前體物質對泰萬菌素發酵效價影響的研究

＊李芳 劉萬蓮 高斌 劉楠

（寧夏泰益欣生物科技股份有限公司 寧夏 750205）

引言

泰萬菌素被稱之為乙酰異戊酰泰樂菌素（3-acetyl-4"-isovalerytylosin，AIV），同時，也被稱為超級泰樂菌素，是一種大環內酯類抗生素，主要是由耐熱鏈霉菌經過發酵后獲得，最初是由英國伊科動物保健品有限公司發現的[1]。近年來，泰萬菌素是由泰樂菌素發酵轉化產生的，用于生產的原料藥為泰樂菌素的酒石酸鹽。

泰萬菌素因對雞和豬的治療效果明顯，已成為畜牧業中常用的抗生素[2]。隨著養殖業的快速發展，泰萬菌素在國內外市場上的銷量也在急劇增加，故在泰萬菌素發酵過程中提升泰萬菌素的效價是藥物發展的重要研究方向。

泰萬菌素屬于泰樂菌素的衍生物，是動物專用第三代大環內脂類藥物，唯一能真正到達支氣管腔，殺滅支原體的藥物，其抗菌效價是泰樂菌素的5～10 倍，替米考星的2～5 倍；堿性側鏈能有效改變細胞內pH值，抑制藍耳病病毒繁殖。用于畜禽支原體病（豬喘氣病、雞慢呼）、豬藍耳病、豬增生性回腸炎、傳染性胸膜肺炎、鏈球菌病的防治。泰萬菌素發酵生產菌產生的乙酰化酶和異戊酰化酶，可將泰樂菌素對應位點上的羥基進行乙酰化和異戊酰化合成泰萬菌素。泰萬菌素制劑作為一種新型專業獸用藥，具有抗菌譜廣、細菌耐藥性低、毒性低、殘留少等優點，對原廣泛使用的替米考星等同類制劑有一定的替代性，2018—2021 年，泰萬菌素類產品行業產量呈增長趨勢，目前公司處于滿負荷生產狀態，相關產品供不應求。

查閱文獻，近年來研究者們主要采用基因改造手段提高耐熱鏈霉菌的轉化能力，以提高泰萬菌素的發酵單位[3]。發酵過程是為耐熱鏈霉菌提供豐富的營養環境和適宜的生長條件，包括碳源、氮源、無機鹽、生長因子、溫度、濕度及pH 等。

在泰萬菌素生物合成過程中會先生成3-O-乙酰泰樂菌素或4"-O-異戊酰泰樂菌素等中間產物，再進一步乙酰化或異戊酰化合成泰萬菌素，過程中會受到部分前體物質供應不足，造成泰萬菌素合成過程受阻，最終導致泰萬菌素發酵效價偏低。因此在泰萬菌素發酵過程中補加前體物質是提高泰萬菌素效價的有效方法之一[4]。

已有報道顯示發酵過程補加小分子物質可以有效促進泰萬菌素的合成，明顯提升其發酵效價[5]。經查閱相關資料，乙酸、丙酸、丁酸等小分子酸為泰萬菌素生物合成過程中的必要物質。

基于上述理論基礎，本研究將乙酸、丙酸、丁酸補加至泰萬菌素發酵培養基中，考察以上三種小分子酸對泰萬菌素發酵效價的影響，同時探究了前體物質的添加比例、周期、濃度對其效價的影響。

1.試劑與儀器

表1 所用原材料列表

表2 所用儀器設備列表

2.材料與方法

(1)材料

泰萬菌素生產菌種由寧夏泰益欣生物科技股份有限公司提供。

(2)方法

將泰萬菌素種子液接種至種子罐中，待種子培養結束，達到移種的標準移入發酵罐進行發酵，采用單因素分析法，探究發酵過程中分別添加前體物質乙酸、丙酸、丁酸對泰萬菌素效價的影響，確定最優添加物質后，再探究添加比例分別為發酵液總體積的0.25%、0.5%、0.75%、1.0%、1.25%、1.5%時，添加周期分別為24 h、48 h、72 h、96 h、120 h、144 h 時，添加濃度分別為0.05 mol/L、0.15 mol/L、0.25 mol/L、0.35 mol/L、0.45 mol/L、0.55 mol/L 時對泰萬菌素效價的影響，從而確定前體物質添加的最優工藝。

3.結果與分析

(1)不同前體物質添加種類對泰萬菌素效價的影響

小分子物質可以有效促進泰萬菌素的合成，常見的小分子酸有乙酸、丙酸和丁酸，本研究考察以乙酸、丙酸和丁酸三種短鏈脂肪酸為前體物質進行試驗[6]。探究前體物質添加乙酸、丙酸和丁酸對泰萬菌素效價的影響。結果如表3 所示。

表3 不同前體物質添加種類對泰萬菌素效價的影響

由表3 可知，加入乙酸、丙酸、丁酸對泰萬菌素的效價有顯著影響，其中加入乙酸后對泰萬菌素的效價提升最為明顯，效價提升2.34%，故本文確定采用乙酸作為前體物質進行后續研究。

(2)不同添加比例對泰萬菌素效價的影響

以乙酸作為前體物質，不同的添加比例對泰萬菌素的生物合成具有不同程度的影響，合適的添加比例會對泰萬菌素生物合成反應具有一定的促進作用，若發酵過程中添加濃度過大，可能會導致菌絲斷裂及染菌，或對合成有抑制作用；若添加濃度較低，會導致合成不徹底，原料反應不完全[7]，故本次研究設計以發酵液總體積的0.25%、0.5%、0.75%、1.0%、1.25%、1.5%，6 個梯度添加比例進行試驗，培養周期均為170 h。考察不同添加比例對泰萬菌素效價的影響。結果如表4、圖1 所示。

圖1 不同添加比例對泰萬菌素效價的影響

表4 不同添加比例對泰萬菌素效價的影響

由表4 和圖1 可知，乙酸添加比例對泰萬菌素的效價有明顯的影響，效價整體的變化趨勢隨添加比例的增加呈先上升后下降的趨勢，當添加比例達到1.0%時，效價達到頂峰為35872μg/mL；當添加比例大于1.0%后，效價逐漸程呈下降趨勢。故以1.0%為最優添加比例進行后續試驗。

(3)不同添加周期對泰萬菌素效價的影響

前體物質添加周期的長短會影響泰萬菌素的效價，添加時間太早，導致無法充分參與反應，造成物質積累，影響菌絲成長；添加時間太晚導致生物合成時間較短，菌絲老化，反應不完全[8]，恰當的添加時間會影響菌絲的生命活力，從而提高效價，故本次研究共設24 h、48 h、72 h、96 h、120 h、144 h，6 個添加周期進行驗證，考察最優添加周期。如表5 所示。

表5 不同添加周期對泰萬菌素效價的影響

由表5 可知，隨著添加周期的延長泰萬菌素效價呈現出規律性變化，整體的變化呈現出先上升后下降的趨勢，且當添加周期在72 h 時泰萬菌素效價達到峰值為35372μg/mL，相比對照增加了2871μg/mL，但當添加周期大于72 h 后，效價增長相比對照較小，故以72 h 為最優添加周期進行后續試驗。

(4)不同添加濃度對泰萬菌素效價的影響

以72 h 添加乙酸進行試驗，篩選最優的添加濃度，在泰萬菌素的發酵過程中，以0.05 mol/L、0.15 mol/L、0.25 mol/L、0.35 mol/L、0.45 mol/L、0.55 mol/L 為試驗濃度，考察不同添加濃度對泰萬菌素效價的影響，如表6 所示。

表6 不同添加濃度對泰萬菌素效價的影響

由表6 可知，隨著添加濃度的增加，對泰萬菌素的效價有積極影響，添加濃度在0.35% 時，泰萬菌素效價達到峰值為35020μg/mL，相比對照增長了2389μg/mL，但當濃度＞0.35%時，泰萬菌素的效價逐步下降，因此可以確定添加濃度為0.35%時，泰萬菌素的效價達到最優。

4.結論

綜上所述，通過泰萬菌素的發酵工藝優化，確認添加前體物質確實有助于提高泰萬菌素的效價，本次研究主要是在泰萬菌素發酵過程中，篩選出最優的前體物質添加工藝，確定乙酸作為最佳添加試劑，且添加比例為1.0%，在72 h 進行添加，添加濃度為0.35%，此方法可有效提升泰萬菌素效價，表明此工藝條件能有效提高泰萬菌素的效價，為生產泰萬菌素的生產提供了理論依據，從而更好的滿足國內外市場的需求。