金屬有機框架納米材料在PET成像和腫瘤治療中的應用研究

魏柯君，薛長國

1. 安徽理工大學 材料科學與工程學院，安徽 淮南 232001；2. 安徽醫科大學附屬巢湖醫院 物資設備科，安徽 合肥 238000

引言

正電子發射計算機斷層顯像（Positron Emission Tomography，PET）是一種核醫學成像技術，作為非侵入性的成像方式，具有更高的檢測靈敏度（低至皮摩爾范圍）、更深的信號穿透力以及更好的定量能力，從而在臨床前和臨床場景中得到更廣泛的應用[1]。相較于其他成像技術，PET 成像專注體內的代謝過程和分子活動，從而使疾病得以在早期階段被發現。金屬有機框架（Metal-Organic Frameworks，MOF）也稱為多孔配位聚合物，已成為生物醫學領域最具吸引力的應用材料之一[2]。作為一類新興的多功能材料，MOF 是由有機連接體（通過配位鍵）橋接的金屬離子簇構成的。相較于傳統納米材料，納米級金屬有機框架（Nanoscale Metal-Organic Frameworks，nMOF）具有多重優勢：優異的結構和組分可調性（允許生產具有不同形狀、尺寸和化學性質的nMOF）、更具適應性的降解能力和更好的化學改性能力，這些顯著優點使得nMOF 被用作癌癥治療工具，并裝載各種治療藥物和成像材料[3-4]。

在癌癥治療管理模式快速發展的時代，科研人員對癌癥生物學基本驅動因素的理解不斷加深，腫瘤微環境的重要性，尤其是新型的生物化學材料和人體免疫系統的發展對癌癥發生的作用愈發凸顯。在我國科研人員對新型材料在癌癥中作用研究不斷深入的背景下，高效的納米材料和靶向治療策略已在臨床試驗階段取得顯著成果。在這些更為科學的治療方法迅速發展的同時，新型納米材料PET 示蹤劑的成像和治療能力已逐漸嶄露頭角，成為一個極具潛力的研究和發展方向。這將為腫瘤治療提供一種創新策略，為患者帶來更有效的治療選擇。

1 資料與方法

1.1 一般資料

有大量研究涉及利用nMOF 材料作為體內癌癥治療劑。例如，基于鉿-二氫卟酚的nMOF 具有良好的結腸癌光動力療法（Photodynamic Therapy，PDT）功效[5]。有研究報道，基于鉿-四氫化葵（4-羧苯基）卟啉的nMOF 聚乙二醇（Polyethylene Glycol，PEG）功能化后，成功用于小鼠乳腺癌模型中的組合PDT 和放射治療[6]。nMOF 卓越的載貨能力使其適用于多種癌癥類型的聯合治療，如小干擾RNA（siRNA）與化療藥物、雙重化療藥物以及化療藥物與PDT 等不同治療組合已在體內腫瘤治療中得到嘗試，并取得了鼓舞人心的成果[7-9]。另一方面，盡管已經收集到令人信服的證據證明nMOF 可以很容易地用于多種成像技術，如CT、MRI 和光學成像。但迄今為止，使用nMOF 作為體內腫瘤顯像劑進行的研究非常有限[10-11]。

本研究的目標是表征適用于PET 成像和腫瘤靶向的生物相容性nMOF，為未來PET 引導下癌癥治療中的貨物運輸做好準備。基于最佳表面積比同時具有不依賴于連接劑的特殊穩定性，選擇含鋯的UiO-66 nMOF[以1，4-苯二甲酸酯和苯甲酸作為橋聯基]作為模板材料[12-13]。此外，由于存在Zr6O4(OH)4連接簇[14]，PET 同位素鋯-89（89Zr，t1/2=78.4 h）可以在合成過程中無縫整合到UiO-66 結構中[15]。使用芘衍生的聚乙二醇（Pyrene-Derived Polyethylene Glycol，Py-PGA-PEG）進行表面工程[16]不僅可以提高UiO-66 在生物介質中的穩定性和分散性，而且還可以為腫瘤靶向分子的整合提供進一步的功能化位點[17]。同時，UiO-66 的高度多孔結構能夠很好地容納親水性和疏水性藥物，并且可以揭示其持續（長達30 d）的pH 依賴性藥物釋放曲線[18]。

1.2 nMOF的合成

通用的合成nMOF 的方法包括納米沉淀法、溶劑熱法、反相微乳液法和表面活性劑模板溶劑熱反應法4 種。納米沉淀法傾向于產生無定形材料；其他3 種方法可以提供結晶材料，能夠更好地控制納米粒子的成核和生長動力學。前兩種方法不含表面活性劑；而后兩種方法依賴表面活性劑，不僅可以控制顆粒合成，還可以穩定這些顆粒。

由于F3 肽可在腫瘤脈管系統中與腫瘤細胞和活化內皮細胞實現有效結合，故本研究選擇其為腫瘤靶向配體[19]。先前的一項研究表明，F3 肽選擇性地與腫瘤細胞表面的核仁素結合，隨后可以轉運到細胞核和細胞質中[20]。細胞表面核仁素表達升高是各種癌細胞，尤其是乳腺癌細胞的重要特征。將半胱氨酸殘基摻入F3 肽的C 末端以促進其與UiO-66 nMOF 的綴合（通過硫醇馬來酰亞胺與芘-PEG-馬來酰亞胺反應）[21]。

在將F3 肽附著到UiO-66 上（最終綴合物將命名為UiO-66/Py-PGA-PEG-F3）后，進行體外測定（如采用流式細胞術和共聚焦熒光顯微鏡）來驗證UiO-66/Py-PGAPEG-F3 對細胞核仁素的靶向特異性。隨后在攜帶原位MDA-MB-231 腫瘤的小鼠身上進行體內PET 成像、器官分布和組織學研究，以確認UiO-66/Py-PGA-PEG-F3的腫瘤靶向能力。阿霉素（Doxorubicin，DOX）加載到UiO-66 結合物上，作為模型抗癌藥物和熒光團來定義納米結合物的位置。除此之外，通過藥物遞送研究進行體內原理驗證，以探究靜脈注射載有DOX 的UiO-66 偶聯物后DOX 增強的腫瘤靶向遞送效率，合成過程如圖1 所示。經Py-PGA-PEG 適度功能化后的UiO-66 偶聯物在小鼠體內表現出良好的生物相容性，組織學染色和血清生化測定的分析結果證實其不會導致急性或慢性毒性。由此推斷，本質上具有放射性的UiO-66 結合物顯示出巨大的應用潛力，未來可用于圖像引導的藥物遞送治療和靶向癌癥治療。

圖1 89Zr-UiO-66/Py-PGA-PEG-F3偶聯物合成路線

1.2.1 在nMOF中整合生物相容性抗癌藥物

現階段可以利用nMOF 的可定制性以提供高藥劑負載，將成像和治療劑納入nMOF。這些加載方法分為兩大類：在nMOF 合成期間直接摻入或合成后加載。這兩種策略的組合也可用于將不同的試劑加載到nMOF 中，以開發多模式成像劑或治療診斷納米顆粒。

在合成后加載策略中，生物醫學相關試劑被加載到nMOF 孔中。在高度多孔的nMOF 合成后，活性劑通過非共價或共價相互作用結合到nMOF 中，首次使用體相MOF 證明了非共價藥物負載。釋放研究表明，藥物從框架中釋放非常緩慢、持續，且爆發效應極小。相關研究已將該策略擴展到負載有親水性、兩親性和疏水性藥物的nMOF，nMOF 孔徑必須大于封裝劑才能承受高負載[22]。

由于非共價藥物加載是一個固有的可逆過程，因此nMOF 的后續處理可能會導致藥物過早釋放。藥物合成后的共價附著提供了一種更可靠的方法，因為藥物只有在NMOF 分解時才會被釋放。在這種方法中，多孔nMOF 框架內的正交官能團用于共價連接活性劑。該策略有效地創建了前藥，因此必須保持代理的功能。在特定的生物條件下，活性藥物必須可從nMOF 上裂解。由于納米粒子表面或附近的官能團在動力學上更容易接近，因此整個nMOF 粒子的藥劑負載可能不均勻。

1.2.2 pH值對抗癌藥物釋放的影響

UiO-66 nMOF 具有相對較高的表面積比，通過氮氣吸附-脫附等溫線測量的結果（988.625 m2/g）證實其適合裝載各種貨物。Py-PGA-PEG-F3 功能化后表面積降至438.978 m2/g，如圖2 所示根據DOX 在488 nm 處的吸光度測量，計算出可加載到UiO-66 中的DOX 量為1 mg DOX/mg UiO-66。DOX@UiO-66/Py-PGA-PEG-F3 的DOX 釋放曲線在模擬生理條件下進行測試，pH 值分別為5.0、6.8和7.4，溫度為37℃。如圖3 所示，中等pH 值對UiO-66 偶聯物中DOX 的釋放速率有影響。在pH 值為7.4 時，2 周后可以釋放27.73% 的DOX（0.27 mg DOX/mg UiO-66），這表明UiO-66 結構中負載的DOX 在生理條件下相對穩定。當暴露于模擬腫瘤細胞外pH 值為6.8 時，DOX 的釋放百分比在同一時間范圍內升高至32.65%（0.33 mg DOX/mg UiO-66）。當培養基pH值進一步降低至5.0（模擬pH 值范圍為4.5～6.5 的內吞區室），釋放的DOX 量在2 周后增加到約37.06%（0.37 mg DOX/mg UiO-66）。

圖2 UiO-66、UiO-66/Py-PGA-PEG-F3和加載DOX的UiO-66/Py-PGA-PEG-F3的氮吸附-脫附等溫線

圖3 UiO-66/Py-PGA-PEG-F3在不同pH值的DOX釋放曲線

DOX@UiO-66/Py-PGA-PEG-F3 的DOX 釋放曲線在模擬生理條件下進行測試，不同pH 值對UiO-66 偶聯物中DOX 的釋放速率有影響[23]，并在一定程度上定量分析，結果證實DOX@UiO-66/Py-PGA-PEG-F3 的DOX 釋放是持續的并且依賴于pH 值，這與已有的研究結果一致[11]。

2 結果

2.1 體外腫瘤細胞靶向

2.1.1 MDA-MB-231三陰性乳腺癌細胞和L929成纖維細胞特異性結合對比

在腫瘤靶向對比試驗中，為驗證nMOF 對腫瘤細胞的特異性結合性能，選擇MDA-MB-231 三陰性乳腺癌細胞（核仁素+）和L929 成纖維細胞（核仁素-）兩個細胞系，用于UiO-66 偶聯物的體外評估，通過蛋白質印跡確認核仁素在這兩種細胞中的表達譜。主要通過加載在UiO-66/Py-PGA-PEG-F3 或UiO-66/Py-PGA-PEG 上的DOX 作為熒光團指示劑，來顯示這些納米綴合物的位置。流式細胞術和共聚焦顯微鏡檢查的結果顯示，在MDA-MB-231 細胞中，DOX@UiO-66/Py-PGA-PEG-F3的熒光強度明顯強于DOX@UiO-66/Py-PGA-PEG，同時兩種UiO-66 結合物的熒光主要分布在細胞質中。相反，如圖4 所示，DOX@UiO-66/Py-PGA-PEG-F3 和DOX@UiO-66/Py-PGA-PEG 與L929 成纖維細胞的非特異性結合程度較低。

圖4 MDA-MB-231三陰性乳腺癌細胞（核仁素+）（a）和L929成纖維細胞（核仁素-）（b）與DOX@UiO-66/Py-PGAPEG-F3和DOX@UiO-66/Py-PGA-PEG孵育的代表性共聚焦熒光顯微鏡圖像（均含有50 μg/mL的DOX）

2.1.2 DOX@UiO-66/Py-PGA-PEG-F3和DOX@UiO-66/Py-PGA-PEG對MDA-MB-231細胞的抑制作用對比

為了追蹤UiO-66/Py-PGA-PEG-F3 在被MDA-MB-231 細胞內化后的命運，細胞溶酶體被溶酶體（Thermo-Fisher）染色并在顯微鏡下檢查。由于DOX 和LysoTracker 的熒光光譜在熒光顯微鏡下不可分離，因此使用異硫氰酸熒光素（Fluorescein Isothiocyanate，FITC）代替DOX作為熒光貨物。如圖5 所示，LysoTracker 的分布模式與FITC 的分布模式高度重合，表明大部分UiO-66/Py-PGA-PEG-F3 在細胞內化后進入溶酶體。在測試濃度范圍（0～50 μg/mL）內，UiO-66/Py-PGA-PEG-F3 對MDA-MB-231 細胞無明顯的細胞毒性，而DOX@UiO-66/Py-PGA-PEG 和DOX@UiO-66/Py-PGA-PEG-F3 通過釋放DOX 抑制MDA-MB-231 細胞的生長。其中，DOX@UiO-66/Py-PGA-PEG-F3 對MDA-MB-231 細胞的抑制作用強于DOX@UiO-66/Py-PGA-PEG。

圖5 MDA-MB-231細胞中FITC@UiO-66/Py-PGA-PEG-F3與溶酶體的共定位（用LysoTracker測量）

為了進一步闡明MDA-MB-231 細胞與UiO-66 結合物之間的動態相互作用，將89Zr-UiO-66/Py-PGAPEG-F3 與MDA-MB-231 細胞共孵育。89Zr-UiO-66/Py-PGA-PEG-F3 的細胞內化在0.25 h 內趨于穩定，并且幾乎等量的89Zr-UiO-66/Py-PGA-PEG-F3 無須內化即可與MDA-MB-231 細胞表面結合。同時，一旦內化到細胞中，小于30%的89Zr-UiO-66/Py-PGA-PEG-F3 可以在24 h的時間范圍內逃逸。由此再次證實了UiO-66/Py-PGAPEG-F3 和MDA-MB-231 之間的特異性結合（可能通過細胞表面的核仁素），為其在體內進一步的研究和探討提供了基礎。

2.2 89Zr-UiO-66/Py-PGA-PEG-F3在MDA-MB-231腫瘤靶向中PET成像對比

利用89Zr 的長半衰期，可以在注射后120 小時內全面檢查89Zr-UiO-66 偶聯物的分布和衰減曲線。89Zr 是一種具有良好臨床潛力的同位素，適用于長期監測不同的代謝過程。從PET 結果的感興趣區域分析中獲得的定量器官分布如圖6 所示，89Zr-UiO-66/Py-PGA-PEG-F3 在MDAMB-231 腫瘤中表現出快速積累，這在感染后0.5 h 清晰可見并在2 h 后保持穩定[24]。相比之下，發現未附著F3 肽的89Zr-UiO-66/Py-PGA-PEG 的腫瘤攝取始終顯著低于89Zr-UiO-66/Py-PGA-PEG-F3檢查點。在晚期時間點（＞48 h p.i.），MDA-MB-231 腫瘤中89Zr-UiO-66/Py-PGA-PEG-F3 的攝取隨時間逐漸減少。連續PET 掃描，包含MDA-MB-231 腫瘤中心的冠狀載玻片，連續采血方法確定89Zr-UiO-66/Py-PGA-PEG 的循環半衰期約為118.8 min（圖7）。

圖6 89Zr-UiO-66/Py-PGA-PEG-F3、89Zr-UiO-66/Py-PGAPEG-PEG和89Zr-UiO-66/Py-PGA-PEG-F3+阻斷劑量F3肽（10 mg/kg小鼠體重）注射后MDA-MB-231荷瘤小鼠不同時間點的典型冠狀位PET圖像

圖7 89Zr-UiO-66/Py-PGA-PEG在裸鼠體內循環半衰期的測定

隨著時間的推移，MDA-MB-231 腫瘤中89Zr-UiO-66/Py-PGA-PEG-F3 的攝取減少的原因主要包含兩個方面：①89Zr-UiO-66/Py-PGA-PEG-F3 的尺寸較大，可以阻止一些89Zr-UiO-66/Py-PGA-PEG-F3 有效內化到腫瘤（脈管系統）細胞中，導致其從MDA-MB-231 腫瘤中“清除”。因此，更小和更均勻的UiO-66 nMOF 將更有利于臨床使用。②89Zr-UiO-66/Py-PGA-PEG-F3 的流出率有助于減少腫瘤積聚。需要闡明89Zr-UiO-66/Py-PGA-PEG-F3 與負責藥物或者貨物去除的蛋白之間的相互作用，以減少腫瘤中UiO-66 偶聯物的損失[25]。隨著時間的推移，腫瘤攝取的減少并非由89Zr-UiO -66 nMOF的降解引起的，在5 d（與PET 成像時間相同）內，其在不同的pH 值（低至5.0）下相對穩定。

從PET 圖像來看，肝臟和脾臟是捕獲89Zr-UiO-66結合物最顯著的器官，他們的攝取在3 組數據中都相似（圖6）。89Zr-UiO-66 偶聯物從肝臟中清除緩慢，肝臟攝取隨時間逐漸減少，從感染注射后0.5 h 約50% ID/g 到感染注射后120 h 約40% ID/g，在整個成像時間范圍內，未檢測到放射性物質沉積在骨骼或腎臟。這一結果再次證實了89Zr-UiO-66 偶聯物在體內的優異穩定性，因為89Zr4+離子對磷酸鹽具有高度親和力，易于摻入骨骼中的羥基磷灰石結構中[26]。除了腫瘤攝取的差異外，F3肽的綴合或F3 肽阻斷劑量的給藥并未改變這些UiO-66綴合物在荷瘤小鼠中的體內動力學，表明核仁素靶向是89Zr-UiO-66/Py-PGA-PEG-F3 增強腫瘤攝取的關鍵促成因素之一。

3 討論

與其他納米載體相比，nMOF 作為生物醫學成像和藥物遞送劑的開發尚處于起步階段。盡管如此，得益于nMOF 獨特的結構和化學多樣性、合成條件溫和特性以及能夠以前所未有的高負載量攜帶多種成像和治療劑的能力，其成為一種具有巨大潛力的全新納米載體平臺。

F3 肽在本研究中被選為腫瘤靶向配體，因為其在腫瘤脈管系統中表現出與腫瘤細胞和活化內皮細胞的有效結合，根據Porkka 等[19]的研究，熒光素標記的F3 肽與MDA-MB-435 乳腺癌細胞結合并被其內化，最初出現在這些細胞的細胞質中，然后出現在細胞核中。另外Christian 等[20]的研究表明，F3 肽選擇性地與腫瘤細胞表面的核仁素結合，隨后可以轉運到細胞核和細胞質中。細胞表面核仁素表達升高是各種癌細胞，尤其是乳腺癌的重要特征。將半胱氨酸殘基摻入F3 肽的C 末端以促進其與UiO-66 nMOF 的綴合（通過硫醇馬來酰亞胺與芘-PEG-馬來酰亞胺反應）[21]。

本研究表明，當暴露于模擬腫瘤細胞外pH 值為6.8 時，DOX 的釋放百分比在同一時間范圍內升高至32.65%（0.33 mg DOX/mg UiO-66）。當培養基pH 值進一步降低至5.0（模擬pH 值范圍為4.5～6.5 的內吞區室），釋放的DOX 量在2 周后增加到約37.06%（0.37 mg DOX/mg UiO-66）。由此證實DOX@UiO-66/Py-PGA-PEG-F3 的DOX 釋放是持續的并且依賴于pH 值，這與Zhao 等[11]的報道一致。

18F-FDG 和64Cu 作為PET 成像顯像劑已有較為廣泛的研究[27-29]。借助nMOF 的高度可調性，未來將有更多顯像劑和藥物納入nMOF 應用范疇。特別是，將成像劑和治療劑結合至同一nMOF 平臺，有望大幅度促進這類具有發展前景的治療診斷納米顆粒的功效研究。nMOF的研究與應用亟待進一步優化，通過增強其生物相容性成分和表面功能，從而確保其在延長血液循環、逃避網狀內皮系統及組織特異性方面的表現。盡管已對nMOF進行了大量的體外藥效研究，但體內藥效的系統研究尚未展開。為了優化nMOF 的性能，有必要開展相關體內研究，經過優化的nMOF 在生物醫學成像和藥物輸送領域具有廣闊的應用前景。

4 結論

本征放射性UiO-66 nMOF 材料（89Zr-UiO-66）被設計、合成和表面工程用于腫瘤靶向和增強藥物遞送，本研究驗證了其良好的放射化學穩定性、材料完整性和可靠的材料功能化，可以將相對大量的DOX（1 mg DOX/mg UiO-66）加載到UiO-66 偶聯物上，但DOX 釋放行為需要進一步優化。通過采用F3 肽（靶向核仁素）作為靶向配體，89Zr-UiO-66 結合物對MDA-MB-231 腫瘤的特異性和顯著增強靶向性在體內得到證實，這在離體實驗中得到了進一步證實。中劑量和大劑量UiO-66/Py-PGA-PEG-F3 的毒性研究未顯示出顯著的體內毒性。此外，在荷瘤小鼠中也證實了增強的DOX 向體內MDAMB-231 腫瘤的遞送。當前較多的是嘗試通過改進表面工程方法和研究納米綴合物用于聯合放化療的潛力來進一步優化它們的體內藥代動力學，希望其他研究人員將不同類型的放射性nMOF 材料用于癌癥治療應用。