UW器官保存液轉運腎活檢組織對臨床病理診斷的影響

李 楊,楊 眉,徐 緩,雷 松

隨著現代醫學技術水平的提高,腎穿刺活檢術開展得越來越廣泛,已成為明確腎臟疾病性質和病理類型的重要檢查方法,這對確定疾病的治療方案和預后判斷有重要意義[1]。然而,腎活檢涉及的幾種病理檢查方法在組織取材大小、所需觀察腎小球數量以及固定保存方法等均存在顯著差異,因此對腎活檢病理組織取材有較高的要求。目前,腎活檢病理組織取材均是在穿刺室現場進行,受多種因素影響導致組織取材失誤較多。為此,本實驗嘗試使用UW器官保存液(UW液)在低溫浸泡條件下轉運新鮮腎活檢組織到病理室集中進行規范化取材,以避免病理取材失誤問題。

1 材料與方法

1.1 標本選取我院行腎活檢穿刺、經體視鏡觀察穿刺組織中腎小球較充分的樣本40例,其中一部分組織按常規腎活檢病理取材,設為對照組;在保證臨床病理檢查的基礎上,剩余的腎組織作為實驗組,實驗組在4 ℃預冷UW液中浸泡保存,浸泡時間分別為2 h、8 h、24 h和48 h,每組各10份樣本。

1.2 保存溶液器官保存液(UW液-ViaSpan),百時美施貴寶公司生產,無菌分裝至1.5 mL試管中,每管1 mL,4 ℃存放。

1.3 方法

1.3.1取材 UW液浸泡后的各實驗組樣本取材同對照組一致,光鏡檢查樣本用10%福爾馬林固定;電鏡檢查樣本用戊二醛固定;免疫熒光檢查樣本用OCT冷凍劑冷凍包埋。

1.3.2切片及染色 光鏡檢查標本按常規病理組織制樣處理,石蠟切片分別進行HE、過碘酸-雪夫氏(PAS)、Masson三色和過碘酸六胺銀(PASM)染色;免疫熒光檢查樣本經冷凍切片后,進行IgA、IgG、IgM、C3、C4、C1q、κ和λ直接免疫熒光染色;電鏡檢查按常規組織電鏡制樣處理。石蠟HE切片及特殊染色切片使用普通光學顯微鏡觀察;免疫熒光染色切片使用OLUMPUS BX41熒光顯微鏡觀察;超薄切片使用日立H-7650型透射電子顯微鏡觀察。

2 結果

光鏡HE觀察結果：2 h組腎小球和腎小管各組織結構保存良好,與對照組比較差別不明顯;8 h組腎小管少量上皮細胞腫脹、脫落;24 h組腎小管上皮細胞腫脹、壞死較8 h組明顯,但對觀察腎小管及間質炎細胞浸潤、纖維化程度等病變影響不明顯;48 h組腎小管上皮細胞脫落、壞死加重,灶性小管基底帶裸露,腎小球部分結構較模糊(圖1)。

圖1 光鏡HE結果：A.對照組;B. 2 h組;C. 8 h組;D. 24 h組;E. 48 h組 圖2 電鏡結果：A.對照組;B. 2 h組;C. 8 h組;D.24 h組;E. 48 h組 圖3 特殊染色：A.24 h組PAS染色;B.Masson染色;C.PASM染色

電鏡觀察結果：2 h組腎小球各組織結構和亞細胞結構保存良好,與對照組差異不明顯;8 h組雖有部分腎小球亞細胞結構輕度腫脹,但對觀察腎小球疾病超微結構的改變影響不明顯,如腎小球各結構增生情況,基底膜厚度,足突融合程度,以及電子致密物和異常結構物質沉積部位、多少及形狀等;24 h組部分病例腎小球亞細胞結構保存狀態與8 h組相似,但部分病例亞細胞結構腫脹、破壞較明顯,對腎小球疾病的觀察有一定影響;盡管48 h組部分病例仍能觀察到電子致密物沉積部位,但是腎小球各組織結構和亞細胞結構破壞較重,因此不適合進行腎小球疾病相關超微結構變化的觀察(圖2)。

特殊染色顯示各組腎組織結構、病變結構和特殊成分均能正常著色,不受UW液浸泡時間影響。以24 h組為例,PAS染色基底膜、小球囊壁及其他PAS陽性物質呈紅色;Masson染色免疫復合物呈紅色、膠原纖維呈綠色;PASM染色基底膜和小球囊壁呈黑色、免疫復合物呈紅色(圖3)。

免疫熒光結果顯示各組抗體標記陰/陽性及強弱表達不受UW液浸泡時間影響。以24 h組為例,膜性腎病組織抗體表達結果：IgG在腎小球基底膜呈線性、細顆粒狀高亮度表達,κ和λ表達強度次之,C3弱表達,IgA、IgM、C4和C1q為陰性,與同病例對照組免疫熒光抗體表達結果一致(圖4)。此外,狼瘡性腎炎多數熒光抗體在腎小球系膜區和基底膜均有較高強度表達,呈“滿堂亮”現象;而糖尿病腎病、微小病變性腎病則熒光抗體表達全部為陰性。

3 討論

根據腎活檢組織病理診斷專家共識[2-3],光鏡檢查需用福爾馬林固定組織,切片要求觀察10個及以上腎小球,因此分取的組織較大;由于電鏡觀察的組織要求取材準確、體積小,需用戊二醛及時固定;而免疫熒光檢查組織需用等滲溶液低溫保濕或OCT包被,不能使用化學固定液?；谏鲜鲈?目前腎活檢病理組織的分割和固定保存均是在穿刺手術室現場進行,然后轉運到病理室進行后續制樣和病理診斷工作。但是由于腎小球僅分布在腎皮質區,在觀察病理切片時常發現某項檢查中腎小球數量過多,而對應的其它項檢查中腎小球數不足或無腎小球;有時因取材不及時,造成組織細胞腫脹、壞死較明顯;另外還發現免疫熒光檢查的組織因失誤接觸到固定液而造成免疫標記假陰性結果。分析問題原因除了腎活檢組織結構特殊和病理組織取材要求復雜外,更多是穿刺現場空間局限、取材設備不足、取材人員不專業等因素。如果能將新鮮腎活檢標本集中轉送到病理室,在空間、取材人員和設備都具備充分條件下進行組織取材,則既能避免取材失誤,又符合病理組織取材工作的標準化和規范化。

為達到上述目標,本實驗選擇使用器官保存液進行實驗觀察。目前臨床用于保存和轉運移植器官商品化的器官保存液較多,包括UW液、HTK液和HCA液等,采用單純冷卻法或低溫灌注法處理器官都能很好地預防組織水腫和細胞破壞。有文獻報道使用UW液可保存器官長達72 h,并成功用于動物器官移植[4]。我們首先使用大鼠腎組織進行了預實驗,結果發現使用上述幾種器官保存液低溫浸泡動物腎組織,在一定時間內能較好保護組織形態和超微結構,其中UW溶液的保護作用優于其他器官保存液,但該部分實驗數據未在本文列出。因此本實驗選用UW液來觀察其對臨床腎活檢病理組織形態和超微結構的保護效果,以及是否對特殊染色及免疫熒光標記結果有影響。結果顯示經UW液低溫浸泡8 h內腎組織形態和超微結構均改變不明顯,同時不影響組織病理學的其他檢查結果。但隨著UW液浸泡時間延長,腎組織形態和超微結構逐漸出現受損現象,對觀察腎小球疾病相關的超微結構的影響逐漸加大。同時還發現24 h組部分病例的組織超微結構破壞較輕和8 h組相似,但有的組織超微結構受損較明顯,推測可能是疾病類型和病變程度不同所造成的不同生化微環境差異所引起,因此在使用UW液保存和轉運腎活檢組織時,時間越短越好。實驗結果也表明,使用UW液未發現假陰性或假陽性現象,不影響免疫熒光染色結果,因此可作為冷凍切片組織保存和轉運的常規媒介液使用。本實驗還總結了一些注意事項：(1)保存液溫度須控制在0～4 ℃(冰浴),如果溫度過高,會影響組織保護效果。(2)浸泡的組織不能太大,保存液只適宜保存穿刺類細小組織。(3)運輸過程避免劇烈震動。(4)UW液需分裝、冷凍保存,臨用時再解凍,以避免污染變質。本實驗結果為轉運新鮮病理組織標本到病理室集中進行規范化取材提供了一種新思路,能極大提高病理組織取材準確性。同時較長的組織保存時間能滿足多院區或同一地區間新鮮腎活檢病理標本轉送,對腎活檢穿刺工作有效地開展和腎臟疾病診治水平的提高產生積極作用。