佛手多糖對(duì)1-甲基-4-苯基-吡啶離子誘導(dǎo)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤(SH-SY5Y)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用研究

陳進(jìn)炫,龔舒,劉天開,龔記熠,乙引*,劉文華*

1(貴州師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,貴州 貴陽(yáng),550025)

2(肇慶學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院,廣東 肇慶,526061)

佛手又名佛手柑、五指柑、福壽柑等,為蕓香科柑橘屬植物佛手的果實(shí),具有藥食兩用價(jià)值,主要產(chǎn)于我國(guó)的廣東、廣西、四川、浙江、福建等地,其主要活性成分有多糖類、揮發(fā)油類、黃酮類、香豆素類等[1]。不同產(chǎn)地的佛手多糖在種類、單糖組成及結(jié)構(gòu)等方面存在差異,這可能與土壤、氣候和栽培條件等因素有關(guān)[2]。研究顯示,川佛手多糖的單糖組分為鼠李糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖,而金佛手和建佛手多糖的單糖組分均為甘露糖、葡萄糖和半乳糖[3]。廣佛手多糖由D-木糖、D-甘露糖、D-葡萄糖、D-半乳糖和L-鼠李糖組成[4]。佛手多糖具有免疫調(diào)節(jié)[5]、抗氧化[6]、抗腫瘤[7]等生物活性。

帕金森病(Parkinson′s disease,PD)是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,主要以中腦黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元變性、死亡為病理特征。帕金森病的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確[8],研究表明,氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙、細(xì)胞自噬等因素都參與了帕金森病的致病過(guò)程[9]。帕金森病多發(fā)于中老年群體,我國(guó)老齡化不斷加劇,預(yù)計(jì)到2030年,全國(guó)帕金森病人數(shù)高達(dá)500萬(wàn)[10]。目前還沒(méi)有能完全根治帕金森病的藥物。研究表明,很多中藥活性成分對(duì)帕金森病有較好的預(yù)防治療效果,而且具有低毒、副作用小等優(yōu)點(diǎn)。因此,對(duì)中藥活性成分預(yù)防和治療帕金森病的效果進(jìn)行深入研究,具有重要的實(shí)際意義[11]。

表1 干酪成熟過(guò)程中風(fēng)味物質(zhì)的變化Table 1 Changes of flavor compounds during cheese ripening

目前,植物多糖對(duì)PD細(xì)胞模型和動(dòng)物模型的保護(hù)作用已有不少報(bào)道[12-14],但未見有佛手多糖對(duì)PD細(xì)胞模型的保護(hù)作用方面的報(bào)道。因此,本實(shí)驗(yàn)采用被廣泛使用的1-甲基-4-苯基-吡啶離子(1-methyl-4-phenyl-pyridine ion, MPP+)誘導(dǎo)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤(SH-SY5Y)細(xì)胞損傷為PD細(xì)胞模型,探究佛手多糖對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用及其機(jī)制,為緩解帕金森病的發(fā)生發(fā)展提供理論依據(jù),同時(shí)也能更好地開發(fā)和利用佛手資源。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

SH-SY5Y細(xì)胞株,武漢大學(xué)保藏中心;佛手,廣東省肇慶市德慶縣莫村鎮(zhèn)(2020年);無(wú)水乙醇,廣東廣試試劑科技有限公司;AB-8大孔樹脂,鄭州勤實(shí)科技有限公司;纖維素酶、果膠酶,上海源葉生物科技有限公司;木瓜蛋白酶、MPP+,上海麥克林生化科技股份有限公司;DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰酶,美國(guó)Gibco公司;磷酸鹽緩沖溶液(PBS),大連美侖生物技術(shù)有限公司;二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO),天津市富宇精細(xì)化工有限公司;噻唑藍(lán)(methye thiazdye telrazlium, MTT)、Hoechst33258染色液、活性氧(reactive oxygen species,ROS)檢測(cè)試劑盒、線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒(JC-1)、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、ECL發(fā)光液,上海碧云天生物科技有限公司;蛋白激酶B(protein kinase B, Akt)抗體、磷酸化蛋白激酶B(phosphorylated protein kinase B, p-Akt)抗體、磷酸化細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(phosphorylated extracellular regulated protein kinases1/2, p-ERK1/2)抗體、細(xì)胞色素c(cytochrome c, Cyt-c)抗體、美國(guó)Cell Signaling Technology公司;β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)抗體,美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司;Goat anti-Rabbit IgG二抗,美國(guó)Merck Millipore公司;其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DHG-9140A鼓風(fēng)干燥箱、HWS-12恒溫水浴鍋,上海一恒科學(xué)儀器有限公司;800A多功能粉碎機(jī),永康市紅太陽(yáng)機(jī)電有限公司;TDL-80-2C低速離心機(jī),上海安亭科學(xué)儀器廠;SQP電子天平,賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司;RE-3000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,上海亞榮生化儀器廠;Smart-Q30純水機(jī),上海和泰儀器有限公司;ELx800酶標(biāo)儀,美國(guó)Bio-Tek公司;FRESCO 21高速冷凍離心機(jī)、HEARACELL 150i CO2培養(yǎng)箱,美國(guó)Thermo Fisher公司;Eclipse Ts2 FL倒置熒光、Eclipse TS100F正置熒光顯微鏡,日本Nikon公司;ChemiDocXRS+化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng),美國(guó)Bio-Rad公司;SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái),蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

稱取21 mg無(wú)水葡萄糖,定容于100 mL容量瓶,分別吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5 mL于試管中,分別加入1.8、1.6、1.4、1.2、1.0、0.5 mL純凈水,另一個(gè)試管加入2.0 mL去離子水作為空白組,各試管中加入6%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))苯酚1.0 mL,搖勻,加入5.0 mL硫酸,搖勻,靜置5 min,放入沸水浴加熱15 min,立即冷卻至室溫,490 nm測(cè)吸光度,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=11.669x+0.014 9,其中R2=0.999 1。

1.3.2 佛手多糖的提取

參考章斌等[15]的方法,并稍加修改:佛手片烘干,粉碎,過(guò)100目篩,5倍95%(體積分?jǐn)?shù))乙醇浸泡過(guò)夜(脫脂),過(guò)濾,烘干,酶提取[酶用量1.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)),料液比1∶30,提取溫度50 ℃,提取時(shí)間2 h],90 ℃滅酶10 min,抽濾濃縮,離心,取上清液,Sevage法除蛋白,活性炭去色素,80%乙醇沉淀,無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚依次洗滌,烘干,去離子水重溶,離心,80%乙醇沉淀,無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚依次洗滌,烘干,測(cè)定多糖得率。

1.3.3 佛手多糖的純化

本研究使用AB-8大孔樹脂對(duì)佛手粗多糖進(jìn)行純化,參考楊波等[16]的方法,并稍作修改。以大孔吸附樹脂AB-8為填料,佛手粗多糖溶于去離子水,上樣濃度為6 mg/L,先用300 mL去離子水進(jìn)行洗脫,再用300 mL 40%乙醇洗脫,流速為1 mL/min,洗脫液體積為600 mL,50 mL/管進(jìn)行收集,苯酚-硫酸法進(jìn)行檢測(cè)跟蹤,濃縮,醇沉,烘干備用。

1.3.4 佛手多糖純度測(cè)定

稱取20 mg佛手粗多糖置于100 mL容量瓶中,用去離子水定容至刻度線,取1 mL多糖溶液按照1.3.1節(jié)的方法測(cè)定吸光度,計(jì)算純度。

1.3.5 細(xì)胞培養(yǎng)與分組

將SH-SY5Y細(xì)胞接種于含10%(體積分?jǐn)?shù))血清的DMEM完全培養(yǎng)基中,在恒溫37 ℃、5%(體積分?jǐn)?shù))CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每天觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況,待細(xì)胞長(zhǎng)到80%以上即可傳代,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞分為對(duì)照組、模型組(加入1 mmol/L MPP+)和佛手多糖組(20、40、60、80、100 mg/L),佛手多糖(溶于PBS)預(yù)處理6 h,然后加入1 mmol/L MPP+處理細(xì)胞48 h。

1.3.6 細(xì)胞存活率的檢測(cè)

以每孔細(xì)胞數(shù)1×104將細(xì)胞接種于96孔板中,每組5個(gè)重復(fù),在恒溫37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后,各組給予相應(yīng)的藥物處理。加藥48 h后,每孔加20 μL MTT(5 mg/mL),在培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育4 h,吸盡舊培養(yǎng)基,每孔加入DMSO 150 μL,放置37 ℃、200 r/min搖床下振蕩30 min,用酶標(biāo)儀在490 nm處測(cè)定吸光度值(A值)。細(xì)胞存活率計(jì)算如公式(1)所示:

(1)

1.3.7 Hoechst33258染色

將細(xì)胞接種于6孔板(接種前放入蓋玻片),每孔細(xì)胞數(shù)約3×105,在恒溫37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后,佛手多糖組加入80 mg/L佛手多糖,對(duì)照組及模型組加入相同體積PBS,6 h后佛手多糖組和模型組加入1 mmol/L MPP+,對(duì)照組加入相同體積PBS。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后,每孔加入Hoechst33258染色液5 μL,放入培養(yǎng)箱孵育20 min,用PBS洗滌2次,取出蓋玻片,置于載玻片中,在熒光顯微鏡下隨機(jī)選取視野拍照。

1.3.8 細(xì)胞ROS水平的檢測(cè)

按1.3.7節(jié)分組處理細(xì)胞,培養(yǎng)48 h后,吸去細(xì)胞培養(yǎng)基,每孔加入10 μmol/L DCFH-DA 熒光染色液1 mL,放入培養(yǎng)箱中孵育20 min,用DMEM完全培養(yǎng)基清洗細(xì)胞3次,最后加入1 mL DMEM完全培養(yǎng)基,在熒光顯微鏡下隨機(jī)選取視野拍照,隨后使用Image J軟件計(jì)算熒光強(qiáng)度。

1.3.9 線粒體膜電位的檢測(cè)

按1.3.7節(jié)項(xiàng)分組處理細(xì)胞,48 h后,吸去培養(yǎng)基,用1 mL PBS洗滌1次,各組分別加入1 mL完全培養(yǎng)基,避光條件下,加入1 mL的JC-1染色工作液,搖勻,放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)20 min。孵育結(jié)束后,吸走培養(yǎng)基,用提前預(yù)冷的1× JC-1染色緩沖液,洗滌2次,最后加入1.5 mL基本培養(yǎng)基,置于倒置熒光顯微鏡,隨機(jī)選取視野拍照,并使用Image J軟件測(cè)定各組細(xì)胞的紅綠熒光強(qiáng)度。

1.3.10 Western blot檢測(cè)p-Akt、Akt、p-ERK和Cyt-c蛋白表達(dá)水平

將細(xì)胞接種于6 cm培養(yǎng)皿,每皿細(xì)胞數(shù)約1×106,按1.3.7節(jié)分組處理細(xì)胞,培養(yǎng)24 h后,吸去細(xì)胞培養(yǎng)液,PBS清洗1次,每皿加入細(xì)胞裂解液300 μL,放于冰上,置于4 ℃搖床振蕩30 min,將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至EP管,13 000 r/min離心10 min后,吸取上清液。取少量上清液,用BCA蛋白濃度試劑盒測(cè)定總蛋白含量。余下樣品加適量5×loading buffer,沸水浴5 min,冷卻后,將蛋白樣品加入泳道,進(jìn)行電泳,先恒壓80 V電泳 1 h,再恒壓100 V電泳至底部,隨后將蛋白轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜(250 mA,100 min)。轉(zhuǎn)膜完成后將膜置于5%奶粉或1×Tris緩沖鹽吐溫混合液(tris buffered saline tween,TBST)中封閉1 h,加一抗(p-Akt,Akt,p-ERK1/2,Cyt-c,β-actin,體積比1∶1 000) 4 ℃孵育過(guò)夜。1×TBST洗膜3次,每次10 min,然后加二抗(1∶3 000)孵育1 h,1×TBST洗膜3次后加ECL發(fā)光液顯影,于化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)成像及分析,使用Image J軟件分析條帶灰度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 佛手多糖的提取、純化

通過(guò)復(fù)合酶提法對(duì)佛手粗多糖進(jìn)行提取,由苯酚-硫酸法測(cè)定得佛手粗多糖得率為(4.86±0.50)%,純度為(44.46±4.64)%。與王琴等[17]的文獻(xiàn)相比,多糖得率提高了1.68%,但純度降低了21.4%,這可能是蛋白質(zhì)等雜質(zhì)去除不夠干凈[17]。經(jīng)過(guò)AB-8大孔吸附樹脂對(duì)佛手粗多糖的純化,佛手多糖純度達(dá)到(60.81±1.41)%,純度提高了16.35%。

2.2 佛手多糖對(duì)MPP+損傷的細(xì)胞存活率的影響

如圖1所示,SH-SY5Y細(xì)胞經(jīng)MPP+作用后,細(xì)胞存活率明顯下降(P<0.01)。經(jīng)佛手多糖預(yù)處理后,細(xì)胞的存活率顯著上升(P<0.01),在20～100 mg/L濃度內(nèi)呈先上升后下降的趨勢(shì),佛手多糖組細(xì)胞存活率均高于模型組(50.58%),最高達(dá)62.24%。故選擇80 mg/L的佛手多糖濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 佛手多糖對(duì)MPP+誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞損傷的 保護(hù)作用

2.3 佛手多糖對(duì)MPP+誘導(dǎo)的細(xì)胞形態(tài)的影響

通過(guò)Hoechst33258染色后可見(圖2),對(duì)照組細(xì)胞呈現(xiàn)出均勻的低強(qiáng)度熒光,模型組中部分細(xì)胞呈現(xiàn)出高強(qiáng)度的顆粒狀藍(lán)色熒光,出現(xiàn)細(xì)胞破碎、細(xì)胞核皺縮等細(xì)胞凋亡現(xiàn)象,佛手多糖組細(xì)胞的形態(tài)和對(duì)照組接近,熒光強(qiáng)度較模型組的低。

a-對(duì)照組;b-模型組;c-佛手多糖組(80 mg/L)

2.4 佛手多糖對(duì)MPP+誘導(dǎo)的細(xì)胞活性氧水平的影響

如圖3所示,與對(duì)照組比較,MPP+組細(xì)胞內(nèi)二氯熒光素信號(hào)顯著增強(qiáng),綠色熒光強(qiáng)度大,表明細(xì)胞內(nèi)活性氧水平顯著增加(P<0.01)。與模型組比較,佛手多糖組的熒光強(qiáng)度明顯降低,細(xì)胞內(nèi)活性氧水平顯著減少(P<0.01)。以上結(jié)果表明,佛手多糖能夠抑制MPP+所導(dǎo)致的SH-SY5Y細(xì)胞活性氧水平增加。

圖3 佛手多糖對(duì)MPP+誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞ROS水平的影響 (熒光顯微鏡,

2.5 佛手多糖對(duì)MPP+誘導(dǎo)的細(xì)胞線粒體膜電位的影響

如圖4所示,對(duì)照組中的紅綠熒光比值為4.44,與對(duì)照組相比,模型組中紅綠熒光比值降低至0.72(P<0.01),而佛手多糖組的紅綠熒光比值顯著高于模型組,佛手多糖組為1.98(P<0.05),以上結(jié)果表明,佛手多糖能抑制MPP+導(dǎo)致的膜電位下降,從而減少線粒體損傷。

2.6 佛手多糖對(duì)p-Akt、p-ERK和Cyt-c表達(dá)水平的影響

如圖5所示,與對(duì)照組比較,模型組p-ERK1/2和p-Akt的表達(dá)水平均極顯著減少(P<0.01),Cyt-c蛋白表達(dá)水平顯著增加(P<0.05)。佛手多糖能顯著抑制MPP+引起p-ERK1/2和p-Akt的下降以及Cyt-c水平的增加。

a-蛋白免疫印跡中的蛋白表達(dá)水平(A-對(duì)照組;B-模型組;C-佛手多糖組(80 mg/L));b-p-Akt/Akt;c-p-ERK1/2/β-actin;d-Cyt-c/β-actin

2.7 作用機(jī)制

佛手多糖細(xì)胞保護(hù)作用機(jī)制如圖6所示。

3 結(jié)果與討論

MPP+是一種神經(jīng)毒素,是PD模型常用的誘導(dǎo)劑,可經(jīng)多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體轉(zhuǎn)運(yùn)到多巴胺能神經(jīng)元后,在線粒體中積累并產(chǎn)生大量ROS[18],隨后誘導(dǎo)Cyt-c從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中,從而觸發(fā)Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)和細(xì)胞凋亡[19]。本研究結(jié)果顯示,MPP+使得細(xì)胞內(nèi)ROS增加,Cyt-c從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì),經(jīng)過(guò)佛手多糖處理后,細(xì)胞內(nèi)ROS減少,Cyt-c釋放減少,說(shuō)明佛手多糖可通過(guò)調(diào)節(jié)線粒體中ROS的產(chǎn)生和Cyt-c的釋放來(lái)抑制MPP+誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

ERK1/2是指細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶,是絲裂原活化蛋白激酶家族重要成員之一,參與細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育,細(xì)胞形態(tài)維持,細(xì)胞死亡等生理過(guò)程。ROS能激活ERK信號(hào)通路,可進(jìn)一步激活蛋白激酶、轉(zhuǎn)錄因子等多種下游效應(yīng)因子,調(diào)控基因表達(dá),共同作用于神經(jīng)系統(tǒng),反過(guò)來(lái)對(duì)細(xì)胞起到保護(hù)作用[20-21]。ERK信號(hào)通路可通過(guò)三級(jí)酶促級(jí)聯(lián)反應(yīng)激活,促使ERK轉(zhuǎn)變成p-ERK,從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[22]。用1 mmol/L MPP+處理SH-SY5Y細(xì)胞,24 h/48 h后,細(xì)胞內(nèi)p-ERK1/2表達(dá)水平均明顯下降[23-24]。本實(shí)驗(yàn)得到相似的結(jié)果,經(jīng)1 mmol/LMPP+作用后,細(xì)胞內(nèi)p-ERK1/2水平明顯下降,而經(jīng)佛手多糖處理后,p-ERK1/2的下降得到抑制,提示佛手多糖可能通過(guò)激活ERK信號(hào)通路,進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡。

研究表明,Akt參與神經(jīng)細(xì)胞存活、凋亡、自噬以及細(xì)胞增殖等過(guò)程[25]。另外的研究還表明,PI3K/Akt通路是細(xì)胞抗凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的重要途徑,能夠避免細(xì)胞受多種凋亡信號(hào)刺激[26]。當(dāng)PI3K被激活后,能夠催化PIP2轉(zhuǎn)化為PIP3,促進(jìn)Akt發(fā)生磷酸化,磷酸化的Akt可以抑制多種凋亡蛋白的表達(dá),進(jìn)而發(fā)揮抗凋亡作用[27]。CAO等[23]研究顯示,MPP+能夠抑制Akt信號(hào)通路,使SH-SY5Y細(xì)胞中的p-Akt表達(dá)降低從而使細(xì)胞凋亡。李鵬等[13]研究發(fā)現(xiàn),枸杞多糖能通過(guò)激活PI3K/Akt通路,抑制MPP+誘導(dǎo)的帕金森病模型細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,MPP+處理SH-SY5Y細(xì)胞后,p-Akt表達(dá)水平顯著下降,經(jīng)佛手多糖處理后,能夠顯著抑制p-Akt的下降,提示佛手多糖可能通過(guò)激活A(yù)kt信號(hào)通路,進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡。

綜上所述,佛手多糖對(duì)MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用,其機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)節(jié)線粒體ROS的產(chǎn)生和Cyt-c的釋放,進(jìn)而維持線粒體穩(wěn)態(tài),激活A(yù)kt信號(hào)通路和ERK信號(hào)通路,抑制細(xì)胞的凋亡,從而起到保護(hù)作用。本研究有助于闡明佛手多糖對(duì)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用機(jī)制,為緩解帕金森病的發(fā)生發(fā)展提供理論依據(jù)。