鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-9 抑制高脂食物誘導(dǎo)小鼠前列腺炎的機(jī)制研究

辛儲林 陳名陽 胡亞榮 蘇娟 田新雁 李娟

前列腺炎（Prostatitis）是男性泌尿系統(tǒng)的常見病，其在男性人群中的發(fā)病率約為30%[1]。據(jù)流行病學(xué)調(diào)查統(tǒng)計，慢性非細(xì)菌性前列腺炎是最常見的前列腺炎類型。前列腺組織炎癥在一定程度上可以推動良性前列腺增生癥（Benign prostatic hyperplasia，BPH）的發(fā)生發(fā)展，而BPH 是引起男性出現(xiàn)尿路癥狀最常見的因素[2]。前列腺炎的主要癥狀表現(xiàn)為盆腔、下腹部疼痛以及性功能障礙[3]，對患者的生命質(zhì)量及健康造成嚴(yán)重影響[4]，同時長期的前列腺炎可能導(dǎo)致前列腺癌的發(fā)生。關(guān)于前列腺炎的治療，臨床上只能以改善癥狀為主，無法根治[5]。因此，研究前列腺炎的發(fā)病原因，闡明其具體機(jī)制，尋找新的藥物治療靶點(diǎn)，對改善患者疼痛，提高生活質(zhì)量具有重要的實(shí)踐指導(dǎo)意義。

高脂食物引起的肥胖與多種疾病密切相關(guān)，如慢性腎病[6]、糖尿病[7]以及阿爾茨海默病[8]等。此外，其也與前列腺相關(guān)疾病有關(guān)。據(jù)研究報道，肥胖是男性出現(xiàn)慢性非細(xì)菌性前列腺炎的高風(fēng)險因素之一[9]，腰圍和體質(zhì)量指數(shù)與良性前列腺增生之間存在因果關(guān)系[10]。高血糖、高血脂會導(dǎo)致男性出現(xiàn)嚴(yán)重的前列腺組織炎癥，并能促進(jìn)良性前列腺增生的發(fā)生、發(fā)展[11]。

鋅是人體中必須的微量元素，具有抗氧化、促進(jìn)蛋白質(zhì)合成和酶促反應(yīng)等重要的生理功能。鋅離子的減少會導(dǎo)致人體穩(wěn)態(tài)失衡，導(dǎo)致生長緩慢和糖尿病等多種疾病[11]。此外，鋅是免疫系統(tǒng)的重要組成部分，鋅缺乏會抑制免疫激活，促進(jìn)炎癥相關(guān)因子IL-6、IL-1β 和TNF-α 的分泌，減少抑炎因子的釋放，在皮膚炎癥、神經(jīng)炎癥和氣管炎癥等多種炎癥中發(fā)揮重要作用[12，13]。研究表明鋅有助于提高前列腺的免疫功能，能夠幫助細(xì)胞以健康的方式生長和增殖，從而保護(hù)前列腺和性健康[14]。鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-9（Zinc transporter-9，ZnT-9）屬于鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族的重要組成部分，其可以與鋅離子融合，負(fù)責(zé)將細(xì)胞胞漿中的鋅離子運(yùn)送到細(xì)胞器，對鋅發(fā)揮正常功能具有重要作用[15]。本研究利用高脂食物誘導(dǎo)小鼠前列腺炎，使用硫酸鋅進(jìn)行灌胃，檢測鋅是否可以抑制小鼠前列腺炎，并研究前列腺組織中ZnT-9的表達(dá)變化情況，從而探究鋅改善前列腺炎的相關(guān)機(jī)制，為前列腺炎的治療和預(yù)防提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物30 只雄性3 周齡C57BL/6 健康小鼠，體質(zhì)量18～20g，購自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司[SCXK（京）2019-0010]，普通飼養(yǎng)飼料和高脂食物飼料均購自該公司。小鼠飼養(yǎng)于大理大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)樓，5 只/籠，給予充足的新鮮飼料及滅菌水，飼養(yǎng)室溫度（21±3）℃，濕度為40%～70%，保證每12h 的光暗循環(huán)。小鼠實(shí)驗(yàn)操作符合大理大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理要求（倫理批號：2022-PZ-154）。

1.2 藥品與試劑生理鹽水（山東辰欣藥業(yè)，2209 250721），硫酸鋅溶液（上海阿拉丁，H2231754），4%多聚甲醛固定液（深圳希景生物，220428514），無水乙醇（昆明汕滇藥業(yè)，20211227），HE 染色試劑盒（武漢博士德，AR1180），免疫組化試劑盒（上海生工生物，D601037-0020），IL-6 抗體（上海碧云天生物，AF7236），TNF-α 抗體（武漢三鷹生物，60291-1-Ig），ZnT-9 抗體（美國圣克魯斯，sc-271956 HRP）。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器動物手術(shù)器材（上海金鐘醫(yī)藥儀器）、組織包埋機(jī)（浙江科迪儀器）、病理切片機(jī)（浙江科迪儀器）、小動物電子秤（張家港市青松生物醫(yī)學(xué)儀器）、電子天平（美國奧豪斯儀器）、純水儀（上海和泰儀器）、烘箱（上海一恒科學(xué)儀器）、壓力蒸汽滅菌器（上海博迅醫(yī)療生物儀器）、動物操作平臺（成都泰盟）、光學(xué)顯微鏡（日本奧林巴斯）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 實(shí)驗(yàn)動物的分組及給藥 將30 只小鼠隨機(jī)分成普通食物組、高脂食物組與高脂食物+鋅組，各10 只，將普通食物組視作正常對照。普通食物組小鼠飼喂普通飼料，高脂食物組、高脂食物+鋅組小鼠飼喂高脂飼料，喂養(yǎng)1 周待小鼠適應(yīng)后，給予普通食物組、高脂食物組小鼠生理鹽水（20mL·kg-1·d-1）灌胃，高脂食物+鋅組小鼠硫酸鋅溶液（15mg·kg-1·d-1）灌胃[16]，持續(xù)10 周。

1.4.2 獲取前列腺組織、計算前列腺指數(shù) 待小鼠14 周齡時稱重記錄后，麻醉處死，將其腹部向上放平固定，剪開下腹部，將膀胱、尿道、儲精囊和前列腺全部提起，小心清除臨近組織，將前列腺分離出來，用電子天平稱重。通過對小鼠前列腺指數(shù)（前列腺質(zhì)量/體質(zhì)量）進(jìn)行計算，可以直觀掌握小鼠前列腺的增生狀況。

1.4.3 制備前列腺組織病理切片行HE 染色 將取下的小鼠前列腺組織放入4%多聚甲醛固定液進(jìn)行組織固定，4℃保存48h，之后再進(jìn)行脫水→包埋→切片，然后使用HE 試劑盒中的蘇木素、伊紅分別對小鼠的前列腺組織進(jìn)行染色，使用光學(xué)顯微鏡觀察小鼠前列腺組織中炎癥細(xì)胞的浸潤情況，并進(jìn)行拍照。

1.4.4 檢測前列腺組織中IL-6、TNF-α 和ZnT-9 表達(dá)水平 采用免疫組織化學(xué)染色測定各組小鼠前列腺組織中IL-6、TNF-α 和ZnT-9 的表達(dá)水平。將小鼠前列腺組織切片放置在65℃烘箱中2h，使用二甲苯進(jìn)行脫蠟、使用梯度乙醇（100%、95%、80%、70%，濃度從高到低）進(jìn)行脫水，使用檸檬酸鈉（10mmol/L，pH=6.0）緩沖液在高溫高壓狀態(tài)下對小鼠前列腺組織進(jìn)行抗原熱修復(fù)，之后將小鼠前列腺組織切片浸泡在3%過氧化氫中10min，以去除內(nèi)源性過氧化物酶，經(jīng)PBS 漂洗后，加入預(yù)先配制好的一抗，放入4℃冰箱中。一抗孵育過夜后回收，滴加二抗，室溫孵育2h。之后進(jìn)行DAB 顯色，蘇木精浸泡染色，再使用梯度乙醇進(jìn)行脫水，中性樹脂進(jìn)行封片。然后在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞陽性信號并拍照，使用Image J 軟件統(tǒng)計小鼠前列腺組織中的陽性細(xì)胞數(shù)并計算百分比。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法采用GraphPad Prism 8.0 軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠前列腺指數(shù)比較與普通食物組相比，高脂食物組小鼠體質(zhì)量顯著增加（P＜0.001），而與高脂食物組相比，高脂食物+鋅組小鼠體質(zhì)量下降。此外，高脂食物組小鼠前列腺質(zhì)量顯著大于普通食物組（P＜0.001），與高脂食物組相比，高脂食物+鋅組前列腺質(zhì)量顯著減小（P＜0.01）。與普通食物組相比，高脂食物組小鼠前列腺指數(shù)顯著增大（P＜0.01），而與高脂食物組相比，高脂食物+鋅組小鼠前列腺指數(shù)顯著減?。≒＜0.05）。見表1。

表1 各組小鼠的前列腺指數(shù)（）

表1 各組小鼠的前列腺指數(shù)（）

注：與普通食物組相比，①P＜0.05，②P＜0.01，③P＜0.001；與高脂食物組相比，④P＜0.05，⑤P＜0.01

2.2 各組小鼠前列腺組織中炎性細(xì)胞的浸潤情況與普通食物組小鼠相比，高脂食物組小鼠前列腺組織中炎性細(xì)胞較多；與高脂食物組相比，高脂食物+鋅組小鼠前列腺組織中炎性細(xì)胞明顯減少。見圖1。

圖1 前列腺組織的病理切片

2.3 各組小鼠前列腺組織中IL-6 的表達(dá)情況高脂食物組小鼠前列腺組織中IL-6 的表達(dá)與普通食物組相比顯著增加（P＜0.01）；高脂食物+鋅組小鼠前列腺組織中IL-6 的表達(dá)與高脂食物組相比顯著減少（P＜0.05）。見圖2、表2。

圖2 各組小鼠前列腺組織中IL-6 的表達(dá)情況

表2 各組小鼠前列腺組織中陽性細(xì)胞數(shù)統(tǒng)計（%，）

表2 各組小鼠前列腺組織中陽性細(xì)胞數(shù)統(tǒng)計（%，）

注：與普通食物組相比，①P＜0.05，②P＜0.01；與高脂食物組相比，③P＜0.05

2.4 各組小鼠前列腺組織中TNF-α 的表達(dá)情況高脂食物組小鼠前列腺組織中TNF-α 的表達(dá)與普通食物組相比顯著增加（P＜0.05）；與高脂食物組相比，高脂食物+鋅組小鼠前列腺組織中TNF-α 的表達(dá)顯著減少（P＜0.05）。見圖3、表2。

圖3 各組小鼠前列腺組織中TNF-α 的表達(dá)情況

2.5 各組小鼠前列腺組織中ZnT-9 的表達(dá)情況高脂食物組的小鼠與普通食物組的小鼠相比，前列腺組織中ZnT-9 的表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01）；與高脂食物組相比，高脂食物+鋅組小鼠前列腺組織中ZnT-9 的表達(dá)水平顯著增加（P＜0.05）。見圖4、表2。

圖4 各組小鼠前列腺組織中ZnT-9 的表達(dá)情況

3 討論

前列腺炎是男性泌尿系統(tǒng)的常見病，發(fā)病率逐年升高，無法根治，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。前列腺炎的發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚，其致病因素較多，如遺傳、年齡和飲食習(xí)慣等都和前列腺炎的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，其中肥胖、高血糖和高血脂更是誘發(fā)前列腺炎的高危因素[2]。有研究發(fā)現(xiàn)，高脂食物可增加小鼠前列腺組織中IL-6、TNF-α 和IL-8等炎性細(xì)胞因子的表達(dá)水平，誘導(dǎo)小鼠前列腺組織產(chǎn)生慢性炎癥[11]。本研究選擇高脂食物致小鼠前列腺炎的模型，旨在研究肥胖和高脂在前列腺炎中的作用，同時該模型易操作，能很好地模擬慢性前列腺炎，具有很大的實(shí)際指導(dǎo)意義。在本研究中，與普通食物組相比，高脂食物組小鼠體質(zhì)量顯著增加，前列腺指數(shù)也顯著增大。

鋅是人體中非常重要的微量元素，在保證人體能夠進(jìn)行正常的生命活動中具有關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)，鋅具有抗炎作用，能夠抑制C 反應(yīng)蛋白，IL-6和TNF-α 等炎癥因子的形成。鋅缺乏會導(dǎo)致皮膚炎、口腔炎和腸炎等多種炎癥的發(fā)生，同時會增加人體細(xì)菌感染導(dǎo)致炎癥的概率[17]。此外，多項(xiàng)研究表明鋅對多種肥胖相關(guān)的并發(fā)癥都具有改善效果，且鋅可以延緩肥胖導(dǎo)致的腎臟病變，而鋅缺乏可以加快肥胖導(dǎo)致的心臟肥大等進(jìn)程[18]。本研究中，高脂食物組小鼠在補(bǔ)鋅后，前列腺組織中炎癥細(xì)胞的浸潤減少，IL-6、TNF-α 的表達(dá)水平降低，表明鋅可以改善小鼠前列腺組織的炎癥情況。

鋅正常功能的發(fā)揮離不開鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的作用，其異常表達(dá)已被證明與很多疾病有關(guān)，包括糖尿病、癌癥和阿爾茨海默癥等[19]。研究發(fā)現(xiàn)患有糖尿病的大鼠ZnT-1/ZnT-8 表達(dá)減少[20]。另外，ZnT-6 表達(dá)降低與肥胖導(dǎo)致的小鼠弱精子癥密切相關(guān)[21]。本研究中，與普通食物組相比，高脂食物組小鼠前列腺組織中ZnT-9 表達(dá)顯著降低，而高脂食物+鋅組小鼠前列腺組織中ZnT-9 表達(dá)較高脂食物組增加，說明ZnT-9 表達(dá)減少可能與高脂導(dǎo)致的小鼠前列腺炎發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，補(bǔ)鋅可以上調(diào)ZnT-9的表達(dá)，從而延緩小鼠前列腺的炎癥反應(yīng)。然而，本研究只是探究了鋅對于高脂食物小鼠前列腺炎的抑制作用，發(fā)現(xiàn)ZnT-9 表達(dá)改變，至于高脂食物如何導(dǎo)致ZnT-9 表達(dá)下調(diào)以及鋅如何通過ZnT-9改善前列腺炎癥的具體機(jī)制有待于進(jìn)一步探索。

綜上所述，鋅可以降低高脂食物小鼠的前列腺指數(shù)，減弱前列腺組織中炎癥細(xì)胞的浸潤，降低前列腺組織中炎癥細(xì)胞因子IL-6、TNF-α 的表達(dá)，這可能與上調(diào)ZnT-9 的表達(dá)有關(guān)。