茶樹春梢萌發早晚關聯基因CsAL1的CAPS分子標記開發

摘要：茶樹（Camellia sinensis）作為一種葉用型經濟植物，春梢萌發時間是關系茶葉經濟價值的重要生物學性狀。因此，選育茶樹早生品種，對提升茶葉品質和經濟效益具有重要的現實意義。以鐵觀音為參考基因組，通過全基因組關聯分析，篩選到一個與茶樹春梢萌發早晚高度相關的基因CsAL1（Auxilin-like 1，TGY040711）。運用SNP calling獲得CsAL1各樣本的SNPs，將SNPs與其春梢萌發表型進行關聯分析，獲得與早生性狀顯著相關的SNP位點。分析各SNPs的酶切位點，選擇合適位點開發茶樹早生性狀相關CAPS分子標記。利用標記對12份茶樹材料基因組DNA進行PCR擴增和酶切檢測，隨后在72份茶樹材料中進一步驗證，以期借助CAPS分子標記技術為探究CsAL1中單堿基位點突變與茶樹早生性狀的聯系提供參考，為茶樹早生品種的選育提供理論支撐。

關鍵詞：茶樹；SNP；CAPS分子標記；早生；分子標記育種

中圖分類號：S571.1；S326 " " " " " " "文獻標識碼：A " " " " " " "文章編號：1000-369X（2024）02-207-12

The Development of CAPS Molecular Markers for CsAL1， A Gene Associated with Early and Late Spring Tip Emergence in Tea Plants

HUANG Mengdi1， CHEN Lan1， SU Qin1， HU Jinyu1， LIU Guizhi1，

TAN Yueping3， LIU Shuoqian1，2*， TIAN Na1，2*

1. Key Laboratory of Tea Science of Ministry of Education， Changsha 410128， China; 2. Department of Tea Science， College of Horticulture， Hunan Agricultural University， Changsha 410128， China; 3. Hunan Tea Group Co.， Ltd.， Changsha 410126， China

Abstract： Camellia sinensis is an economically important foliar plant. The time of spring sprouting is a crucial biological trait that affects the economic value of tea. Therefore， selecting and breeding early sprouting tea cultivars are of great practical significance for improving the quality and economic benefits of tea. The study used ‘Tieguanyin’ as the reference genome and screened a gene， CsAL1 （Auxilin-like 1， TGY040711）， which was highly significantly correlated with the time of spring sprouting based on genome-wide association analysis. SNP calling was used to obtain SNPs of CsAL1 in each sample. Correlation analysis of the SNPs and spring sprouting phenotypes was performed to obtain the key SNP loci that associating with spring sprouting traits. Suitable enzyme cleavage sites were analyzed for each SNP to develop CAPS molecular markers related to early-sprouting traits in tea plants. PCR was used to amplify the CAPS molecular markers， which were then digested in the genomic DNA of 12 tea materials. The markers were further verified in 72 tea materials to provide a reference for the association between single-base mutations in CsAL1 and early sprouting traits using CAPS molecular markers. This study also provided theoretical support for the breeding of early sprouting tea cultivars.

Keywords： Camellia sinensis， SNP， CAPS molecular marker， early sprouting， molecular marker breeding

茶樹是多年生常綠木本植物，分布在熱帶、溫帶地區，是一種重要的葉用飲料作物，茶已成為全世界最受歡迎的無酒精飲料之一[1-2]。茶芽在冬季進入休眠，是茶樹抵抗外界低溫的重要生存機制，其芽休眠的形成及解除與春芽萌發期息息相關。茶樹越冬后第一次萌發的芽葉采制而成的茶葉稱為春茶，由于其營養物質豐富，葉肉肥厚，維生素含量較高，受到很多茶客青睞[3]。此外，茶葉依據原料嫩度進行分類，其價差可達5～10倍[4]。由此可見，萌發早的茶樹具有相對更高的栽培價值，選育早生茶樹品種是茶樹育種工作者的一個有價值的目標。

網格蛋白介導的內吞作用參與多種植物的重要生理過程，如調節天麻的共生種子萌發，在水稻花粉萌發中發揮重要作用[5-6]。Hou等[7]的研究表明，網格蛋白相關蛋白SCD2/RRP1通過參與擬南芥的脫落酸信號轉導影響種子發育和生長。輔助蛋白（Auxilin）是一種防御相關蛋白，參與網格蛋白介導的內吞作用，調節信號轉導、抗菌防御和抗應激等多種生物過程[8]。在擬南芥中，Auxilin-like 1和Auxilin-like 2過表達會導致種子發芽停滯[9]，Auxilin-like 6可能是藍光受體PHOT1和PHOT2介導的葉綠體運動的重要組成部分[10]，Ezaki等[11]還發現Auxilin-like過表達會抑制擬南芥根系鋁的攝取。

CAPS分子標記是將特異性擴增與限制性酶切結合為一體的技術，能從分子水平區分不同品種間遺傳物質的變異信息，已在水稻[12-13]、小麥[14]、甜瓜[15]、番茄[16-17]、黃麻[18]、馬鈴薯[19-20]等作物的種質鑒定、輔助育種、基因鑒定和圖譜構建等領域得到廣泛應用。該技術具有共顯性、所需DNA量少、操作簡便和結果穩定可靠等優點[21]。目前，鑒定茶樹早生品種主要以表型選擇為主，分子標記輔助選擇應用較少[3，22-23]。人工選擇茶樹早生品種費時費力，易受環境和基因型影響，這種選擇更適用于簡單的質量性狀。茶樹春梢萌發期是由多基因控制的復雜性狀，利用分子標記篩選早生茶樹資源是未來茶樹育種的一個重要方向。

1 材料與方法

1.1 茶樹Auxilin-like 1（CsAL1）及其啟動子SNP分析

基于課題組全基因組關聯分析數據，以鐵觀音基因組為參考基因組，通過SNP calling獲得CsAL1的SNPs，對其SNPs進行統計分析。

1.2 SNPs與茶樹早生性狀的關聯分析

利用SNPassoc R程序包對126個樣本CsAL1的39個SNPs進行處理與分析，選用顯性、隱性、共顯性及超顯性模型對各SNPs的基因型與樣本春梢萌發表型進行關聯分析。

1.3 SNP位點特異性CAPS設計

用R軟件提取CsAL1野生型和突變型核苷酸序列，利用在線工具CAPS Designer[24]對各SNPs的酶切位點進行分析，選擇合適的SNPs進行CAPS分子標記開發，借助SnapGene軟件在SNP位點上下游500 bp左右設計特異性引物，引物序列送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行合成。

1.4 茶樹春梢萌發表型觀測

在2022年3月17日、2023年3月26日對湖南省農業科學院高橋科研基地（113°E，28°N）的84份茶樹材料進行田間觀測（表1，其中1～72為湘西保靖黃金茶群體，73～84為已知品種），使用萌展值（Sprouting index，SPI）記錄茶樹群體的春梢萌發表型性狀，當大多數后代達到“一芽一葉”的狀態時進行表型觀測，用數字記錄每個芽的SPI，其中0表示休眠，0.5表示開始發芽，1表示一芽，1.5表示一芽一葉初展，2表示一芽一葉，2.5表示一芽二葉初展，3表示一芽二葉，以此類推，萌展值越大，其春梢萌發期越早。選取粗壯枝條的前兩個腋芽進行SPI評分，個體的SPI為5～10個越冬芽的平均值。根據同期觀測的常見早生、中生、晚生品種的SPI值可將茶樹春梢萌發類型大致分為3種：早生品種（SPI≥3），用符號E表示；晚生品種（SPI＜1.9），用符號L表示；中生品種（1.9≤SPI＜3），用符號M表示。

1.5 樣本采集及DNA提取

采集觀測的84份茶樹材料的一芽二葉，經液氮固樣后保存于﹣80 ℃冰箱。采用FastPure? Plant DNA Isolation Mini Kit（南京，諾唯贊）的試劑盒提取基因組DNA，用1%的瓊脂糖凝膠電泳驗證其DNA質量，樣品儲存于﹣20 ℃冰箱備用。

1.6 PCR擴增及酶切檢驗

以12份SPI值有差異的茶樹品種（表1中73～84，2022年SPI值依次為3.25、1、0.75、2.85、2.5、2、2.55、2.25、1.65、1.9、3.25、2.15，2023年SPI值依次為3.3、1.2、0.75、2.65、2.15、2、2.55、2.25、1.7、1.85、3.5、2.35）進行PCR擴增。PCR擴增酶2×Rapid Taq Master Mix購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司，酶切反應所用限制性內切酶BstNI及DraI購自賽默飛科技公司。PCR擴增采用的反應體系為：DNA模板1 μL，2×Rapid Taq Master Mix 10 μL，上下游引物各1 μL，ddH2O補足至20 μL。PCR擴增的反應條件為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，共35個循環；72 ℃繼續延伸5 min，4 ℃保存。擴增結束后，取4 μL PCR擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，其余樣品保存于4 ℃備用。利用限制性內切酶酶切PCR擴增產物，酶切體系包括擴增產物5 μL，限制性內切酶0.5 μL，10×FastDigest Green Buffer 1 μL，ddH2O 8.5 μL；酶切條件為37 ℃孵育30 min，80 ℃，5 min滅酶活。將所得酶切產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，并分析CAPS標記在12個茶樹品種間的多態性。

1.7 CAPS分子標記進一步驗證

選擇多態性良好的標記以相同方法對72份茶樹材料（表1中1～72）進行PCR擴增及酶切反應檢測，將所得酶切產物分別在1%的瓊脂糖凝膠上進行電泳，然后在凝膠成像儀上觀察電泳帶型，分析其篩選早生茶樹材料的準確性。

2 結果與分析

2.1 CsAL1及其啟動子SNP分析

對茶樹樣本CsAL1的SNPs進行檢測與分析，結果表明（表2），該基因編碼區僅含有3個SNP位點，且均為非同義突變，分別是Chr04：227559198、Chr04：227559229、Chr04：227559235。突變類型分析結果表明，所檢測的樣本中各位點均有雜合突變，除位點Chr04：227559235外無純合突變。此外，該基因的啟動子區含有36個SNPs，在所檢測樣本中36個位點均有雜合突變。

2.2 SNPs與茶樹春梢萌發的關聯分析

獲得CsAL1及其啟動子的SNPs后，對各樣本各位點的基因型與春梢萌發表型進行關聯分析，結果（圖1）表明，與茶樹早生性狀顯著相關的SNP位點（-log10（p-value）≥1.3）有19個，其中在共顯性模型下有15個SNP位點與早生性狀相關，分別是Chr04.227558569、Chr04.227557336、Chr04.227558248、Chr04.227559167、Chr04.227559073、Chr04.227557550、Chr04.227559229、Chr04.227559198、Chr04.227557704、Chr04.227558367、Chr04.227558479、Chr04.227557543、Chr04.227557334、Chr04.227557625、Chr04.227557377；在顯性模型有12個SNP位點與早生性狀相關，分別是Chr04.227558569、Chr04.227559167、Chr04.227558248、Chr04.227557336、Chr04.227559073、Chr04.227557550、Chr04.227557543、Chr04.227557704、Chr04.227558479、Chr04.227558367、Chr04.227557625、Chr04.227557377；在隱性模型下有14個SNP與早生性狀相關，分別是Chr04.227558569、Chr04.227557336、Chr04.227558248、Chr04.227557704、Chr04.227558367、Chr04.227558479、Chr04.227557550、Chr04.227559073、Chr04.227557334、Chr04.227557339、Chr04.227558471、Chr04.227557535、Chr04.227557245、Chr04.227557377；在超顯性模型下有5個SNP位點與早生性狀相關，分別是Chr04.227558569、Chr04.227559167、Chr04.227559073、Chr04.227558248、Chr04.227557550。而與茶樹早生性狀極顯著相關[-log10（p-value）≥3.1]的位點有6個，分別是Chr04.227558569、Chr04.227559167、Chr04.227559073、Chr04.227558248、Chr04.227557550、Chr04.227557336，這6個SNP位點可用于茶樹早生性狀相關的分子標記開發。

2.3 SNP位點CAPS分子標記開發

對與茶樹早生性狀相關的6個SNP位點的酶切位點進行分析，選擇了Chr04：227558248和Chr04：227558569兩個SNPs進行CAPS分子標記開發（表3）。

Chr04：227558248位點是C/G突變（表2），設計引物擴增出長度為488 bp的片段，僅帶有C等位類型的材料，可被限制性內切酶BstNI識別并將片段切割為350 bp和138 bp兩部分，僅帶有G等位類型的材料擴增片段不能被BstNI識別故僅呈現為一條488 bp的片段，而帶有C/G基因型的材料則呈現488 bp、350 bp和138 bp 三部分。

Chr04：227558569位點是A/T突變（表2），設計引物擴增出長度為494 bp的片段，僅帶有A等位類型的材料，可被限制性內切酶DraI識別并將片段切割為317 bp和177 bp兩部分，僅帶有T等位類型的材料擴增片段不能被DraI識別故僅呈現為一條494 bp的片段，而帶有A/T基因型的材料則呈現494 bp、317 bp和177 bp三部分。

2.4 茶樹春梢萌發表型觀測

根據茶樹群體田間觀測的SPI值繪制直方圖（圖2）。84份茶樹種質中，2022年春梢萌發類型包括19份早生材料（E），32份中生材料（M），33份晚生材料（L）；2023年春梢萌發類型包括16份早生材料（E），34份中生材料（M）和34份晚生材料（L）。其中兩年都標記E的有16份，兩年都標記M的有29份，兩年都標記L的有33份，6份茶樹材料兩年的觀測所屬類型有所不同。

2.5 PCR擴增和酶切檢驗

以選取的12個茶樹材料基因組DNA為模板，用2對特異性引物分別擴增供試材料，用BstNI和DraI兩種限制性內切酶酶切擴增產物，發現兩個突變位點均具有多態性（圖3、圖4）。經BstNI酶切的電泳電泳圖出現3種帶型，將12個茶樹材料2022年及2023年春梢萌發類型與酶切條帶進行比對分析，發現有且只有表現為早生的2個茶樹材料烏牛早和早青茶在電泳圖上表現為1條帶，說明利用此標記可鑒定茶樹早生性狀。將經DraI酶切的電泳帶型與春梢萌發類型比對，發現雖然酶切產物具有一定的多態性，出現了2條帶、3條帶，但早生茶樹材料未表現出區別于其他材料的酶切條帶，與茶樹春梢萌發性狀吻合度較低。

2.6 CAPS分子標記進一步驗證

選擇標記Chr04：227558248_C/G進行CAPS分子標記的進一步驗證，圖5為72份茶樹材料經CAPS分子標記檢測得到的酶切片段電泳圖，其中有28份材料酶切帶型為2條，28份材料酶切帶型為3條，16份材料酶切帶型為1條。根據電泳圖，2022年觀測為早生的17份茶樹材料，有14份符合早生帶型（1條帶），篩選的準確率為82.35%，2023年觀測為早生的14份茶樹材料均符合早生帶型（1條帶）。

3 討論

SNP主要是指在基因組水平上由單個核苷酸（A/T/C/G）的變異所引起的DNA序列多態性，包括插入、缺失、顛換、轉換四種類型，是基因組中最常見的變異形式。與其他分子標記相比，SNP分辨率較高也較為豐富，覆蓋基因組范圍大，遺傳比較穩定，是繼SSR標記之后的第三代遺傳標記[25]。隨著測序技術的不斷發展，測序成本的降低和各物種基因組的相繼公布使得SNP標記迅速發展，逐步取代SSR標記，廣泛應用于植物領域的分子標記輔助育種和作物經濟性狀基因檢測[26-27]。在茶樹中，王澤涵等[28]利用SNP分子標記技術構建了漳州南部茶樹種質資源的指紋圖譜和分子身份證，Wang等[26]開發了用于茶樹起源分析和種質鑒定的SNP標記。羅祥宗等[29]通過對茶樹葉綠體基因組進行SNP分析，篩選出適用于茶樹種質鑒別與母系追溯的25個SNP位點，并將SNP位點組成的DNA指紋圖譜結合茶樹品種資源基本信息進行數字編碼，形成茶樹品種資源分子身份證，并構建相應的條形碼

和二維碼用于品種識別。目前，SNP的檢測方法已有十余種，如TaqMan探針法、毛細管電泳以及KASP檢測，但大部分方法均有其不足之處，存在諸如操作繁瑣、成本較高等問題，阻礙了其在植物遺傳育種中的應用[30]。將SNP轉化成CAPS標記或dCAPS標記成本較低，操作簡便。張成才等[31]將8個茶樹品種中檢測到的39個SNPs轉化為CAPS標記，驗證了將茶樹SNPs轉化成CAPS標記進行檢測的可行性。同時，此標記可用于茶樹遺傳多態性檢測和茶樹遺傳圖譜構建的研究。SNP被認為是聯系基因型和表現型之間關系的橋梁，茶樹中許多基因的SNP已被分析[32-34]。本研究通過對CsAL1基因的SNP進行分析，發現該基因變異較為豐富，共檢測到40個SNP位點，絕大多數SNP位于基因的非編碼區。其中20個轉換，包括C/T 13個和G/A 7個；18個顛換，包括A/C 1個，G/C 3個，T/G 4個，A/T 10個；2個缺失，無插入位點，3個非同義變異位點，1個同義變異位點；6個極顯著相關位點包括3個轉換、2個顛換和1個缺失。

全基因組關聯分析可利用高通量測序技術，分析數以萬計的SNPs，以及這些SNPs與表型性狀的相關性，從而全面地揭示不同復雜性狀的遺傳機制。目前為止，全基因組關聯分析已在茶樹外觀表型性狀、茶葉品質成分和茶樹群體結構研究中取得了一系列進展[35-37]。在茶樹春芽萌發時間的研究中，Liu等[38]通過結合QTL定位、GWAS和轉錄組學分析，確定了茶樹中與春芽萌發時間相關的候選基因CsDREB17，為進一步揭示茶樹春梢萌發時間的分子調控機制提供了遺傳基礎。Wang等[3]采用全基因組關聯分析鑒定出一個與茶樹早春芽萌發顯著相關的SNP位點，在SNP位點100 kb區域范圍內篩選出7個候選基因，并成功開發了1個與休眠緊密相關的dCAPS標記，此標記可用于分子標記輔助選擇育種。本研究基于全基因組關聯分析，篩選到了與茶樹早生性狀極顯著關聯的7個SNPs，選擇其中2個SNPs開發CAPS分子標記，對12個不同茶樹材料基因組DNA進行PCR擴增和酶切多態性驗證，發現標記CAPS-Chr04：227558248可用于鑒定茶樹早生性狀。隨后在72個茶樹材料中進一步檢驗，發現該標記鑒定早生茶樹材料的準確率可達82.35%以上，證實了該標記的穩定性和重復性較好，鑒定茶樹早生品種準確率較高。這也表明CsAL在茶樹春梢萌發中存在作用，但具體調控機制有待進一步研究。由于開發CAPS分子標記需要篩選合適的限制性內切酶，故只開發了2個CAPS分子標記，此外，在用于多態性檢驗的早生茶樹品種中只包含了早青茶和烏牛早兩個公知早生品種，后續可繼續對茶樹春梢萌發早晚關聯基因開發CAPS或dCAPS分子標記，為篩選茶樹早生品種提供更多可用SNPs。隨著生物信息學技術發展，將分子標記技術與茶樹育種工作結合，是未來茶樹分子育種發展的重要研究方向。

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