塞來昔布關鍵中間體HPLC 含量測定方法的建立

劉曉蓮

（河北冀衡藥業股份有限公司，河北 衡水 053400）

0 引 言

塞來昔布（Celecoxib），化學名4-[5- （4- 甲基苯基） -3- （三氟甲基） 吡挫-1- 基]苯磺酰胺，是臨床中常用的新一代環氧化酶-2（COX-2） 的特異性抑制劑，由美國西爾藥廠研制開發，可通過抑制環氧化酶-2 阻止炎性前列腺素類物質的產生，屬于非甾體抗炎藥，表現出優異的抗炎鎮痛作用，可顯著減少胃腸道不良反應，用于治療各類急、慢性關節炎和類風濕性關節炎等炎性疾病。無論對于急性創傷外傷導致的急性疼痛，還是外科手術后的止痛，都是理想的鎮痛藥物。

目前關于塞來昔布合成的文獻和專利已有不少，在塞來昔布的合成工藝中，一般以對甲基苯乙酮和三氟乙酸乙酯經Claisen 縮合反應制得中間體，然后與對肼基苯磺酰胺鹽酸鹽反應制得塞來昔布，因此對肼基苯磺酰胺鹽酸鹽的質量檢測對塞來昔布的合成來說有著至關重要的作用。但目前關于中間體的液相色譜檢測方法的報道較少。本研究建立了對肼基苯磺酰胺鹽酸鹽的含量的高效液相色譜（HPLC） 測定方法，并對其進行了驗證。

1 對肼基苯磺酰胺鹽酸鹽結構式

對肼基苯磺酰胺鹽酸鹽結構式如圖1 所示。

圖1 對肼基苯磺酰胺鹽酸鹽結構式Fig.1 Structural formula of 4-Hydrazinobenzene-1-sulfonamide hydrochloride

2 主要儀器與試劑

UltiMate 3000 型高效液相色譜，購自賽默飛世爾科技（中國） 有限公司；PURELAB flex 型超純水儀，購自威立雅水處理技術（上海） 有限公司；BSA224S 型電子分析天平，購自賽多利斯科學儀器（北京） 有限公司；KQ-250DB 型數控超聲波清洗器，購自昆山市超聲儀器有限公司。

對肼基苯磺酰胺鹽酸鹽對照品，購自河北蒲葵生物醫藥科技有限公司；對肼基苯磺酰胺鹽酸鹽對照品，河北冀衡藥業股份有限公司自制；辛烷磺酸鈉，購自天津市大茂化學試劑廠；三氟乙酸，購自天津市大茂化學試劑廠；色譜純乙腈，購自美國迪馬科技有限公司；水為超純水。

3 方法與結果

3.1 色譜條件

色譜柱：Agllent ZORBAX SB-C18 柱 （4.6 mm×250 mm，5 μm）；

流動相：緩沖液（1.65 g 庚烷磺酸鈉置于1 000 ml 容量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，用三氟乙酸調pH 值至2.5）：乙腈=88：12；

進樣量：20 μL；

檢測波長：233 nm；

流速：1.0 mL/min；

柱溫：25℃。

3.2 溶液配置

供試品溶液制備方法：精密稱取對肼基苯磺酰胺鹽酸鹽自制樣品10.0 mg，置25.0 mL 量瓶中，用流動相溶解，并加流動相至刻度，搖勻，即得。對照品溶液制備方法：精密稱取對肼基苯磺酰胺鹽酸鹽對照品10.0 mg，置25.0 mL 量瓶中，用流動相溶解，并加流動相至刻度，搖勻，即得。

3.3 系統適應性實驗

按照2.2 項下制備方法配制6 份供試品溶液，按照上述色譜條件進行分析，記錄色譜圖。系統適用性結果見表1。

表1 對肼基苯磺酰胺鹽酸鹽含量測定HPLC 方法系統適用性試驗結果Table 1 System suitability test results for determination of 4-Hydrazinobenzene- 1-sulfonamide hydrochloride content by HPLC method

由表1 可得，對肼基苯磺酰胺鹽酸鹽含量測定的保留時間的RSD＜2%，峰面積的RSD＜2%，拖尾因子為1.1，理論塔板數均在，10 000 以上表明該方法系統適用性良好。

3.4 方法學考察

3.4.1 線性范圍對肼基苯磺酰胺鹽酸鹽的工作濃度是0.4 mg/mL，其線性測量范圍為0.2 ～0.6 mg/mL，相當于工作濃度的50%～150%水平。取對肼基苯磺酰胺鹽酸鹽對照品約100 mg，精密稱定，置50 mL量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，當做線性貯備溶液（2.0 mg/mL）。依次精密量取對肼基苯磺酰胺鹽酸鹽對照品貯備液適量，加流動相制成對肼基苯磺酰胺鹽酸鹽含量分別為0.2、0.32、0.4、0.48和0.6 mg/mL 濃度的對照品溶液，依照2.1 項色譜條件，各個濃度進樣2 次，進行檢測分析，分析后記錄色譜圖。

對肼基苯磺酰胺鹽酸鹽線性測定結果見表2。

表2 對肼基苯磺酰胺鹽酸鹽線性測定結果Table 2 Linearity determination results of 4-Hydrazinobenzene- 1-sulfonamide hydrochloride

對肼基苯磺酰胺鹽酸鹽含量測定標準曲線如圖2 所示。

圖2 對肼基苯磺酰胺鹽酸鹽含量測定標準曲線Fig.2 The standard curve determination of 4-Hydrazinobenzene-1-sulfonamide hydrochloride

由表2 可見，以峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線，其線性回歸方程：y=0.241 6x- 1.113 7，R2=0.999 6。結果表明對肼基苯磺酰胺鹽酸鹽的峰面積與其濃度呈較好的線性關系，可用來進行對肼基苯磺酰胺鹽酸鹽含量測定。

3.4.2 專屬性試驗

以2.1 項溶液的配制方法分別配制對肼基苯磺酰胺鹽酸鹽供試品溶液、對照品溶液。分別量取空白溶劑、供試品溶液及對照品溶液各10 μL，按照2.1 項色譜條件進樣檢測分析，并記錄色譜圖。

稀釋劑色譜圖如圖3 所示。

圖3 稀釋劑色譜圖Fig.3 Diluent chromatogram

供試品溶液色譜圖如圖4 所示。

圖4 供試品溶液色譜圖Fig.4 Chromatogram of the test solution

對照品溶液色譜圖如圖5 所示。由以上色譜圖可知，空白溶劑對對肼基苯磺酰胺鹽酸鹽的檢測無干擾，該方法的專屬性良好。

圖5 對照品溶液色譜圖Fig.5 Chromatogram of reference solution

3.4.3 檢測限和定量限

用流動相配制系列濃度對肼基苯磺酰胺鹽酸鹽對照品溶液，分別進樣；記錄色譜圖和S/N，進行檢測限、定量限的測試，S/N=3 對應的濃度為檢測限，S/N=10 對應的濃度為定量限。結果表明對肼基苯磺酰胺鹽酸鹽的檢測限為0.167μg/mL；DPDMP 的定量限為0.501 μg/mL。

3.4.4 穩定性試驗

溶液的穩定性研究用來證明根據相應方法制備溶液在規定的儲存條件下在一定時間內保持穩定。按照2.2 項下制備供試品溶液，儲存在室溫條件下，于適宜時間點分別進樣。考察各時間點下供試品溶液中對肼基苯磺酰胺鹽酸鹽的峰面積變化情況，按照2.1 項色譜條件進行檢測分析，并記錄其峰面積。

對肼基苯磺酰胺鹽酸鹽含量測定溶液穩定性結果見表3。

表3 對肼基苯磺酰胺鹽酸鹽含量測定溶液穩定性結果Table 3 Solution stability results for determination of 4-Hydrazinobenzene-1- sulfonamide hydrochloride content

由表3 可見，對肼基苯磺酰胺鹽酸鹽的峰面積RSD為0.35%，＜2.0%，結果表明該溶液穩定性良好。

3.4.5 重復性試驗

按照2.2 項方法配制6 份供試品溶液，以2.1項的色譜條件進行測試分析，記錄峰面積。同樣，根據對照品溶液的制備方法配制相應的對照品溶液，進行檢測分析，并記錄峰面積。

對肼基苯磺酰胺鹽酸鹽含量測定重復性結果見表4。

表4 對肼基苯磺酰胺鹽酸鹽含量測定重復性結果Table 4 Repeatability results for determination of 4-Hydrazinobenzene-1- sulfonamide hydrochloride content

由表4 可見，平均峰面積為95.252，RSD 為0.29%。該試驗結果顯示，對肼基苯磺酰胺鹽酸鹽峰面積的RSD＜2.0%，表明本方法重復性良好。

3.4.6 加樣回收率試驗

取9 份已知準確含量的供試品溶液，分別加入塞來昔布關鍵中間體對肼基苯磺酰胺鹽酸鹽的對照品，按照2.2 項樣品制備方法和2.1 項色譜條件進行分析，測定峰面積。

對肼基苯磺酰胺鹽酸鹽回收率試驗結果見表5。

表5 對肼基苯磺酰胺鹽酸鹽回收率試驗結果Table 5 Recovery test results of 4-Hydrazinobenzene-1- sulfonamide hydrochloride

由表5 可見，對肼基苯磺酰胺鹽酸鹽的加樣平均回收率為99.77%，RSD 為0.40%。結果表明本方法準確度較好。

3.5 樣品含量測定

取3 批自制對肼基苯磺酰胺鹽酸鹽樣品，按照2.2 項制備方法配制供試品溶液。并按照2.1 項色譜條件進行檢測，檢測結果見表6。結果表明，采用HPLC 法，測定對肼基苯磺酰胺鹽酸鹽的含量，操作簡單，專屬性良好。對肼基苯磺酰胺鹽酸鹽三批樣品的含量均＞99.0%。

表6 3 批自制對肼基苯磺酰胺鹽酸鹽樣品含量測定結果Table 6 Determination results of 4-Hydrazinobenzene-1-sulfonamide hydrochloride samples in 3 batches

3 批自制對肼基苯磺酰胺鹽酸鹽樣品含量測定結果見表6。

4 結 語

對肼基苯磺酰胺鹽酸鹽作為肼的有機衍生物，是塞來昔布合成工藝中的關鍵中間體，其含量對于制備塞來昔布的工藝而言，是十分重要的質量研究內容。本試驗根據高效液相色譜法測得的相關數據，建立了一套對肼基苯磺酰胺鹽酸鹽的高效液相色譜檢測方法，用于控制關鍵中間體的質量，即采用高效液相色譜法，色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18 柱（4.6×250 mm，5 μm）；流動相：緩沖液（1.65 g 庚烷磺酸鈉置于1 000 mL 容量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，用三氟乙酸調pH 值至2.5）∶乙腈=88∶12；流速為1.0 mL/min；進樣量為20 μL；檢測波長為233 nm；柱溫為25 ℃。

經過試驗證明該方法可以直接用于檢測對肼基苯磺酰胺鹽酸鹽含量。本試驗開發的方法通過系統適應性試驗和方法學考察，表明該方法具有分析時間短、方法穩定準確、專屬性、重復性良好等優點，可用于對肼基苯磺酰胺鹽酸鹽的質量研究。目前針對對肼基苯磺酰胺鹽酸鹽多為合成工藝的研究，而本試驗僅完成了含量測定方法的確定。下一步需要對對肼基苯磺酰胺鹽酸鹽進行更多的質量研究，如性狀、鑒別（色譜法和光譜法）、有關物質及穩定性研究等，為塞來昔布及其制劑的質量控制提供更多參考依據。