硫酸鋅脅迫對萌發青稞功能成分及抗氧化能力的影響

徐寧莉,陶瑾,張莉方,張國強

(安徽工程大學 生物與食品工程學院,安徽 蕪湖,241000)

青稞,俗稱裸大麥,屬禾本科植物,是青藏高原的第一大作物,有著悠久的種植歷史。隨著全球經濟快速發展,人們生活質量得到改善,但同時也面臨著糖尿病、冠心病等慢性病的挑戰,而青稞因具有“三高兩低”(高蛋白、高纖維、高維生素、低糖、低脂肪)的飲食結構[1],并集食用、藥用、飼用、釀造于一身[2-4],具有極高的營養和食療價值,近年來深受廣大消費者青睞。

據報道,萌發使種子中貯存的各種物質被轉化和提升以供新生命利用,其營養物質和藥用價值顯著增加[5],谷類作物在經浸泡萌發后,酶活性顯著增加,加快了活性物質的積累并提高了其抗氧化能力[6]。谷物也是重要的微量營養素——鋅的來源,在多種用于富集鋅含量的化學形式中,硫酸鋅因其成本低、溶解度大而被廣泛使用[7]。ARNAO等[8]發現1.0 mmol/L硫酸鋅對大麥根系的褪黑素含量有顯著提高作用。ZHANG等[9]發現在蘋果發育階段噴施硫酸鋅可顯著提高蘋果的可溶性糖含量。朱雪豐[10]、CAO[11]發現噴施適宜濃度的硫酸鋅有利于提高植物的抗氧化能力。趙爽等[12]發現,硫酸鋅提高了不結球大白菜的酚類物質含量,但對芽苗會造成生長脅迫。梁雨荷等[13]發現,青稞在萌發期間,總黃酮含量呈上升趨勢,但β-葡聚糖含量呈下降趨勢。曾晴等[14]發現,適當濃度的鹽脅迫可以提高發芽大豆的γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)的富集量。

由于青稞生長環境特殊、分布范圍有限,目前國內外關于青稞的研究甚少,且主要集中于青稞籽粒的營養成分測定及活性成分提取等方面,脅迫萌發處理對青稞影響的研究鮮有報道。因此本實驗重點研究了不同濃度硫酸鋅脅迫對萌發青稞的褪黑素、β-葡聚糖等含量及抗氧化能力的影響。這些研究有助于了解青稞功能成分與抗氧化能力之間的關系,并為青稞功能性食品的開發提供了數據支撐和理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本實驗所使用青稞品種為藏青2000,由西藏自治區農牧科學院提供。

高錳酸鉀、硫酸鋅、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、Folin-酚、無水碳酸鈉、蘆丁標準品(純度≥98%)、沒食子酸標準品(純度≥98%)、無水葡萄糖、蒽酮,國藥集團化學試劑有限公司;3,5-二硝基水楊酸、6-羥基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸(6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid,Trolox,純度≥98%)、DPPH、ABTS,上海阿拉丁生化科技有限公司;PLANT MT ELISA KIT、PLANT β-GLUCANS ELISA KIT、PLANT GABA ELISA KIT上海橋杜生物科技有限公司。實驗用水為超純水。

1.2 儀器與設備

YRG-150種子發芽箱,上海合恒儀器設備有限公司;LGJ-12真空冷凍干燥機,北京松源華興科技有限公司;FW100高速粉碎機,天津市斯泰特儀器有限公司;D3024R臺式高速冷凍型微量離心機,北京大龍興創實驗儀器有限公司;酶標儀SPECTRAMAX M5,上海賽默飛世爾儀器有限公司;UV-5200紫外可見分光光度計,上海元析儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 種子萌發

稱取約300 g藏青2000種子,用1 g/L高錳酸鉀溶液消毒5 min,純水洗凈并浸泡10 h使種子水合,在不同濃度硫酸鋅溶液(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L)下萌發7 d(25 ℃,避光),同時記錄其萌發率與麥苗生長情況。每24 h取長勢一致的青稞麥苗,經真空冷凍干燥,粉碎后過80目篩,低溫貯存備用。種子(Seed)經10 h浸泡,對照組為水萌發(即硫酸鋅濃度為0 mmol/L)。

1.3.2 樣品提取液的制備

根據朱雪洋等[15]的方法制備的樣品提取液用于褪黑素、β-葡聚糖、γ-氨基丁酸、總黃酮、總酚含量及抗氧化能力的測定。根據高俊鳳[16]的方法制備的樣品提取液用于還原糖、可溶性糖含量的測定。

1.4 測定指標及方法

1.4.1 功能成分的測定

1.4.1.1 褪黑素含量的測定

褪黑素含量(melatonin content,MTC)采用雙抗體一步夾心法免疫吸附試驗(enzyme linked immune sorbent assay,ELISA)測定,操作步驟嚴格按照PLANT MT ELISA KIT試劑盒說明書進行。以標準品濃度為橫坐標,吸光值為縱坐標繪制標準曲線。

1.4.1.2 β-葡聚糖含量的測定

β-葡聚糖含量(β-glucans content,GC)測定方法同1.4.1.1節操作步驟嚴格按照PLANT β-GLUCANS ELISA KIT試劑盒說明書進行。以標準品濃度為橫坐標,吸光值為縱坐標繪制標準曲線。

1.4.1.3 γ-氨基丁酸的測定

GABA測定方法同1.4.1.1節操作步驟嚴格按照PLANT GABA試劑盒說明書進行。以標準品濃度為橫坐標,吸光值為縱坐標繪制標準曲線。

1.4.1.4 總黃酮、總酚含量的測定

總黃酮含量(total flavonoid content,TFC)的測定根據WANG等[17]的方法略作修改。50 μL提取液加20 μL 5%(質量分數)亞硝酸鈉溶液靜置6 min,加20 μL 10%(質量分數)硝酸鋁溶液靜置6 min,加200 μL 4%(質量分數)氫氧化鈉溶液避光反應15 min,510 nm處測定吸光值。以蘆丁濃度為橫坐標,吸光值為縱坐標繪制標準曲線。

總酚含量(total phenolic content,TPC)的測定根據SHEN等[18]的方法略作修改。在30 μL提取液中添加20 μL Folin-酚試劑靜置反應6 min,再加入100 μL 7%(質量分數)碳酸鈉溶液,調整最終體積為290 μL。避光反應60 min于765 nm處測定吸光值。以沒食子酸濃度為橫坐標,吸光值為縱坐標繪制標準曲線。

1.4.1.5 還原糖、可溶性糖含量的測定

3,5-二硝基水楊酸法[16]測定還原糖含量(reducing sugar content,RSC)、蒽酮-硫酸法[16]測定可溶性糖含量(soluble sugar content,SSC)。以葡萄糖含量為橫坐標,吸光值為縱坐標繪制標準曲線。

1.4.2 抗氧化能力的測定

參考孟想等[19]的方法對樣品分別進行了DPPH自由基清除能力、ABTS陽離子自由基清除能力和鐵還原/抗氧化能力(ferric reducing/antioxidant power,FRAP)的測定。以Trolox濃度為橫坐標,吸光值為縱坐標繪制標準曲線,結果以生育酚的水溶性維生素E的衍生物Trolox當量計(mg Trolox equivalent/g)。

1.5 統計分析

樣品組均設3組重復,以平均值±標準差表示。使用SPSS 20.0軟件進行顯著性分析;Origin 2021軟件進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 硫酸鋅脅迫對萌發青稞萌發率、水分含量、根長及芽長的影響

圖1為不同濃度硫酸鋅脅迫下青稞從萌發前(種子,seed)到第7天生長情況。青稞種子在第1天生長出根,第2天萌發出幼苗。根是植物最先感知生長環境的器官,硫酸鋅脅迫能夠抑制作物根和根上部分生長,造成植物生長發育遲緩,致使幼苗主根變短、芽苗變短。

圖1 硫酸鋅脅迫下青稞幼苗生長情況

圖2為不同濃度硫酸鋅脅迫對萌發青稞萌發率、水分含量、根長和芽長的影響。結果表明,同一萌發時間下,青稞的萌發率隨著硫酸鋅濃度的增加而略有降低;同一硫酸鋅濃度下,萌發率隨著時間的延長先增加后不變;0～2 d為萌發高峰期,第4天達到平衡,未萌發的種子不再繼續萌發。同一萌發時間內,硫酸鋅濃度越大,水分含量越低、根越短、芽越短;同一硫酸鋅濃度下,萌發時間越長,水分含量越高、根越長、芽越長。

a-萌發率;b-水分含量;c-根長;d-芽長

2.2 硫酸鋅脅迫對萌發青稞褪黑素含量的影響

如圖3所示,隨著時間的延長,在不同濃度硫酸鋅脅迫下,萌發青稞褪黑素含量先上升后下降。其中,0.8 mmol/L硫酸鋅脅迫萌發第6天時褪黑素含量達到最大為(13.227±0.119) ng/g,是種子的2.50倍、同條件下對照組的1.35倍。種子萌發后逐漸生長出根和芽苗,形成了大量的細胞質和葉綠體,而細胞質和葉綠體是植物產生褪黑素的重要場所[20],所以褪黑素合成加快。第7天褪黑素含量降低可能是由于人工模擬的生長環境在生長后期不能給予青稞最佳生長條件,缺乏光照、土壤等生長因素,不利于褪黑素的合成。此外,ZHANG等[21]的研究表明,鹽脅迫誘導了萌發青稞蛋白質組的全面變化,改變了與褪黑素相關的蛋白質的表達與豐度,與滲透脅迫反應相關的蛋白質及代謝產物顯著增加,這可能是鹽脅迫下萌發青稞褪黑素含量增加的原因。

圖3 硫酸鋅脅迫對萌發青稞褪黑素含量的影響

2.3 硫酸鋅脅迫對萌發青稞β-葡聚糖含量的影響

如圖4所示,隨著時間的延長,在不同濃度硫酸鋅脅迫下,萌發青稞β-葡聚糖含量先降低后緩慢升高。其中,低濃度硫酸鋅會加快萌發青稞的β-葡聚糖含量降解,但當硫酸鋅濃度達1.0 mmol/L時卻能夠有效抑制其降解。李婷玉等[22]也發現,在Zn2+脅迫下,青稞萌發后β-葡聚糖含量發生降解,但降解量隨著金屬離子濃度的增加而降低。種子在萌發前期中β-葡聚糖含量降低是因為萌發使種子分泌大量赤霉素,合成葡聚糖酶,水解青稞細胞間的β-葡聚糖[23];而萌發后期麥苗萌發完全,葡聚糖合成酶活性高于葡聚糖酶,β-葡聚糖含量有增加趨勢。

圖4 硫酸鋅脅迫對萌發青稞β-葡聚糖含量的影響

2.4 硫酸鋅脅迫對萌發青稞GABA含量的影響

如圖5所示,隨著時間的延長,在不同濃度硫酸鋅脅迫下,萌發青稞GABA含量先上升后下降。其中,0.8 mmol/L硫酸鋅脅迫萌發第6天時GABA含量達到最大為(30.280±0.891) μmol/g,是種子的2.15倍、對照組的1.40倍。據報道[24],植物中GABA的富集與脅迫應激反應有關,鹽堿等逆境脅迫下GABA含量會迅速積累。萌發前期種子中的蛋白酶未被充分激活,而隨著萌發時間的延長,蛋白質被水解形成了谷氨酸,谷氨酸在谷氨酸脫羧酶的作用下生成GABA,GABA在GABA轉氨酶的催化下轉化為琥珀酸半醛,最后形成琥珀酸[25],故而在萌發期間GABA含量呈先上升后下降趨勢。

圖5 硫酸鋅脅迫對萌發青稞GABA含量的影響

2.5 硫酸鋅脅迫對萌發青稞總黃酮、總酚含量的影響

圖6為不同濃度硫酸鋅脅迫對萌發青稞總黃酮、總酚含量的影響。結果表明,隨著時間的延長,在不同濃度硫酸鋅脅迫下,萌發青稞的總黃酮、總酚含量先下降后上升。1～3 d總黃酮、總酚含量降低的原因可能是由于前3 d是胚根生長的關鍵期,胚根中的總黃酮、總酚含量較低,故而影響到整棵麥苗的總黃酮、總酚含量。李有媛等[26]也發現不同品種的芹菜基部與其他部位相比含有的總黃酮、總酚含量最低。萌發后期總黃酮、總酚含量的增加可能是由于青稞芽苗的迅速增長激活了葡萄糖苷酶催化糖苷的分解,加快了黃酮及酚類物質的生物合成。其中,0.8 mmol/L硫酸鋅脅迫萌發第7天時總黃酮含量達到最大為(1.479±0.032) mg/g,是種子的2.03倍、對照組的1.28倍;0.6 mmol/L硫酸鋅脅迫萌發第7天時總酚含量達到最大為(7.179±0.170) mg/g,是種子的1.87倍、對照組的1.12倍。研究發現[27],鹽分會誘導植物氧化脅迫,促使植物產生氧化應激反應,而黃酮及酚類化合物具有強大的抗氧化性能,故適當濃度的鹽脅迫會促進萌發青稞中總黃酮、總酚含量的增加。

a-總黃酮含量;b-總酚含量

2.6 硫酸鋅脅迫對萌發青稞還原糖、可溶性糖含量的影響

圖7為不同濃度硫酸鋅脅迫對萌發青稞還原糖、可溶性糖含量的影響。結果表明,隨著時間的延長,在不同濃度硫酸鋅脅迫下,萌發青稞的還原糖、可溶性含量先上升后達到動態平衡。萌發提高了谷物種子中的酶活力,難溶的大分子淀粉在酶的作用下被分解成小分子糖,從而導致還原糖、可溶性糖含量顯著增加。而當多糖物質被水解后,還原糖、可溶性糖作為谷物幼苗生長的能源物質被逐漸消耗,因此在萌發后期達到動態平衡甚至有下降趨勢。其中,對照組萌發第6天時還原糖含量達到最大為(19.079±0.073)%,是種子的112.23倍;0.4 mmol/L硫酸鋅脅迫萌發第7天時可溶性糖含量達到最大為(25.479±0.735)%,是種子的7.78倍、對照組的1.24倍。與對照組相比,硫酸鋅脅迫降低了萌發青稞還原糖含量,這可能是因為硫酸鋅脅迫抑制了萌發青稞胚根的生長,故而向外輸出糖分的速率有所下降。而當植物為緩解因鹽脅迫而帶來的生理代謝不平衡等傷害時,會在細胞內積累可溶性糖等滲透調節物質以維持植物細胞正常生理功能[28],故適當濃度的硫酸鋅脅迫有助于提高萌發青稞的可溶性糖含量。

2.7 硫酸鋅脅迫對萌發青稞抗氧化能力的影響

本實驗分別采用了DPPH法、ABTS法和FRAP法分析了硫酸鋅脅迫對萌發青稞抗氧化能力的影響。如圖8-a、圖8-c所示,隨著時間的延長,在不同濃度硫酸鋅脅迫下,萌發青稞的DPPH自由基清除能力與FRAP還原能力均呈先下降后上升趨勢,與總酚含量的變化規律一致。其中,0.6 mmol/L硫酸鋅脅迫萌發第7天時DPPH自由基清除能力與FRAP還原能力均達到最大,分別為(0.713±0.007)、(1.308±0.006) mg Trolox equivalent/g;是種子的1.40、2.05倍;對照組的1.20、1.14倍。如圖8-b,隨著時間的延長,在不同濃度硫酸鋅脅迫下,萌發青稞的ABTS陽離子自由基清除能力總體呈上升趨勢。0.8 mmol/L硫酸鋅脅迫萌發第7天時ABTS陽離子自由基清除能力達到最大,為(1.863±0.011) mg Trolox equivalent/g,是種子的1.86倍、對照組的1.07倍。

a-DPPH自由基清除能力;b-ABTS陽離子自由基清除能力;c-FRAP還原能力

盡管3種分析方法的機理并不完全相同,但結果一致表明:與對照組相比,0.6～0.8 mmol/L的硫酸鋅對萌發青稞的抗氧化能力有提升作用。在已有文獻中發現了類似的結果,如BOUDALI等[29]發現2 mmol/L硫酸鋅可以顯著提高大花蕙蘭葉片和根的抗氧化能力。

2.8 硫酸鋅脅迫對萌發青稞還原糖、可溶性糖含量的影響

表1為硫酸鋅脅迫下萌發青稞功能成分及抗氧化能力的相關性分析結果。其中,褪黑素、GABA、還原糖和可溶性糖含量均與ABTS陽離子自由基清除能力顯著正相關(P<0.01);還原糖含量與FRAP還原能力顯著正相關(P<0.01);總黃酮、總酚含量均與DPPH自由基清除能力、ABTS陽離子自由基清除能力、FRAP還原能力顯著正相關(P<0.01)。這說明褪黑素、GABA、還原糖和可溶性糖含量是萌發青稞ABTS陽離子自由基清除能力的主要貢獻者;總黃酮和總酚含量是萌發青稞主要的抗氧化活性物質。

表1 硫酸鋅脅迫下萌發青稞功能成分及抗氧化能力的相關性分析Table 1 Correlation analysis of functional constituents and antioxidant capacity of germinated barley under zinc sulfate stress

3 結論

隨著時間的延長,在不同濃度硫酸鋅脅迫下,萌發青稞的萌發率先增加后不變,水分含量、根長及芽長均呈上升趨勢;且硫酸鋅濃度越大,萌發率及水分含量越低,根長及芽長越短,相關分析結果表示四者間顯著正相關(P<0.01,R2=0.594～0.920)。褪黑素、GABA含量先增加后降低;還原糖、可溶性含量先上升后達到動態平衡;β-葡聚糖、總黃酮及總酚含量先降低后升高。其中,0.4 mmol/L硫酸鋅脅迫萌發第7天時可溶性糖含量達到最大為(25.479±0.735)%,是對照組的1.24倍;0.6 mmol/L硫酸鋅脅迫萌發第7天時總酚含量達到最大為(7.179±0.170) mg/g,是對照組的1.12倍;0.8 mmol/L硫酸鋅脅迫萌發第6天時褪黑素與GABA含量達到最大、第7天時總黃酮含量達到最大,分別為(13.227±0.119) ng/g、(30.280±0.891) μmol/g、(1.479±0.032) mg/g,分別是對照組的1.35、1.40和1.28倍。

抗氧化能力結果顯示,0.6、0.8 mmol/L的硫酸鋅脅迫使得萌發青稞具有更好的抗氧化能力。以上結果揭示了萌發是改善種子品質的一種加工方式,硫酸鋅作為一種化學形式的脅迫可有效提高萌發青稞的褪黑素、GABA、總黃酮和總酚等功能性成分的含量及抗氧化能力,表示萌發青稞可以作為一種天然的抗氧化食品原料,這也為青稞功能性相關食品的開發提供了數據支撐和理論參考。