D-乳酸對(duì)免疫低下小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用

杜心茹,李海濤

(江南大學(xué) 食品學(xué)院,江蘇 無(wú)錫,214000)

免疫應(yīng)答是人體免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵防御機(jī)制,對(duì)生命健康至關(guān)重要。免疫穩(wěn)態(tài)通過(guò)T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫和B淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫進(jìn)行調(diào)節(jié)。營(yíng)養(yǎng)不良、化療和壓力等多種因素可導(dǎo)致免疫低下,免疫低下與各種疾病發(fā)展密切相關(guān),如化療、放療和免疫抑制劑所致的免疫低下會(huì)增加癌癥的風(fēng)險(xiǎn)[1]。因此,尋求預(yù)防和緩解免疫低下的有效策略至關(guān)重要。

酸奶中富含多種具有免疫調(diào)節(jié)活性的物質(zhì),在調(diào)節(jié)機(jī)體免疫方面具有較大的潛力[2]。以往關(guān)于酸奶的免疫調(diào)節(jié)作用研究大多聚焦于益生菌、蛋白質(zhì)或維生素等[3-4],然而,D-乳酸作為酸奶中乳酸菌發(fā)酵的重要代謝產(chǎn)物卻很少受到關(guān)注。乳酸包含D-乳酸和L-乳酸兩種光學(xué)異構(gòu)體,廣泛存在于傳統(tǒng)發(fā)酵食品中,如酸奶、泡菜等[5]。在酸奶生產(chǎn)過(guò)程中,保加利亞乳桿菌可以將90%的丙酮酸轉(zhuǎn)化為D-乳酸[6]。研究普遍認(rèn)為,人體內(nèi)只存在可以快速代謝L-乳酸的L-乳酸脫氫酶,而不存在D-乳酸脫氫酶,因此血漿D-乳酸濃度升高會(huì)導(dǎo)致酸中毒[5]。然而,最新研究對(duì)D-乳酸的安全性和有效性進(jìn)行了全面評(píng)估,證明小鼠每天攝入2 000 mg/kg的D-乳酸并不影響其正常生長(zhǎng)發(fā)育,且與L-乳酸相比,D-乳酸由于其藥代動(dòng)力學(xué)優(yōu)勢(shì)而具有更強(qiáng)的抗炎特性[7]。此外,D-乳酸在酸奶預(yù)防小鼠結(jié)腸炎相關(guān)結(jié)直腸癌中具有重要作用,對(duì)腸巨噬細(xì)胞具有一定的免疫調(diào)控潛力[8]。因此,D-乳酸很可能是一種潛在的食品營(yíng)養(yǎng)因子。

本文利用環(huán)磷酰胺建立免疫低下模型,通過(guò)分析小鼠體質(zhì)量、免疫器官指數(shù)、遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)程度、骨髓形態(tài)、外周血細(xì)胞數(shù)量、免疫細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子、血清細(xì)胞因子水平等指標(biāo),評(píng)估D-乳酸對(duì)免疫低下小鼠的免疫功效,為緩解免疫低下提供新思路,并為傳統(tǒng)發(fā)酵食品的生理功效和D-乳酸的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康SPF級(jí)Balb/c雌性小鼠,體質(zhì)量(20.0±2.0) g,6周齡,購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.2 試劑與儀器

D-乳酸鈉、環(huán)磷酰胺、鹽酸左旋咪唑,Sigma-Aldrich;5%和20%(體積分?jǐn)?shù))綿羊紅細(xì)胞,南京森貝伽生物科技有限公司;Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒,上海碧云天生物技術(shù)有限公司;外周血淋巴細(xì)胞提取試劑盒,北京索萊寶生物科技有限公司;免疫球蛋白(immunoglobulin, Ig)M、白細(xì)胞介素(interleukin, IL)-2、IL-4試劑盒,南京建成生物工程研究所。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀,美國(guó)Bio-Rad公司;全自動(dòng)血液細(xì)胞分析儀,深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司;流式細(xì)胞分選儀,美國(guó)BD公司;落地式離心機(jī),美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分組

6周齡SPF級(jí)Balb/c雌性小鼠飼養(yǎng)于江南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,許可證號(hào)為SYXK(蘇)2021-0056。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)通過(guò)江南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理與動(dòng)物福利倫理委員會(huì)批準(zhǔn),倫理編號(hào)為JN.No20220315c0900425[012]。小鼠飼養(yǎng)屏障環(huán)境為:溫度21～25 ℃,相對(duì)濕度50%～60%,12 h晝夜循環(huán)。適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后,將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為空白組、環(huán)磷酰胺模型組、鹽酸左旋咪唑陽(yáng)參組及D-乳酸低、中、高劑量組,每組各7只。除空白組外,其余各組每天腹腔注射80 mg/kg bw的環(huán)磷酰胺,建立免疫低下小鼠模型,空白組腹腔注射等量的生理鹽水,連續(xù)3 d。從第4天開(kāi)始,陽(yáng)參組給予小鼠灌胃40 mg/kg bw鹽酸左旋咪唑,D-乳酸低、中、高劑量組分別灌胃75、150、300 mg/kg bwD-乳酸鈉溶液,空白組和模型組灌胃等量的蒸餾水,每日觀察各組小鼠狀態(tài),連續(xù)治療15 d后,按照動(dòng)物福利原則處死小鼠并取材,檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)。

1.3.2 體質(zhì)量和免疫器官指數(shù)

在小鼠造模前稱(chēng)其體質(zhì)量,記為初始體質(zhì)量;在小鼠造模后稱(chēng)其體質(zhì)量,記為造模后體質(zhì)量;在D-乳酸灌胃15 d后稱(chēng)其體質(zhì)量,記為終末體質(zhì)量。小鼠處死后,取脾臟和胸腺,分別稱(chēng)重。將免疫器官質(zhì)量與體質(zhì)量的比值定義為免疫器官指數(shù),單位為mg/g。免疫器官指數(shù)按公式(1)計(jì)算:

(1)

1.3.3 遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)

遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)是一種體內(nèi)細(xì)胞免疫檢測(cè)方式,當(dāng)致敏的T淋巴細(xì)胞與抗原再次接觸時(shí),引起T淋巴細(xì)胞的激活,受刺激部位出現(xiàn)明顯腫脹,腫脹程度表明T淋巴細(xì)胞的免疫應(yīng)答水平[9]。在給藥第11天,將0.2 mL 5%(體積比)的綿羊紅細(xì)胞注射到小鼠腹腔內(nèi),使用游標(biāo)卡尺測(cè)量右后足跖的厚度。第4天后,將20 μL 20%(體積比)的綿羊紅細(xì)胞注入到右后足跖。在第二次注射后的24 h內(nèi),測(cè)定足跖的厚度。同一部位測(cè)量3次,取平均值。厚度的增加量作為評(píng)估遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)程度的指標(biāo)[10]。

1.3.4 骨組織形態(tài)學(xué)

摘除小鼠股骨,小心去除肌肉組織,將小鼠股骨組織在4%多聚甲醛中固定24 h后,經(jīng)脫鈣、脫水、透明、浸蠟、包埋和切片步驟完成標(biāo)本的制作。標(biāo)本經(jīng)過(guò)烤片、二甲苯脫蠟、復(fù)水、蘇木精-伊紅(H&E)染色、脫水、透明及中性樹(shù)膠封片后,在切片掃描儀下觀察[11]。

1.3.5 骨髓細(xì)胞凋亡檢測(cè)

無(wú)菌條件下摘除小鼠股骨,小心去除肌肉組織,無(wú)菌注射器插入骨髓腔內(nèi),使用DMEM培養(yǎng)基(胎牛血清10%,青霉素100 U/mL,鏈霉素0.1 mg/mL)提取骨髓細(xì)胞,將液體樣品收集到無(wú)菌離心管中離心,計(jì)數(shù)備用[12]。按照Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒操作說(shuō)明[13],取5×104個(gè)細(xì)胞,用195 μL Annexin V-FITC結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞,分別加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL碘化丙啶染色液,輕輕混勻。室溫(20～25 ℃)避光孵育10～20 min,立即用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率,細(xì)胞凋亡率按公式(2)計(jì)算:

(2)

1.3.6 外周血細(xì)胞計(jì)數(shù)

末次灌胃第1天,小鼠眼眶后靜脈叢取血。麻醉小鼠并進(jìn)行眼部消毒,用毛細(xì)管輕輕穿刺小鼠眼眶下方的靜脈血管,取50 μL全血于EDTA抗凝管中。完成取樣后,用干凈棉球輕輕壓迫取樣處,幫助止血,確保小鼠恢復(fù)到正常狀態(tài)。將樣本充分混勻,立即采用全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀對(duì)血細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.3.7 外周血淋巴細(xì)胞提取

末次灌胃第2天,小鼠眼眶后靜脈叢取血,方法同1.3.6節(jié)。取適量全血于EDTA抗凝管中,充分混勻。采用小鼠外周血淋巴細(xì)胞分離液試劑盒,無(wú)菌條件下分離外周血淋巴細(xì)胞,按照操作說(shuō)明,使用與血液等體積的組織稀釋液稀釋全血,加入適量分離液,離心后小心吸取白膜層細(xì)胞,用PBS洗滌并重懸2次后,離心去上清,將淋巴細(xì)胞分離出來(lái)備用[14]。

1.3.8 免疫細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)

按照Trizol說(shuō)明書(shū)提取外周血淋巴細(xì)胞的總RNA,使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA轉(zhuǎn)化為cDNA。使用實(shí)時(shí)定量PCR系統(tǒng)評(píng)估基因表達(dá)水平,引物序列見(jiàn)表1。通過(guò)將目標(biāo)基因與β-actin進(jìn)行比較,并使用2-ΔΔCt方法對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行相對(duì)定量。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.3.9 血清細(xì)胞因子水平

將新鮮全血在室溫條件下靜置1 h,4 ℃條件下3 000 r/min離心15 min。吸取上清液即為血清,采用ELISA試劑盒測(cè)定血清中細(xì)胞因子IL-2、IL-4、IgM的含量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

使用Graphpad Prism 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和繪圖,采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用單因素方差分析(one-way ANOVA),并認(rèn)為P<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以符號(hào)數(shù)目區(qū)分顯著性等級(jí),其中,與空白組相比,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.000 1;與模型組相比,#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001,####P<0.000 1。

2 結(jié)果與分析

2.1 體質(zhì)量

如表2所示,各組小鼠初始體質(zhì)量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,環(huán)磷酰胺造模3 d后,與空白組相比,各組小鼠的體質(zhì)量均顯著降低(P<0.01)。實(shí)驗(yàn)15 d后,與模型組相比,陽(yáng)參組小鼠的終末體質(zhì)量得到顯著恢復(fù)(P<0.01),而D-乳酸低劑量組小鼠的終末體質(zhì)量無(wú)明顯變化,D-乳酸中高劑量組小鼠的終末體質(zhì)量得到顯著恢復(fù)(P<0.05)。研究結(jié)果表明中高劑量D-乳酸可以恢復(fù)環(huán)磷酰胺所致的小鼠體質(zhì)量下降。

表2 D-乳酸對(duì)免疫低下小鼠體質(zhì)量的影響Table 2 Effect of D-lactate on the body weight of immunosuppressive mice

2.2 免疫器官指數(shù)

如圖1所示,與空白組相比,模型組小鼠的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)均顯著減小(P<0.001)。實(shí)驗(yàn)15 d后,與模型組相比,陽(yáng)參組小鼠脾臟指數(shù)(P<0.01)和胸腺指數(shù)(P<0.01)顯著增加,D-乳酸低、中、高劑量組小鼠脾臟指數(shù)(P<0.05)和胸腺指數(shù)(P<0.01)均有不同程度的增加。以上結(jié)果說(shuō)明D-乳酸可以提高免疫低下小鼠的免疫器官發(fā)育指數(shù)。

a-脾臟指數(shù);b-胸腺指數(shù)

2.3 遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)

如圖2所示,與空白組相比,模型組小鼠足跖腫脹程度顯著降低(P<0.001)。與模型組比較,陽(yáng)參組小鼠足跖腫脹程度顯著增加(P<0.001),D-乳酸中劑量組(P<0.05)和高劑量組(P<0.01)小鼠足跖腫脹程度均顯著增加。以上結(jié)果說(shuō)明D-乳酸可以劑量依賴(lài)性地提高免疫低下小鼠的遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)程度。

a-空白組;b-模型組;c-陽(yáng)參組;d-低劑量組;e-中劑量組;f-高劑量組;g-足跖腫脹程度

2.4 骨髓結(jié)構(gòu)形態(tài)

如圖3所示,空白組小鼠的骨髓組織結(jié)構(gòu)清晰,其中成骨細(xì)胞(箭頭所示)和髓樣細(xì)胞(三角所示)數(shù)量眾多,緊密排列。與空白組相比,環(huán)磷酰胺模型組的骨髓組織結(jié)構(gòu)混亂,成骨細(xì)胞和髓樣細(xì)胞數(shù)量明顯減少,排列松散。與模型組相比,陽(yáng)參組骨髓組織結(jié)構(gòu)得到改善,成骨細(xì)胞和髓樣細(xì)胞數(shù)量得到恢復(fù),D-乳酸攝入后也有相似的結(jié)果,特別是中高劑量的D-乳酸可以明顯恢復(fù)骨髓組織結(jié)構(gòu)與成骨細(xì)胞和髓樣細(xì)胞的數(shù)量。以上結(jié)果說(shuō)明,D-乳酸可以恢復(fù)免疫低下小鼠的骨髓形態(tài)結(jié)構(gòu)。

2.5 骨髓細(xì)胞凋亡

如圖4和圖5所示,空白組的細(xì)胞凋亡率為(1.45±0.22)%,而與空白組相比,模型組的細(xì)胞凋亡率顯著上升(P<0.000 1),為(12.50±1.08)%。與模型組相比,陽(yáng)參組的細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.01),為(7.30±0.85)%,D-乳酸中劑量組(P<0.05)和高劑量組(P<0.01)的細(xì)胞凋亡率顯著降低,分別為(8.80±0.49)%和(8.11±0.64)%。以上結(jié)果說(shuō)明,D-乳酸可以改善免疫低下小鼠的骨髓細(xì)胞凋亡。

a-空白組;b-模型組;c-陽(yáng)參組;d-低劑量組;e-中劑量組;f-高劑量組

圖5 D-乳酸對(duì)免疫低下小鼠骨髓細(xì)胞凋亡的影響

2.6 血細(xì)胞計(jì)數(shù)

如圖6所示,與空白組相比,環(huán)磷酰胺模型組小鼠的外周血白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和紅細(xì)胞數(shù)量顯著減少(P<0.001),血紅蛋白濃度沒(méi)有明顯變化。與模型組相比,陽(yáng)參組白細(xì)胞數(shù)量(P<0.001)、淋巴細(xì)胞數(shù)量(P<0.001)和紅細(xì)胞數(shù)量(P<0.01)顯著增加,D-乳酸灌胃后,各劑量組的白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞數(shù)量恢復(fù)至空白組水平,而各組間紅細(xì)胞與血紅蛋白濃度均無(wú)顯著變化。以上結(jié)果說(shuō)明,D-乳酸可以恢復(fù)免疫低下小鼠血液中的白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞數(shù)量,而對(duì)紅細(xì)胞數(shù)量和血紅蛋白濃度無(wú)顯著影響。

a-白細(xì)胞數(shù);b-淋巴細(xì)胞數(shù);c-紅細(xì)胞數(shù);d-血紅蛋白

a-T-bet mRNA相對(duì)表達(dá)量;b-GATA3 mRNA相對(duì)表達(dá)量

2.7 免疫細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)

如圖7所示,與空白組比較,模型組T-bet,GATA3 mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著降低(P<0.000 1)。與模型組比較,陽(yáng)參組的T-bet和GATA3 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P<0.000 1),D-乳酸中高劑量組的T-bet mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P<0.001),只有D-乳酸高劑量組GATA3的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P<0.05)。以上結(jié)果說(shuō)明,D-乳酸可以部分恢復(fù)免疫低下小鼠的免疫細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)水平。

2.8 血清細(xì)胞因子水平

如圖8所示,與空白組相比,模型組小鼠血清中IL-2,IL-4,IgM質(zhì)量濃度顯著降低(P<0.001)。與模型組相比,陽(yáng)參組IL-2,IL-4,IgM質(zhì)量濃度顯著增加(P<0.001),D-乳酸中劑量組(P<0.01)和高劑量組(P<0.001)的IL-2質(zhì)量濃度顯著升高,D-乳酸中高劑量組的IL-4質(zhì)量濃度顯著升高(P<0.05),D-乳酸高劑量組的IgM水平顯著升高(P<0.05)。上述結(jié)果表明,D-乳酸可以改善免疫低下小鼠的血清細(xì)胞因子水平。

a-IL-2質(zhì)量濃度;b-IL-4質(zhì)量濃度;c-IgM質(zhì)量濃度

3 討論

環(huán)磷酰胺是一種廣譜的化療藥物,通過(guò)代謝產(chǎn)物的交聯(lián)作用來(lái)烷基化DNA和蛋白質(zhì),影響癌細(xì)胞增殖的能力。環(huán)磷酰胺在殺死腫瘤細(xì)胞的同時(shí)會(huì)對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生毒副作用,影響免疫器官發(fā)育,導(dǎo)致體重減輕和骨髓抑制等[15]。骨髓抑制往往伴隨著骨髓結(jié)構(gòu)紊亂,血細(xì)胞數(shù)量減少、功能減弱,血清細(xì)胞因子分泌異常等現(xiàn)象,從而進(jìn)一步削弱機(jī)體免疫能力[16]。

本文主要從D-乳酸改善骨髓抑制的角度,為緩解環(huán)磷酰胺所致的免疫低下尋求一種有效的策略。

酸奶通常含有約0.7%的D-乳酸,體質(zhì)量80 kg成人的酸奶每日推薦攝入量為150～200 g,相當(dāng)于給小鼠每日口服D-乳酸劑量為150 mg/kg[7]。本文探究了不同劑量的D-乳酸對(duì)環(huán)磷酰胺所致的免疫低下小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用。結(jié)果顯示,中高劑量D-乳酸治療顯著恢復(fù)了白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的數(shù)量,對(duì)紅細(xì)胞和血紅蛋白含量沒(méi)有顯著影響,這與徐光沛等[17]研究結(jié)果一致,表明D-乳酸在短期內(nèi)并未對(duì)紅細(xì)胞和血紅蛋白含量產(chǎn)生顯著影響,可能與紅細(xì)胞的生長(zhǎng)周期較長(zhǎng)有關(guān)。因此,D-乳酸緩解環(huán)磷酰胺所致的骨髓抑制與白細(xì)胞數(shù)量的提高有關(guān),在短期內(nèi)與紅細(xì)胞和血紅蛋白含量可能沒(méi)有直接關(guān)系。

淋巴細(xì)胞是白細(xì)胞的一種,T-bet和GATA3分別為輔助性T淋巴細(xì)胞(helper T cell,Th)1、Th2的特異性核轉(zhuǎn)錄因子,分別調(diào)控機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫功能及相關(guān)細(xì)胞因子(IL-2, IL-4)的產(chǎn)生[18]。將小鼠外周血淋巴細(xì)胞分離提取作進(jìn)一步研究,發(fā)現(xiàn)中高劑量的D-乳酸可以顯著恢復(fù)淋巴細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子T-bet的mRNA表達(dá)量,而只有高劑量的D-乳酸可以顯著恢復(fù)核轉(zhuǎn)錄因子GATA3的mRNA表達(dá)量。因此,D-乳酸恢復(fù)骨髓抑制可能與促進(jìn)T淋巴細(xì)胞向Th1分化有關(guān),在提高細(xì)胞免疫功能方面具有顯著的作用,這與遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果恰好吻合。

本研究利用環(huán)磷酰胺建立免疫低下小鼠模型,從多個(gè)方面對(duì)D-乳酸緩解環(huán)磷酰胺所致的小鼠免疫低下進(jìn)行初步研究,包括體質(zhì)量、免疫臟器指數(shù)、遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)程度、骨髓抑制等。結(jié)果表明,D-乳酸在免疫器官、免疫細(xì)胞和免疫活性分子等方面均顯示出改善效果,在中高劑量下尤為顯著,且不同劑量D-乳酸體現(xiàn)了改善免疫低下小鼠不同免疫指標(biāo)的潛力。盡管本研究探索了D-乳酸對(duì)免疫低下的改善作用,但其調(diào)控機(jī)制需進(jìn)一步探究。未來(lái)工作可采用流式細(xì)胞術(shù)、免疫磁珠等,分型鑒定免疫細(xì)胞,進(jìn)一步探討D-乳酸與其受體的關(guān)系,有助于更全面地了解D-乳酸在免疫功能調(diào)控中的作用途徑以及其在免疫治療中的潛在應(yīng)用前景。