豆腐柴果實中黃酮類成分的電化學檢測

王永泰　王　炎　楊　朝　高集源　王雙凱　劉召娜

豆腐柴果實中黃酮類成分的電化學檢測

王永泰王炎楊朝高集源王雙凱劉召娜

（西安培華學院醫學院陜西西安710125）

豆腐柴的根、莖、葉、果實中不僅含有大量的果膠、粗纖維、蛋白質，而且含有豐富的礦物質和黃酮類物質，具有很高的藥用價值。目前對豆腐柴的研究主要集中在其根、莖、葉上，而對其果實的研究較少。文章采用乙醇回流、石油醚萃取的方法對豆腐柴果實中的黃酮類成分進行提取，通過電化學法對所提取的黃酮類成分進行檢測。

豆腐柴；果實；總黃酮；電化學法；檢測

豆腐柴（Turcz.）全身都是寶，其根、莖、葉、果實都具有較好的開發利用價值。豆腐柴葉顏色翠綠，葉汁凝膠持水力強、黏彈性好[1]，含有大量的粗纖維、果膠、維生素C和氨基酸等[2-3]，可被制作成柴豆腐[4]，具有較高的營養價值。除此之外，豆腐柴莖葉提取物有抗炎、鎮痛、改善微循環、保護坐骨神經和治療軟組織損傷的作用[5-6]。如以豆腐柴為主要原料制備的復方豆腐柴搽劑具有明顯的消腫、止痛、抗炎和增強免疫的功能。在廣西，豆腐柴已被制作成健骨注射液，用來治療肥大性脊椎炎、風濕性關節炎、肩周炎等多種骨科疾病。豆腐柴的這些功能可能和其所含有的黃酮類成分有關[7-8]。黃酮類化合物廣泛存在于自然界的植物中，具有降壓、抗癌、抗炎以及降血糖等藥理活性。

目前對于豆腐柴中的黃酮類成分的研究主要集中在其根、莖、葉上[9]，而豆腐柴果實中的活性成分及其藥理作用還沒有被很好地挖掘出來。因此，本研究對豆腐柴果實中的黃酮類成分進行提取和檢測，挖掘豆腐柴果實的藥用價值，為合理地開發利用豆腐柴資源提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原料：豆腐柴果實，2022年7月采于陜西省。

化學試劑：無水乙醇、石油醚、氫氧化鈉、磷酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁、鹽酸、濃鹽酸、鋅粉、鎂粉等，均為分析純。

1.2 儀器設備

提取和檢測所用儀器設備：高速萬能粉碎機、旋轉蒸發儀、循環水式多用真空泵、電化學分析儀（CHI660）、調溫電熱套、金相砂紙、超聲清洗儀、超純水機。

1.3 試劑配制

蘆丁標準溶液配制：稱取干燥至恒重的蘆丁標準品0.02 g置于小燒杯中，用體積分數為75%的乙醇進行溶解，定容至50 mL容量瓶中，得到蘆丁標準溶液（4 ℃冰箱避光保存）。

pH為2的磷酸鹽緩沖液配制：稱取磷酸58.5 g、磷酸二氫鈉48 g，在充分攪拌的情況下，加水定容至1 L得到pH為2的磷酸鹽緩沖液。

1.4 實驗方法

1.4.1 豆腐柴果實中總黃酮提取液的制備

將新鮮采摘的豆腐柴果實洗凈、晾曬、烘干（50 ℃）至恒重，用粉碎機粉碎，將粉碎后的豆腐柴粉末收集備用。稱取豆腐柴果實粉末15.00 g，加入體積分數為75%的乙醇150 mL，搭建回流裝置，加熱回流提取1 h。然后進行抽濾，收集濾液。將濾渣再加入圓底燒瓶中，加入體積分數為75%的乙醇150 mL，用上述同樣方法加熱回流提取1 h，抽濾，將兩次濾液合并，棄去濾渣。將合并的濾液倒入500 mL圓底燒瓶中，放置在旋轉蒸發儀上進行提取凝縮至90 mL左右，停止加熱。再用石油醚進行萃取，靜止10 min使其分層，下端液體放出，則得到豆腐柴果實總黃酮提取液。將提取液轉入100 mL容量瓶中，并用體積分數為60%的乙醇進行定容，保存備用（4 ℃冰箱進行保存）。

1.4.2 顯色反應

為了確定提取液中是否含有黃酮類成分，利用鹽酸鎂粉反應對本提取液進行檢測。這一反應是鑒定黃酮類化合物最常用的顯色反應。該方法步驟是先加入鎂粉（或鋅粉）振搖，然后再加入濃鹽酸。大多數黃酮類化合物、類黃酮、二氫黃酮和二氫黃酮醇反應后會顯現橙紅色至紫紅色，少數顯現紫色或藍色。當其B環有羥基（—OH）或甲氧基（—OCH3）取代時，顏色會變深。取5 mL豆腐柴提取液放入試管中，用藥匙取半勺鎂粉加入其中，輕微振搖，再加入少許濃鹽酸，觀察提取液的顏色變化。

1.4.3 電化學法檢測蘆丁標準曲線建立

電化學實驗采用三電極體系，以玻碳電極作為工作電極，飽和甘汞電極作為參比電極和鉑電極作為對電極。用金相砂紙對玻碳電極表面進行打磨拋光處理，再進行超聲清洗3 min，自然晾干。取50 mL磷酸鹽緩沖液（pH=2），倒入電解池中。將三電極體系電極插入電解池中（在電解液表面以下1 cm）。取上述蘆丁標準溶液以每30 μL的梯度加入電解液中（0、30、60、90、120、150、180 μL），觀察電極產生的氧化還原峰電流強度。以峰電流值（A）為縱坐標，以蘆丁標準品的質量濃度（mg/mL）為橫坐標，繪制標準曲線。

2 實驗結果與討論

2.1 電化學法檢測蘆丁標準曲線的建立

蘆丁作為黃酮類物質的標準品，本實驗將利用電化學法建立檢測蘆丁的標準曲線[10-12]。電化學法是利用玻碳電極作為工作電極，以磷酸鹽溶液作為緩沖液，通過加入蘆丁標準品進行電化學檢測。蘆丁的化學式如圖1，它含有5-羥基黃酮和鄰位二元醇結構，可以與不同的金屬離子形成特定位點的復合物，蘆丁含有電活性基團，具有良好的電化學信號，這是因為蘆丁的B環的羥基能夠發生氧化反應，生成苯醌式結構[10]。蘆丁標準品在玻碳電極上會有良好電化學信號。

圖1　蘆丁B環上的3′和4′位置羥基發生的氧化反應

在pH為2的磷酸鹽緩沖溶液中，利用玻碳電極作為工作電極建立蘆丁標準品檢測的標準曲線。如圖2所示，掃描電位區間是0～0.8 V，掃描速度為0.05 V/s。可以觀察到在電位0.5～0.6 V時有一對可逆的氧化還原峰。在0.55 V處出現一個較好的還原峰，在0.57 V處出現一個氧化峰，對應著蘆丁的氧化還原反應。隨著蘆丁的質量濃度在2.4×10-4～14.4×10-4mg/mL范圍變化，其位于0.55 V處的還原峰電流不斷增大，位于0.57 V的氧化峰電流也不斷增大。這說明蘆丁在玻碳電極上的氧化還原信號隨著其質量濃度的增大而增大，具有良好的響應信號。將不同質量濃度下的氧化峰電流與質量濃度進行數據分析總結，可以得到表1。

圖2　玻碳電極在含有一系列不同質量濃度蘆丁標準品的磷酸鹽緩沖液（pH=2）中的循環伏安圖

（注：掃描速度為0.05 V/s）

表1　不同質量濃度的蘆丁標準品產生的氧化峰相對電流

根據蘆丁標準品質量濃度與其在玻碳電極上產生的氧化峰電流的關系，繪制出標準曲線如圖3所示，測定蘆丁標準品線性回歸方程為（μA）=0.183 3（10-4mg/mL）+0.99，2=0.991 5。蘆丁標準品質量濃度在2.4×10-4～14.4×10-4mg/mL范圍時，氧化峰電流與其質量濃度呈現良好的線性關系。因此，可以利用該線性關系對豆腐柴果實中的黃酮類成分進行檢測。

圖3　玻碳電極檢測蘆丁標準品的氧化峰相對電流與質量濃度之間的線性關系

2.2 豆腐柴果實中黃酮類成分的檢測

2.2.1 顯色反應

本實驗豆腐柴果實中的黃酮類成分是采用加熱回流法進行提取的。為了確定提取液中是否含有黃酮類成分，首先利用鹽酸鎂粉反應對提取液進行檢測，取5 mL豆腐柴果實總黃酮提取液放入試管中，用藥匙取半勺鎂粉加入，輕微振搖，再加入少許濃鹽酸，溶液由黃色變成紅色（見圖4），證明該提取液中含有黃酮類成分。然后，再進一步對提取液中的黃酮類成分進行檢測。

圖4　豆腐柴果實提取物的鹽酸鎂粉顯色反應

2.2.2 電化學法檢測豆腐柴果實提取液中黃酮類成分的含量

取10 μL豆腐柴果實提取液，加到50 mL磷酸鹽緩沖液中，利用玻碳電極在相同的條件下進行電化學實驗測試，得到氧化峰電流為3.1 μA，根據蘆丁標準曲線計算得出50 mL磷酸鹽緩沖液中黃酮類成分的質量濃度為11.5×10-4mg/mL，通過計算可得15 g豆腐柴果實中黃酮類成分的質量分數為3.8%。

為了驗證該實驗方法是否準確，實驗中對樣品進行了電化學法的加標回收實驗。取一定量的豆腐柴果實提取液，加入一定量的蘆丁標準品溶液，搖勻，按樣品測定方法測定，計算回收率（= 4），結果平均回收率為100.9%，表明該方法較準確可靠。

3 結論

為了檢測豆腐柴果實中黃酮類成分的含量，本研究采用加熱回流提取法對豆腐柴果實中黃酮類成分進行提取，并利用電化學法對豆腐柴果實中黃酮類成分進行檢測。蘆丁標準品質量濃度在2.4×10-4～14.4×10-4mg/mL范圍時，電化學信號與其質量濃度之間呈現良好的線性關系。因此，利用該線性關系對豆腐柴果實中的黃酮類成分進行檢測，結果表明豆腐柴果實中黃酮類成分的質量分數為3.8%。電化學法具有成本低、簡便、快速的優點，可以用于黃酮類物質的檢測。

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10.3969/j.issn.2095-1205.2024.03.28

TQ28

B

2095-1205(2024)03-89-04

西安培華學院大學生創新創業訓練計劃項目“豆腐柴果實中黃酮類化學成分研究”（PHDC2022070）

王永泰（2000—），男，漢族，甘肅定西人，本科在讀，研究方向為藥學。

劉召娜（1983—），女，漢族，山東日照人，博士研究生，副教授，研究方向為藥物分析與檢測。