少樣本及試劑的消耗，提高分析速度。④多維度蛋白質組學技術將生物質譜、核磁共振（NMR）技術、蛋白質組學數據庫和計算生物學方法相結合，為氨基酸組成綜合表征提供了一種新的可能性，其既能揭示蛋白質一級結構信息，又能對蛋白質相互作用及其功能狀態進行深入研究。

5.2 將氨基酸分析用于重組蛋白類生物制品質量控制的思路

隨著氨基酸分析技術的不斷發展與進步，其對重組蛋白類生物制品的質量控制作用也愈加突出。一方面，未來有望出現更多針對特殊氨基酸位點（磷酸化、糖基化、甲基化）的特異性分析方法，有助于重組蛋白的翻譯后修飾進行全面準確的表征；另一方面，將大數據與人工智能技術相結合，氨基酸分析數據可望形成更加系統化的質量評價體系，以提升產品質量評估智能化程度。與此同時，以單分子分析或者實時監測為基礎的新型氨基酸分析技術，有望用于生產過程監控以實現重組蛋白在合成、折疊和修飾等環節中的動態跟蹤，可有效優化生產工藝，保證產品質量穩定。

總之，隨著科學技術的進步，氨基酸分析用于重組蛋白類生物制品的質量控制，將會更廣泛、更深入。通過開發更敏感、特異性更強的質譜技術及手段，有望實現蛋白質糖基化、磷酸化、乙酰化及其他復雜翻譯后改造過程的準確定位及定量分析，對于評價重組蛋白的活性和藥效，意義重大。

6 結語

氨基酸分析是評價重組蛋白類生物制品核心性質的一種關鍵技術手段，對于質量控制過程具有重要影響。因此，加大對氨基酸分析技術的研發力度，是增強重組蛋白類生物制品質量控制能力、保障公共健康與生命安全的戰略措施之一。