結直腸癌中CD66b+腫瘤相關中性粒細胞和促纖維間質反應與臨床病理學特征及預后的關系

張 愛,朱 寧,楊路路,方 媛,王勁松,李 俐

結直腸癌(colorectal cancer, CRC)是繼肺癌和乳腺癌之后的全球第三大常見癌癥類型。流行病學研究發現,結腸癌的發病率呈上升態勢。即使在進行根治性切除的CRC患者中,仍有40%～50%的患者復發并死于轉移性疾病[1]。腫瘤TNM分期是CRC患者治療和預后評估的一項重要指標,但臨床研究發現相同的TNM分期患者對治療反應不同,預后也不同,表明TNM分期還無法精確地預測患者預后。近些年研究表明,腫瘤微環境(tumor microenvironment, TME)在腫瘤的發生、發展中發揮重要作用[2]。研究發現中性粒細胞除了具有直接殺菌活性外,還可以通過釋放多種蛋白酶來調節血管生成和組織重塑[3-4]。越來越多的研究表明,腫瘤相關中性粒細胞(tumor-associated neutrophils, TANs)通過分泌一些因子引起致癌或加速癌細胞增殖、腫瘤血管生成、遷移和侵襲。文獻報道TANs與胃癌、膽道癌和腎細胞癌等腫瘤的預后相關[5-7]。腫瘤促纖維間質反應(desmoplastic reaction, DR)是指機體對癌細胞引起的腫瘤周圍間質的反應,并發現不成熟型DR與CRC、胃癌和胰腺癌患者預后不良相關[8-11]。目前CRC中TANs與DR的關系尚未見文獻報道。本研究使用CD66b染色來標記CRC中TANs,分析CRC中TANs和DR的的臨床病理學意義及兩者的相關性。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2016～2017年南京醫科大學附屬南京醫院(南京市第一醫院)病理科診斷的CRC手術切除標本,剔除臨床資料不全、行新輔助治療或合并其他嚴重疾病者,共納入240例。其中男性155例,女性85例;年齡<70歲115例、≥70歲125例,平均68.65歲;低+中分化腺癌171例,高分化腺癌69例;pTNM分期：Ⅰ+Ⅱ期132例,Ⅲ+Ⅳ期108例。病例均由2名高年資病理醫師對HE切片進行重新評估,判斷其分化程度、浸潤深度、脈管侵犯、神經侵犯、淋巴結轉移等指標。

1.2 方法手術切除標本均經10%中性福爾馬林固定,常規石蠟包埋,4 μm厚切片,行HE和免疫組化染色。免疫組化染色采用EnVision法,在Dako Autostainer Link48免疫組化儀上進行,具體染色步驟參照儀器說明書進行。兔抗人CD66b單克隆抗體(克隆號EPR25354-2)購自Abcam公司,稀釋度1∶20 000。

1.3 結果判斷

1.3.1TANs判讀 形態學上,中性粒細胞是多形核細胞,細胞核呈分葉狀,染色質聚集、胞質嗜酸性。TANs定義為僅浸潤在腫瘤上皮細胞或腫瘤間質內的中性粒細胞,排除腫瘤腔內中性粒細胞伴粉刺型壞死、緊鄰壞死、隱窩破裂黏膜潰瘍的區域。TAN判讀方法參考相關文獻[12-13],即計數10個高倍視野中TANs的數量,取平均值作為該病例的TANs。根據每100個腫瘤細胞中<5、5～15和>15個中性粒細胞分別歸為中性粒細胞缺乏型(NP)、中性粒細胞中間型(NI)和中性粒細胞豐富型(NR)。

1.3.2DR判讀 DR的分類標準參照相關文獻分為成熟型、中間成熟型和不成熟型[14]。成熟型：是指纖細的膠原纖維呈多層分層狀、規則性排列,不含任何黏液基質或瘢痕疙瘩樣膠原纖維;中間型：是指當瘢痕疙瘩樣膠原混雜在成熟間質中時,通常與成熟膠原纖維方向平行;不成熟型：是指肥胖型的纖維母細胞散亂排列伴有明顯的黏液樣基質。由2名高年資病理醫師對所有腫瘤切片進行DR評估,判讀結果不一致者則由病理醫師在多頭顯微鏡下進行會診,得出判讀結果。

1.4 統計學分析數據均使用SPSS 27.0軟件進行統計學處理。采用描述性統計數據分析其臨床病理特征。應用χ2檢驗或Fisher精確概率法分析腫瘤內CD66b+TANs和DR分類與CRC臨床病理特征的相關。Kaplan-Meier法分析CD66b+TANs和DR與CRC患者預后的關系。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CRC中CD66b+TANs、DR與臨床病理特征的關系CRC中CD66b+TANs NR 29例,NI 47例,NP 164例(圖1)。為了方便分析,將NI/NP合并一組,結果顯示CRC中CD66b+TANs與患者年齡、性別、腫瘤大小、發病部位、神經侵犯和淋巴結轉移均無關(P>0.05),而與組織學分級、脈管侵犯、pTNM分期顯著相關(P<0.05,表1)。進一步分析發現,CRC中CD66b+TANs NR者,pTNM分期更高,分化更差,更容易出現脈管侵犯。DR中,不成熟型85例,中間型63例,成熟型92例(圖2),CRC中DR與患者性別、年齡、發病部位、腫瘤大小、脈管侵犯等均無關(P>0.05),而與腫瘤分化程度、神經侵犯、淋巴結轉移、pTNM分期密切相關(P<0.05,表1)。

表1 結直腸癌中CD66b+TANs、DR與臨床病理特征的關系

圖1 結直腸癌中TANs分類：A.TANs缺乏型;B.TANs中間型;C.TANs豐富型;D.CD66b在TANs缺乏型中的表達,EnVision法;E.CD66b在TANs中間型中的表達,EnVision法;F.CD66b在TANs豐富型中的表達,EnVision法

圖2 結直腸癌中DR分類：A.DR成熟型;B.DR中間型;C.DR不成熟型

2.2 CRC中CD66b+TANs、DR與預后的關系與CD66b+TANs NI和NP CRC患者相比,CD66b+TANs NR CRC患者的3年總生存率(overall survival, OS)較低,差異有統計學意義(P=0.065,圖3A)。CD66b+TANs NR的CRC患者3年OS明顯低于NI/NP CRC患者(P=0.021,圖3B)。不同類型DR CRC患者的3年OS差異有統計學意義,伴有不成熟型DR的CRC患者3年OS最低(圖3C)。多因素Logistic回歸分析顯示：TANs和DR是CRC預后的獨立影響因子(表2)。

表2 結直腸癌中單因素和多因素Logistic回歸分析

圖3 結直腸癌中CD66b+TAN和DR與患者3年總生存期的Keplan-Meier生存曲線：A.CD66b+TANs NR結直腸癌患者的3年總生存期低于NI和NP結直腸癌患者;B. CD66b+TANs NI/NP結直腸癌患者的3年總生存期高于CD66b+ TANs NR結直腸癌患者;C. DR不成熟型、中間型和成熟型結直腸癌患者的3年總生存期

2.3 CRC中CD66b+TANs與DR的相關性CRC中CD66b+TANs為NR者,腫瘤間質不成熟型17例(20.0%)、中間型6例(9.5%)和成熟型6例(6.5%);而CD66b+TANs為NI/NP者,間質不成熟型68例(80.0%)、中間型57例(90.5%)和成熟型86例(93.5%)。相關性分析顯示,隨著CD66b+TANs數量增加,DR由成熟型轉變至未成熟,TANs與DR呈負相關(r=-0.176,P=0.006,表3)。

表3 結直腸腺癌中CD66b+TANs與DR的相關性[n(%)]

3 討論

目前研究已表明惡性腫瘤的發生、發展不僅涉及惡性腫瘤細胞,而且還與TME密切相關。TME是一種由各種細胞類型包括癌癥相關性纖維母細胞、內皮細胞、免疫細胞和細胞外成分組成的復雜系統。TME內各種成分通過多種機制影響腫瘤細胞的進展,進而影響患者的預后。TANs不僅是炎癥微環境內一種主要的組成成分,也是腫瘤中一種主要的浸潤性免疫細胞成員[15]。現有的研究發現TANs以復雜和多用途的方式起作用,對癌細胞表現出直接的細胞毒性抑制轉移,但也能夠發揮促癌作用,如新生血管形成、促進癌細胞遷移、上皮-間葉轉化等[16-17]。

CRC中腫瘤內中性粒細胞的臨床病理學意義研究結果尚不一致,Galediero等[18]采用免疫組化法研究了271例Ⅰ～Ⅳ期CRC標本中CD66b和髓過氧化物酶(MPO)在中性粒細胞中的表達,結果發現CD66b是識別CRC組織中TANs的一種可靠標志物,Ⅳ期CRC患者中CD66b+TANs數量明顯低于Ⅰ～Ⅲ期,Cox分析顯示較高的TANs密度與預后好相關。另外,該研究還發現較高的TANs密度與基于5-FU化療有較好的反應。Ye等[19]使用ssGSEA和CIBERSOTR工具分析GEO和TCGA數據庫中1 802例CRC中腫瘤浸潤性免疫細胞包括CD66b+TANs的預后價值,并對1 008例CRC活檢標本進行CD66b免疫組化檢測,研究結果顯示高度豐富的CD66b+TANs與CRC預后相關,而且是一個獨立的預后因子。Yin等[20]研究發現在CRC浸潤前沿CD8+腫瘤浸潤性淋巴細胞和CD66b+TANs數量對預測CRC患者的生存可提供有意義的預后價值,研究結果發現腫瘤浸潤前沿CD66b+TANs數量降低與CRC淋巴結轉移密切相關,且與CRC患者低生存期和無瘤生存期均相關。這些研究結果提示,CD66b+TANs在CRC中的臨床病理學意義還需進一步研究。本研究應用免疫組化法檢測240例CRC腫瘤組織內CD66b+TANs數量,分析CD66b+TANs數量與CRC臨床病理特征及預后的關系,結果顯示CRC中CD66b+TANs數量與組織學分級、脈管侵犯、pTNM分期顯著相關;進一步分析CD66b+TANs與CRC患者預后的關系發現,NR CRC患者與NI/NP CRC患者相比,3年OS更差,提示CRC組織內CD66b+TANs數量可能促進CRC的侵襲轉移,腫瘤組織中CD66b+TANs數量高可能預測CRC患者不良的預后。

DR最早由Ueno等[21]提出,他們根據“瘢痕疙瘩樣”膠原纖維和黏液樣基質將纖維性癌性間質分為成熟型、中間型和不成熟型3類。最近對DR的組織學特征和不同類型的確定進行了更明確的定義[22-23]。在CRC研究中,Uneo等[24]的研究結果顯示DR類型與腫瘤部位、pT和pN分期、腫瘤分化、靜脈侵犯、腫瘤出芽和克隆氏樣淋巴結反應明顯相關,不成熟型DR與肝、肺、淋巴結、腹膜和局部區域高復發率有關,而且5年無瘤生存率在成熟型DR組高于未成熟型DR組。一項多中心研究也發現,DR分類是Ⅱ期CRC患者5年無復發生存的獨立危險因素,且DR分類與腫瘤出芽和靜脈侵犯存在顯著相關性[25]。最近一項三期前瞻性驗證研究結果顯示991例Ⅱ期結腸癌患者中,5年無復發生存率在成熟型組最高,其次為中間型,不成熟型組最低;多因素分析顯示DR分類是一個獨立的預后因素,也是預測無復發生存的第一個分割因子,其次為T分期、微衛星不穩定狀態和腫瘤出芽[26]。本研究結果顯示,CRC中DR分類與腫瘤分化程度、神經侵犯、淋巴結轉移、pTNM分期密切相關,具有不成熟型DR的CRC具有更加侵襲性臨床生物學行為,進一步分析還發現不成熟型DR的CRC患者3年OS明顯低于具有中間型和成熟型DR的CRC患者,且與Uneo等研究結果相似,多因素分析顯示DR類型是CRC患者3年OS的獨立預后因素,本研究結果進一步證實了CRC中DR類型不僅可影響腫瘤細胞的生物學行為,而且還可預測CRC患者的預后。

TME中含有多種成分,它們之間相互作用組成一個復雜的網絡影響惡性腫瘤的發生、發展。TME中免疫細胞和間質細胞的相互關系目前還沒有深入研究。Akimoto等[27]應用多種免疫熒光技術分析了908例CRC中T細胞和巨噬細胞與DR的關系,研究結果顯示不成熟型DR與較低的上皮內CD3+CD8+CD45RO+細胞和間質M1樣巨噬細胞相關,表明在CRC TME內腫瘤上皮內記憶細胞毒性T細胞和間質M1樣巨噬細胞與間質細胞可能發生相互作用影響腫瘤細胞的生物學行為。Gonzalez等[28]研究也發現CRC中上皮內腫瘤浸潤性淋巴細胞與低腫瘤出芽和非黏液樣DR明顯相關,提示TME中各種成分可能存在交互作用。本實驗結果顯示CRC中CD66b+TANs與DR分類呈負相關,CD66b+TANs越豐富的CRC,其DR越不成熟,提示CD66b+TANs可能通過分泌一些細胞因子影響DR的成熟,具體機制有待于進一步研究。

總之,CD66b+TANs和DR在CRC的侵襲轉移中發揮重要作用,CD66b+TANs豐富型和不成熟型DR的CRC患者具有不良的預后,CD66b+TANs與DR之間的負相關關系提示TANs可能影響DR類型。在臨床實踐中常規報告CD66b+TANs和DR類型可有助于預測CRC患者的預后。