太子參改善斑馬魚和APP/PS1小鼠學(xué)習(xí)記憶

豐心月,王奕霏,鄧嘉航,何傳統(tǒng),蔣嘉慧,楊志友,2*

1(廣東海洋大學(xué) 食品科技學(xué)院,廣東 湛江,524088)

2(廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)品加工與安全重點實驗室,廣東 湛江,524088)

太子參,又稱孩兒參,是中國傳統(tǒng)中藥,該名最早被記載于1757年的《本草從新》中,目前已被衛(wèi)生部列入“可用于保健食品的中藥材名單”[1]。與人參同效,但藥性溫和,有補氣健脾、潤肺生津,補虛養(yǎng)陰的功效,已有近百年的臨床應(yīng)用歷史[2]。太子參的特征性化學(xué)成分多糖、皂苷和環(huán)肽具有免疫調(diào)節(jié)、降血糖、抗腫瘤、神經(jīng)保護、抗炎和抗氧化等藥理作用[3]。研究表明,太子參肽類可以通過Ca2+/CaN/NFATc1/IFNg途徑對脾淋巴細胞進行免疫調(diào)節(jié),從而增強人體免疫力[4];太子參環(huán)肽B(heterophyllin B, HB)通過激活腺苷酸激活蛋白激酶顯著改善腸上皮穩(wěn)態(tài),以腸道微生物群依賴的方式改善結(jié)腸炎癥[5],但是否通過腸-腦軸改善中樞系統(tǒng)疾病尚不明確;太子參復(fù)方顆粒灌胃外周神經(jīng)損傷的動物模型,可以促進外周神經(jīng)損傷的早期修復(fù),促進功能恢復(fù)[6];前期研究發(fā)現(xiàn)HB能顯著增強正常小鼠記憶和認知功能,促進神經(jīng)突起再生,上調(diào)皮層和海馬區(qū)5-羥色胺水平,并調(diào)控多巴胺的代謝[7]。HB還可改善腦室注射Aβ1-42引起的阿爾茨海默病小鼠記憶損傷,調(diào)節(jié)脾臟輔助T細胞功能,并改善神經(jīng)炎癥[8]。

阿爾茲海默癥(Alzheimer′s disease, AD)是最常見的癡呆癥的一種,患者表現(xiàn)出認知功能障礙和記憶缺陷[9-10]。由于其病因復(fù)雜,作用機制尚不明確。目前,美國食品和藥物管理局批準用于AD治療的藥物僅有4種[11-12]。這些藥物僅能緩解癥狀,尚不能治愈或逆轉(zhuǎn)AD的進程,因此,抗AD藥物的研發(fā)或食療預(yù)防是目前亟待研究的課題。AD的主要病理學(xué)標(biāo)志是胞外的β淀粉樣斑塊(β-amyloid plaque, Aβ)和胞內(nèi)神經(jīng)纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles, NFTs)[13]。根據(jù)發(fā)病年齡的不同,可分為早發(fā)性家族性AD(early-onset familial AD, EO-FAD)和晚發(fā)性散發(fā)性AD(late-onset sporadic AD, LO-SAD)[14]。EO-FAD與β淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein, APP)、早老素1、早老素2三個基因的突變密切相關(guān),發(fā)病年齡在30～65歲;LO-SAD多發(fā)于60～65歲,受多因素影響,如年齡、遺傳風(fēng)險因素(如載脂蛋白E和許多其他基因的等位基因變異)、血管疾病、創(chuàng)傷性腦損傷等,是最常見的AD類型[15]。

為探究太子參改善記憶和認知障礙的作用,建立具有臨床AD特征的動物模型是必要的。目前AD動物模型可分為衰老、轉(zhuǎn)基因、物理損傷和化學(xué)損傷模型等。研究表明,APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠皮質(zhì)和海馬發(fā)現(xiàn)Aβ沉積[16],且Aβ的增加伴有神經(jīng)元的損傷、突觸丟失及認知功能障礙等AD樣病理特征[17]。雖然嚙齒動物被廣泛用于神經(jīng)退行性疾病研究,但斑馬魚因其與人類基因組同源性高、繁殖周期短和成本低廉等優(yōu)勢,被作為一種新興的AD模式動物廣泛使用。研究表明,成年斑馬魚腦注射Aβ1-42后,出現(xiàn)神經(jīng)元凋亡、小膠質(zhì)細胞活化、突觸丟失和學(xué)習(xí)障礙等AD病理特征[18]。因此,建立淀粉樣蛋白誘導(dǎo)的成年斑馬魚模型可能為改善記憶藥物和保健食品的研發(fā)開辟新途徑[19]。

1 材料與方法

1.1 材料

太子參產(chǎn)自中國福建,北京同仁堂。太子參環(huán)肽B,上海源葉生物科技有限公司,純度經(jīng)HPLC檢驗大于98%;實驗用野生型小鼠和APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠購自江蘇凌菲生物科技有限公司,護理和實驗方案均按照廣東海洋大學(xué)動物實驗委員會的指導(dǎo)方針(SYXK2 021-0025)執(zhí)行,遵循12 h光暗循環(huán),溫度(22±1) ℃,濕度(55±10)%,自由飲食;斑馬魚,上海佳譽水族館,實驗室保持光暗周期14/10 h,溫度(28±0.5) ℃,養(yǎng)殖水pH=7.0～7.4;UPLC-Q-Exactive系統(tǒng),美國Thermo Fisher Science公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 太子參不同部位的提取

太子參粉末蒸餾水煎煮后過濾、離心、冷凍干燥后得水提取物;太子參粉末在60 ℃條件下經(jīng)85%(體積分數(shù))乙醇超聲提取1 h,過濾,離心,冷凍干燥后得醇提取物。太子參多糖提取用水提醇沉法,太子參粉末經(jīng)40目篩,用蒸餾水微沸提取1 h,木瓜蛋白酶處理濾液,取上清液;上清液和Sevage試劑(氯仿和正丁醇體積比為4∶1)的體積比為1∶1,重復(fù)4次除蛋白,80%乙醇沉淀過夜后得粗多糖。參照LU等[20]的方法提取太子參總環(huán)肽,技術(shù)略有改動,太子參粉末經(jīng)乙酸乙酯超聲提取,提取物用正丁醇溶解,加入等體積40%的氨水萃取后,取正丁醇層,加入體積分數(shù)85%的乙醇除去多糖和其他雜質(zhì),過夜后,取乙醇層,濃縮干燥后得太子參總環(huán)肽。太子參皂苷部位:太子參粉末經(jīng)70%乙醇超聲提取,抽濾,取乙醇層,加入乙醚萃取除脂,再用水飽和的正丁醇萃取,冷凍干燥后得太子參皂苷。

1.2.2 原代皮層神經(jīng)元的培養(yǎng)

取妊娠14 d胎鼠的皮層神經(jīng)元,以2×104cells/well的密度接種于96孔板,神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基、體積分數(shù)為2% B-27、0.6%D-葡萄糖和2 mmol/L的L-谷氨酰胺的培養(yǎng)基培養(yǎng),10 μmol/L Aβ25-35(Sigma)處理建立AD模型。細胞分為空白組(ct)、模型組(veh)、太子參提取物處理組。空白組不做處理,模型組和太子參提取物處理組用Aβ25-35處理建立AD模型,太子參提取物處理組再給予不同濃度進行治療。

1.2.3 存活率的測定

將冷凍干燥的樣品用二甲基亞砜配成100 mg/mL的母液,稀釋1‰后處理細胞,作用于細胞的質(zhì)量濃度為5～100 μg/mL,HB濃度為1～100 μmol/L。對Aβ25-35建立的AD細胞模型用以上藥物不同濃度處理,3 d后,用CCK8試劑盒測定細胞存活率。

1.2.4 熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)

原代皮層神經(jīng)元以8×105cells/well的密度接種于6孔板,加入10 μmol/L Aβ25-35,30 min后加入1、10 μmol/L HB處理,12 h后收集細胞RNA。用Tritol溶液提取RNA,將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,稀釋5倍后,作為熒光定量PCR的樣品使用。p53和caspase3基因的引物序列見表1,ΔΔCt用于計算基因的相對表達量。

表1實驗基因名稱及引物序列Table 1 Experimental of gene names and q-PCR primer sequence

1.2.5 細胞免疫熒光染色

原代皮層神經(jīng)元以8×105cells/well的密度接種于24孔板,分為ct組、veh組、HB(1、10 μmol/L)2個濃度處理組,ct組不做處理,veh組與HB組加入10 μmol/L Aβ25-35建立細胞AD模型。用一抗MAP2標(biāo)記樹突, β3-tubulin標(biāo)記突起,DAPI標(biāo)記細胞核。Image J軟件統(tǒng)計細胞熒光強度。

1.2.6 動物實驗

將HB溶解于5%(體積分數(shù))二甲基亞砜的生理鹽水中。小鼠實驗分為3組:空白組(CT)、模型組(V)、給藥組(V+HB),空白組為6月齡野生型小鼠,模型組和治療組為APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠;空白組和模型組每天腹腔注射生理鹽水,治療組腹腔注射HB溶液,HB濃度為10 μmol/kg,持續(xù)給藥2個月。后續(xù)進行曠場運動試驗、新物體識別和新位置識別實驗,每組使用9～10只小鼠。斑馬魚在實驗中環(huán)境適應(yīng)2周后,設(shè)置假手術(shù)組(Sham)、模型組(Veh)、太子參醇提物低濃度組(L, 13 mg/kg)、中濃度組(M, 26 mg/kg)和高濃度組(H, 39 mg/kg)。假手術(shù)組斑馬魚注射1 μL PBS,模型組腦室注射1 μL PBS溶解的Aβ1-42(20 μmol/L,Sigma)建立AD樣急性毒性模型[21-22],每組11尾斑馬魚,第5天開始進行新物體識別實驗和獎勵記憶實驗。

UPLC-MS/MS實驗:太子參水提取物溶解于蒸餾水,空白組小鼠灌胃蒸餾水,治療組灌胃太子參水提物溶液,給藥劑量為10 g/kg,給藥1 h后,用生理鹽水灌流后取大腦皮層。腦組織加入1.2 mL甲醇,充分研磨勻漿,14 000×g離心10 min,取上清液,回收溶劑,加入100 μL的甲醇復(fù)溶,離心取上清液進UPLC-MS/MS分析。

UPLC條件:色譜柱為YMC-Pack-ODS-AQ(2.0 mm×150 mm,3 μm),柱溫35 ℃,流速0.2 mL/min,進樣量4 μL,流動相A為0.1%甲酸水溶液,B為乙腈。梯度洗脫條件如下:0～20 min,5%～95% B;20～22 min,95% B;22～24 min,95%～5% B;24～30 min,5% B。

MS條件:離子源為電噴霧離子源,正負離子切換采集模式和Full Scan/dd-MS2掃描模式,正、負極電壓為3.2 kV,毛細管溫度320 ℃,鞘氣流速35 Arb,輔氣流速15 Arb,掃描范圍200～3 000 kDa。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

2 結(jié)果與分析

2.1 太子參醇提物改善Aβ1-42腦室注射斑馬魚探索能力和記憶障礙

首先利用Aβ1-42腦室注射的斑馬魚模型,評價太子參對記憶的改善作用。結(jié)果如圖1所示,在新物體識別實驗中,Veh組相較于Sham組進入新臂的潛伏期顯著增加,在新臂的游動路程和停留時間顯著減少,表明成功建立斑馬魚記憶損傷模型。太子參醇提物低、中、高3個濃度均顯著降低斑馬魚潛伏期,其中,高濃度醇提物顯著增加斑馬魚在新臂的游動路程和停留時間(P<0.05);在獎勵記憶實驗中,與Sham組相比較,Veh組進入獎勵臂的潛伏期顯著增加(P<0.05),而進入獎勵臂的次數(shù)和在獎勵臂游動路程顯著減少,中和高濃度太子參醇提物處理后斑馬魚進入獎勵臂次數(shù)顯著增加(P<0.05)。結(jié)果表明,太子參醇提物具有顯著的記憶改善作用。

A-斑馬魚到達新臂的潛伏期;B-斑馬魚在新臂游動的總路程;C-斑馬魚進入新臂的次數(shù);D-斑馬魚在新臂停留總時長;E-斑馬魚到達獎勵 臂的潛伏期;F-斑馬魚在獎勵臂游動的總路程;G-斑馬魚進入獎勵臂的次數(shù);H-斑馬魚在獎勵臂停留總時長

2.2 太子參對Aβ25-35誘導(dǎo)原代皮層神經(jīng)元損傷的作用

2.2.1 太子參提取物改善原代皮層神經(jīng)元的存活率

為研究太子參對神經(jīng)元的保護作用,建立了Aβ25-35誘導(dǎo)的原代皮層神經(jīng)元損傷模型。結(jié)果如圖2-A所示,與正常的ct組相比,Aβ25-35處理的veh組神經(jīng)元存活率顯著降低,質(zhì)量濃度為5、10 μg/mL的太子參水提物顯著增加神經(jīng)元存活率;太子參醇提物(5～100 μg/mL)均能顯著增加神經(jīng)元存活率,其中25 μg/mL有極顯著作用(P<0.000 1)。

A-實驗流程圖;B-太子參水和醇提物對神經(jīng)元存活率的影響;C-太子參多糖和皂苷對神經(jīng)元存活率的影響;D-太子參環(huán)肽對神經(jīng)元存活率的影響

為進一步研究太子參起神經(jīng)元保護的有效成分,對太子參中的主要成分太子參多糖、皂苷和環(huán)肽類進行神經(jīng)元保護作用評價。如圖2-B、圖2-C所示,100 μg/mL太子參皂苷極顯著增加神經(jīng)元存活率(P<0.000 1),太子參多糖未見顯著性保護作用。1、10 μg/mL太子參總環(huán)肽濃度依賴的顯著增加神經(jīng)元存活率。結(jié)果表明,太子參環(huán)肽和皂苷類成分可能是神經(jīng)元保護作用的有效部位。

2.2.2 太子參入腦成分檢測

為進一步探索太子參的有效作用成分,利用LC-MS技術(shù)研究了太子參的入腦成分。ICR小鼠灌胃給予10 g/kg太子參水提物,1 h后取腦組織進行LC-MS分析,結(jié)果如圖3所示,在腦中檢測到分子質(zhì)量為779的[M+H]+峰,經(jīng)二級質(zhì)譜鑒定為HB,而在對照組中未檢出。在前期研究中,從太子參中共鑒定了32個環(huán)肽類成分,30 min后在血液中檢測到8個環(huán)肽,其中HB是唯一一個能透過血腦屏障進入大腦的原型環(huán)肽類成分[7]。因此,HB可能是太子參環(huán)肽類成分中起神經(jīng)元保護作用的主要化合物。

A-空白組入腦成分檢測;B-給藥組入腦成分檢測

2.2.3 HB改善原代皮層神經(jīng)元的存活率

前期研究發(fā)現(xiàn)太子參環(huán)肽中僅HB在大腦皮層中被檢測到,因此評價了HB對神經(jīng)元的保護作用。如圖4所示,與ct組相比,veh組神經(jīng)元存活率顯著降低(P<0.000 1),不同濃度的HB處理組均能顯著提高神經(jīng)元存活率。

圖4 HB改善Aβ25-35誘導(dǎo)的原代皮層神經(jīng)元的存活率

2.3 HB對APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠學(xué)習(xí)記憶的改善作用

進一步探究HB是否對AD轉(zhuǎn)基因小鼠的記憶有改善作用。如圖5所示,給藥期間各組體重均保持在一個穩(wěn)定水平,與CT組相比,V組的體重增量顯著降低。曠場實驗中,各組小鼠的運動距離無顯著差異,說明HB對小鼠無明顯的毒副作用。在新物體識別實驗中,與CT組相比,V組探索能力顯著降低;與V組相比,HB給藥后小鼠探索能力顯著性增加(P<0.001);與CT組相比,V組新位置探索能力顯著降低,HB給藥后小鼠更傾向探索新位置物體,表明HB顯著增強了AD小鼠的空間記憶(P<0.01)。

A-實驗流程圖;B-小鼠體重增量;C-小鼠曠場實驗運動距離;D-小鼠新物體識別;E-小鼠新位置識別

2.4 HB改善Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡和突起萎縮

為進一步研究HB對記憶改善的作用機制,探索了HB對神經(jīng)元凋亡相關(guān)基因和突起密度的作用。基因表達的結(jié)果如圖6-B、6-C所示,與ct組相比,veh組中凋亡相關(guān)基因p53和caspase3表達顯著升高,1、10 μmol/L HB處理顯著降低凋亡基因的表達(P<0.05)。細胞免疫熒光實驗如圖6-D、6-E所示,veh組與ct組相比,神經(jīng)元樹突和突起顯著萎縮,1、10 μmol/L HB處理后β3-tubulin陽性突起密度顯著增加,而10 μmol/L的HB處理后MAP2陽性樹突密度顯著升高(P<0.01)。

3 結(jié)論與討論

本實驗以太子參為研究對象,發(fā)現(xiàn)太子參能改善腦室注射斑馬魚和APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠的記憶損傷和功能障礙。作為中國傳統(tǒng)中藥,太子參有補氣健脾、潤肺生津的功效,含有多糖、皂苷、環(huán)肽等多種活性成分,具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)、降血糖血脂、改善記憶等藥理作用。HB是環(huán)肽中的特征性成分,有酪氨酸酶抑制、抗炎、抗氧化、神經(jīng)保護等作用,可以透過血腦屏障進入中樞。本文建立了斑馬魚腦室注射急性AD模型評價太子參的記憶改善作用,結(jié)果發(fā)現(xiàn)Aβ處理組斑馬魚對新物體探究的興趣減少,而太子參醇提物處理后,斑馬魚探索新臂潛伏期縮短,探索時間和游動路程延長;Aβ1-42延長斑馬魚進入獎勵臂的潛伏期,而太子參醇提物可以縮短潛伏期,改善斑馬魚記憶障礙。本研究表明HB可以降低凋亡基因caspase3、p53的表達,顯著增加神經(jīng)元存活率和β3-tubulin和MAP2陽性突起密度,增強神經(jīng)元突觸可塑性,進而改善APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠的記憶和認知障礙。

盡管本實驗結(jié)果顯示HB有較好的神經(jīng)元保護和改善記憶障礙的作用,但仍然存在許多不足:從存活率的結(jié)果看,應(yīng)繼續(xù)研究皂苷在神經(jīng)保護上的作用效果;其次應(yīng)繼續(xù)探究HB在凋亡相關(guān)蛋白水平上的影響,在分子層面更有效地證明HB的神經(jīng)保護作用。

目前,美國食品和藥物管理局批準用于治療AD的藥物有加蘭他敏、多奈哌齊、美金剛等。但這些藥物效果不理想、存在一定的肝毒性,而大部分以淀粉樣蛋白為靶點開發(fā)藥物宣告失敗,讓AD藥物研發(fā)步履維艱。一方面,AD病因復(fù)雜,其機制尚不清楚;另一方面,藥物對血腦屏障的滲透性影響藥物的療效[23]。在將來的研究中需進一步明確:a)在蛋白、基因等分子水平上進一步驗證HB的效果;b)更深層次探究HB對神經(jīng)元突起調(diào)控的靶點和作用通路。c)借助藥劑學(xué)研究方法,如納米藥物遞送系統(tǒng)等提高HB的滲透性和在中樞神經(jīng)系統(tǒng)里的生物利用度[24]。本實驗旨在以改善突起萎縮和神經(jīng)保護的角度揭示太子參改善AD的作用機制,為未來AD藥物和保健食品的研發(fā)提供數(shù)據(jù)支持。