EpCAM和HDAC6在前列腺癌中的表達及其對前列腺癌細胞遷移的影響

張 月,權春姬,金雪梅,張金山,張紫薇,金仁順,李珍玲

上皮細胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule, EpCAM)是一種Ⅰ型跨膜糖蛋白,是黏附分子家族的重要成員,主要介導上皮細胞中同型細胞間的黏附,同時參與細胞之間的信號傳導、細胞遷徙、增殖分化和組織再生等過程[1]。多項研究表明,EpCAM作為一種重要的細胞表面抗原,在腫瘤治療中發揮重要作用,可作為判斷預后和復發的重要指標[2]。組蛋白(Histon)作為構成染色質的重要成分,可在其尾部的氨基酸殘基上進行乙酰化修飾,導致染色質構象發生改變,調控基因的轉錄[3],成為惡性腫瘤預防和治療的研究熱點。組蛋白去乙?；?(histone deacetylase, HDAC6)作為HDACs的主要成員,在多種惡性腫瘤中異常高表達,參與調節細胞的增殖、遷移、轉運和血管生成,誘導腫瘤的發生發展。本研究采用免疫組化和Western blot法檢測EpCAM和HDAC6蛋白在前列腺癌及癌旁良性組織中的表達,分析兩蛋白表達的相關性及與前列腺癌臨床病理特征的關系,通過體外實驗探討EpCAM和HDAC6對前列腺癌細胞遷移及上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)的影響,為臨床前列腺癌的診斷及預后評估提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 一般資料收集2015年3月～2020年9月延邊大學附屬醫院病理科確診并存檔的前列腺癌手術標本115例和癌旁良性組織標本37例。切片經高年資病理醫師重新閱片,證實為前列腺腺癌。患者年齡51～91歲,平均76歲,術前均未接受放、化療及免疫抑制和激素治療。根據患者年齡分為：≤70歲組(39例)和>70歲組(76例);根據腫瘤大小及浸潤程度分為：T1-T2組(14例)和T3-T4組(57例);根據Gleason評分(gleason score, GS)分為：≤7分組(58例)和>7分組(57例);根據ISUP預后分級分組系統(ISUP grade group, GG)分為：GG 1組(13例)、GG 2組(22例)、GG 3組(23例)、GG 4組(28例)和GG 5組(29例);根據血清PSA值分為：≤10 ng/mL組(14例)和>10 ng/mL組(40例);根據有無淋巴結轉移分為：有轉移組(57例)和無轉移組(14例)。

1.2 方法

1.2.1生物信息學分析 通過TCGA數據庫檢索和分析EpCAM及HDAC6在多種癌癥中的mRNA表達情況,進而對前列腺癌和正常前列腺組織中的表達差異進行比較分析。Starbase數據庫檢索和分析499例前列腺癌組織中EpCAM mRNA與HDAC6 mRNA表達的相關性。

1.2.2實驗材料與試劑 實驗試劑包括DMEM培養基、胎牛血清(Gibco公司);EpCAM siRNA和陰性對照siRNA(北京合生生物公司);脂質體Lipofectamine 3000轉染試劑盒(Thermo Fisher Scientific公司);EpCAM、HDAC6、E-cadherin、vimentin、β-actin單克隆抗體和二抗(CST公司);熒光二抗(APExBIO公司);蛋白提取試劑盒、Western blot法檢測試劑盒(Solarbio科技公司);Transwell小室(Corning公司);Matrigel基質膠(BD公司)。

1.2.3免疫組化檢測EpCAM和HDAC6的表達 所有標本經10%中性福爾馬林固定,常規石蠟包埋、連續切片,經EDTA液高壓高溫抗原修復,過氧化物酶孵育后,加入EpCAM和HDAC6一抗4 ℃孵育過夜,二抗37 ℃孵育后,DAB顯色。常規乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹膠封固,顯微鏡下觀察、采圖。陰性對照用PBS作為一抗。免疫組化結果判定：(1)著色細胞數：陽性細胞數<10%判定為0分、10%～50%判定為1分、>50%判定為2分;(2)著色程度：無陽性著色判定為0分、著淡黃色判定為1分、著棕黃色判定為2分。兩項評分相乘作為最終結果：0分為陰性(-)、1分為弱陽性(+)、2分為中等陽性()、4分為強陽性()。將(～)劃分為高表達組。

1.2.4細胞的培養與轉染 人前列腺癌DU145細胞由我院中心實驗室提供,細胞培養于DMEM完全培養液(含10%FBS和1%青-鏈霉素),置于5%CO2、37 ℃細胞培養箱中培養。si-EpCAM序列由北京合生生物公司設計合成,參考Lipofectamine 3000轉染試劑說明書進行細胞轉染。DU145細胞接種于6孔板中,待細胞融合度達70%～90%時開始細胞轉染,繼續培養18～48 h,熒光顯微鏡下觀察細胞轉染效率,并用Western blot法進行驗證。選用si-NC空載體作為對照組。期間觀察細胞狀態,繼續進行后續實驗。

1.2.5細胞劃痕實驗 取生長狀態良好的對數生長期細胞,將細胞密度調整為2×105/mL,分別接種到6孔板內,待細胞融合達70%時,用200 μL的移液槍槍頭垂直于孔均勻劃痕,分別在0 h、24 h、48 h時用顯微鏡拍照并分析劃痕的修復程度。細胞愈合率=0 h或24 h或48 h EpCAM沉默組的劃痕面積/0 h對照組的劃痕面積×100%。用image J軟件測量各組的面積,GraphPad Prism 8.0進行統計分析和統計圖繪制,重復實驗3次。

1.2.6Transwell侵襲小室實驗 取生長狀態良好的對數生長期細胞,將細胞密度調整為1×104/mL,取150 μL接種在上室中,取750 μL含20%FBS的完全培養基加入下室。繼續培養24 h后取出Transwell上室,PBS沖洗后,甲醛固定、0.1%結晶紫染色、擦拭小室表面上的細胞;顯微鏡下隨機選取5個高倍視野,用image J軟件進行各組細胞計數,GraphPad Prism 8.0進行統計分析和統計圖繪制。

1.2.7Western blot實驗 采用蛋白裂解液提取細胞總蛋白,根據蛋白濃度檢測試劑盒檢測蛋白濃度,取30 μg蛋白經6%～12% SDS-PAGE膠分離,轉膜后5%脫脂奶粉封閉、一抗孵育過夜、二抗孵育,后置于成像系統中曝光,采圖并分析。以目的蛋白與內參β-actin的灰度值之比表示目的蛋白的相對表達水平。

1.3 統計學方法所有數據應用SPSS 25.0和GraphPad Prism 8.0軟件進行統計學分析。EpCAM和HDAC6蛋白表達與臨床病理特征的關系采用χ2檢驗或Fisher精確檢驗,其表達的相關性采用Spearman等級相關檢驗,兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 前列腺癌中EpCAM和HDAC6 mRNA的表達通過TIMER數據庫檢索發現,EpCAM和HDAC6在多種惡性腫瘤組織中表達上調,前列腺癌組織中EpCAM mRNA的表達水平明顯高于癌旁良性組織(P<0.001,圖1A),前列腺癌與癌旁良性組織中HDAC6 mRNA表達差異無統計學意義(圖1B)。UALCAN數據庫分析顯示,與癌旁正常組織相比,前列腺癌組織中EpCAM和HDAC6 mRNA的表達水平顯著上調(P<0.001,P<0.05,圖2A、B)。進一步分析EpCAM和HDAC6 mRNA表達與前列腺癌臨床病理特征的關系,發現EpCAM和HDAC6 mRNA與Gleason評分和淋巴結轉移密切相關：與癌旁良性組織相比,EpCAM蛋白在不同Gleason評分前列腺癌組織中均表達增高(圖2C);而HDAC6蛋白在Gleason評分8、9的前列腺癌組織中的表達顯著高于癌旁正常組織(圖2D);前列腺癌無淋巴結轉移(N0)和有淋巴結轉移(N1)組織中的EpCAM和HDAC6 mRNA表達水平均高于癌旁良性組織(圖2E、F)。

圖1 EpCAM和HDAC6 mRNA在不同腫瘤組織中的表達：TIMER數據庫分析各種腫瘤組織中EpCAM(A)和HDAC6(B)mRNA表達

圖2 UALCAN數據庫分析EpCAM和HDAC6 mRNA在不同前列腺癌組織中的表達差異：UALCAN數據庫中EpCAM(A)和HDAC6(B)mRNA在正常前列腺組織及前列腺癌組織中表達水平;EpCAM (C)和HDAC6 mRNA(D)表達水平與前列腺癌Gleason評分的關系;EpCAM(E)和 HDAC6 mRNA(F)表達水平與前列腺癌淋巴結轉移的關系;與正常組相比,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001

2.2 前列腺癌組織中EpCAM和HDAC6蛋白的表達免疫組化結果顯示,EpCAM蛋白在癌旁良性組織中呈(-～+),前列腺癌組織中呈(～),且主要定位于細胞膜(圖3)。前列腺癌組織中EpCAM蛋白的高表達率為62.61%(72/115),高于癌旁良性組織(21.62%,8/37),差異有統計學意義(P<0.001,表1)。HDAC6蛋白表達主要定位于細胞質,強表達時細胞膜也有一定的表達。HDAC6在前列腺癌組織中呈(～),而在癌旁良性組織中呈(-～+)(圖4)。HDAC6蛋白在前列腺癌組織中高表達率為81.74%(94/115),高于癌旁良性組織(43.24%,16/37),差異有統計學意義(P<0.001,表1)。

表1 前列腺癌和癌旁良性組織中EpCAM和HDAC6蛋白的表達

圖3 前列腺癌及癌旁良性組織中EpCAM蛋白的表達：A.前列腺癌旁良性組織中EpCAM呈陰性;B.前列腺癌組織中EpCAM呈陽性,EnVision法 圖4 前列腺癌及癌旁良性組織中HDAC6蛋白的表達：A.前列腺癌旁良性組織中HDAC6呈陰性;B.前列腺癌組織中HDAC6呈陽性,EnVision法

2.3 EpCAM和HDAC6高表達與前列腺癌臨床病理特征的關系進一步對EpCAM和HDAC6蛋白高表達與前列腺癌臨床病理特征的關系進行分析發現,EpCAM表達與前列腺癌腫瘤大小及浸潤深度(P=0.007)、Gleason評分(P<0.001)以及WHO/ISUP預后分級分組(P=0.005)有關;而與患者年齡、血清PSA值和淋巴結轉移無關(P>0.05,表2)。HDAC6蛋白在前列腺癌組織中的表達水平與WHO/ISUP預后分級分組具有一定相關性,但差異并不顯著(P=0.05),而與患者年齡、腫瘤大小及浸潤深度、Gleason評分、血清PSA和淋巴結轉移均無統計學意義(P>0.05,表2)。

表2 EpCAM和HDAC6蛋白高表達與前列腺癌臨床病理特征的關系

2.4 前列腺癌中EpCAM和HDAC6蛋白表達的相關性Starbase數據庫分析結果顯示,在499例前列腺癌組織中EpCAM與HDAC6的mRNA表達呈正相關(r=0.206,P=3.44e-06,圖5)。免疫組化結果顯示,EpCAM陰性時HDAC6蛋白也呈陰性,同樣EpCAM呈強陽性時HDAC6蛋白也呈強陽性,兩蛋白表達具有一致性(圖6)。Spearman相關性分析結果顯示,在115例前列腺癌組織標本中,EpCAM和HDAC6蛋白同時高表達64例,兩者同時低表達13例,兩者在前列腺癌組織中的表達呈正相關(r=0.454,P<0.001,表3)。

表3 前列腺癌中EpCAM與HDAC6蛋白表達的相關性

圖5 前列腺癌組織中EpCAM與HDAC6 mRNA表達的相關性

圖6 前列腺癌組織中EpCAM和HDAC6的表達：case1.EpCAM和HDAC6均呈陰性;case2.EpCAM和HDAC6均呈陽性;case3.EpCAM和HDAC6均呈強陽性,EnVision法

2.5 EpCAM沉默對前列腺癌細胞遷移及EMT的影響Western blot法結果顯示：與si-NC組相比,si-EpCAM處理組的EpCAM蛋白表達顯著減少(si-EpCAM-1：P<0.05,si-EpCAM-2：P<0.01)。此外,si-EpCAM轉染后,DU145細胞中HDAC6蛋白表達水平也相應減少,但差異無統計學意義(圖7)。

圖7 Western blot檢測各組細胞中EpCAM和HDAC6蛋白的表達：與對照組相比,*P<0.05,**P<0.01

劃痕實驗結果顯示,與si-NC組(0.864±0.024)相比,si-EpCAM組的細胞遷移及修復能力明顯減弱(si-EpCAM-1：0.141±0.014,si-EpCAM-2：0.110±0.013),差異具有統計學意義(P<0.001,圖8),提示沉默EpCAM表達可抑制前列腺癌細胞遷移能力。同樣,Transwell實驗結果也顯示：EpCAM沉默后DU145細胞的遷移數目減少(圖9),上述結果均提示EpCAM參與前列腺癌細胞的遷移。為進一步觀察EpCAM對EMT相關蛋白表達的影響,采用Western blot法檢測si-EpCAM轉染后EMT相關蛋白的表達。結果顯示,與si-NC組相比,si-EpCAM組E-cadherin蛋白表達輕微升高,vimentin蛋白表達顯著降低(P<0.05,圖10)。

圖8 劃痕實驗檢測各組細胞的遷移能力：A.si-EpCAM轉染后,DU145細胞的遷移能力;B.各組細胞的遷移百分比統計圖;與對照組相比,***P<0.001

圖9 Transwell實驗檢測各組細胞的遷移能力：A.si-EpCAM轉染后,DU145細胞的遷移能力,結晶紫染色;B.各組細胞的遷移數量統計圖,與對照組相比,**P<0.01

圖10 EpCAM沉默后DU145細胞中EMT相關蛋白的表達

3 討論

EpCAM介導上皮細胞中與Ca2+無關的同型細胞之間的黏附,在乳腺癌、卵巢癌、胃癌等多種腫瘤細胞中表達增高,促進腫瘤細胞的增殖和侵襲,而抑制其表達可導致腫瘤細胞的增殖減少,降低腫瘤轉移的概率[4-7]。此外,研究發現EpCAM+細胞具有腫瘤干細胞(cancer stem cell, CSC)特征,有更高的集落形成效率、成瘤能力、自我更新和分化的潛力,可作為CSC的標志物用于篩選循環CSC[8]。然而,目前關于EpCAM在前列腺癌發生、發展過程中的作用及調節機制研究甚少。本實驗通過生物信息學分析和免疫組化染色結果發現,前列腺癌組織中EpCAM mRNA和蛋白表達水平均顯著高于良性前列腺組織,其表達與腫瘤大小及浸潤程度、Gleason評分及WHO/ISUP預后分級分組有關。有研究證實,EpCAM蛋白與前列腺癌患者血清PSA值、臨床病理分級、淋巴結轉移及復發情況等指標有關,參與腫瘤的發生及惡化,其低表達更有利于患者的預后[9]。然而,另有研究認為EpCAM蛋白與前列腺癌患者Gleason評分、淋巴結轉移及預后情況等無明顯相關[10],研究結果具有異質性。雖然研究結果尚存在爭議,但結合本組前期研究[11]及本研究結果,說明EpCAM參與前列腺癌的發生、發展及演進過程,其蛋白高表達與前列腺癌的惡性程度及不良預后等密切相關,可作為前列腺癌的早期診斷及預后評估指標。

HDAC6是HDACs家族中最大的成員,屬于Ⅱb類HDACs,主要調節細胞遷移、血管生成,介導腫瘤細胞增殖和凋亡,降解錯折疊蛋白質等生物學過程[12]。研究表明,HDAC6的去乙?；δ芘c底物蛋白乙?；癄顟B的動態平衡對生理功能的調節起重要作用,且HDAC6抑制劑在心血管疾病、惡性腫瘤及神經退行性疾病等治療方面均顯現了廣闊的應用前景[13]。本研究中,HDAC6蛋白在前列腺癌組織中的表達強度及陽性率均高于癌旁良性組織,然而其表達與前列腺癌患者年齡、腫瘤大小及浸潤程度、Gleason評分、血清PSA值及淋巴結轉移均無明顯相關性。國內外對HDAC6在不同癌癥中的研究結果也不盡相同,眾多研究認為HDAC6蛋白在喉癌、食管鱗狀細胞癌及胃癌等惡性腫瘤中高表達,但其高表達與臨床分期、腫瘤分化程度、患者年齡、腫瘤大小和淋巴結轉移的關系結果不全一致[14-17]。雖然,HDAC6參與腫瘤發生發展已成為共識,但結合本研究結果,認為HDAC6不能作為評估前列腺癌惡性程度及進展的獨立指標。數據庫分析及Spearman相關分析結果顯示,前列腺癌組織中EpCAM和HDAC6的蛋白及mRNA表達均呈正相關,提示EpCAM和HDAC6能協同參與前列腺癌的發展和轉移,聯合檢測EpCAM和HDAC6有望成為前列腺癌診斷和判斷預后的有效指標。

EMT是指具有上皮特征的細胞失去其特征,并獲得間質細胞特征的一過性過程。在惡性腫瘤的發展過程中EMT被重新激活,從而促進腫瘤轉移、侵襲及耐藥,在前列腺癌的發生、侵襲和轉移中發揮重要作用。研究發現,前列腺癌細胞經多西他賽處理后,EpCAM蛋白表達上調,促進EMT進程,證實在前列腺癌治療過程中多西他賽耐藥細胞的出現可能與EpCAM蛋白表達上調和EMT的發生有關[18]。此外,EpCAM通過調控PI3K/AKT/mTOR信號通路參與前列腺癌的增殖、侵襲、轉移及化療耐藥[19],而HDAC6也可通過調控Wnt/β-catenin和PTEN/AKT/mTOR信號通路,參與腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲及CSC的自我更新能力[20]。本實驗中,前列腺癌組織EpCAM表達缺失導致HDAC6蛋白表達減少,并且沉默前列腺癌細胞DU145的EpCAM蛋白表達,細胞的遷移能力明顯下降,EMT相關蛋白E-cadherin表達上調,vimentin表達下調,但參與的信號通路及分子機制有待進一步研究。

綜上所述,前列腺癌組織中EpCAM與HDAC6表達呈正相關,其高表達預示前列腺癌的惡性程度和不良預后,對前列腺癌患者的早期診斷和預后評估具有一定的指導意義。沉默DU145前列腺癌細胞的EpCAM蛋白表達,可下調HDAC6蛋白表達,抑制細胞的遷移,逆轉EMT進程,但具體作用機制及信號通路仍不清楚,有待后續深入探討。