兩種甲醇脫氫酶在食甲基桿菌甲醇代謝中的作用

郭雅卿，王東澍，朱 力，張惟材，劉 穎,*，王恒樑,*

（1.哈爾濱商業大學食品工程學院，黑龍江哈爾濱 150028；2.軍事醫學研究院生物工程研究所病原微生物生物安全國家重點實驗室，北京 100071）

吡咯喹啉醌（pyrroloquinoline quinone，PQQ）是一種不同于煙酰胺和核黃素的第三類氧化還原酶的輔酶[1]，具有增強抗氧化酶活性、促進生成神經生長因子、抗輻射、預防慢性心力衰竭、抗高原缺氧等作用[2-5]，在功能性食品和醫藥行業都具有良好的開發前景。目前，合成PQQ 的方式主要有化學合成法和微生物發酵法[6]。與化學合成法相比，微生物發酵法具有污染小、成本低、產率高等優點，因此在工業化生產中被廣泛應用[7]。迄今自然界中只有某些革蘭氏陰性菌能夠產生PQQ，其中甲基營養型細菌的PQQ 合成水平最高[8-9]。甲醇脫氫酶（methanol dehydrogenase，MDH）是甲基營養菌代謝甲醇的關鍵酶，首先催化甲醇還原PQQ 生成PQQH2，并以細胞色素c 作為電子受體，將兩個電子轉移至細胞色素c，在該過程中自由基半醌會將PQQH2再氧化回PQQ[10-11]。

甲醇脫氫酶存在于細胞周質中，有MxaFI和XoxF兩種類型[12-13]。MxaFI是由MxaF和MxaI所編碼的兩個α大亞基和兩個β小亞基組成的四聚體（α2β2），其中MxaF的活性位點需要Ca2+和PQQ 作為輔基[14-15]；XoxF型MDH 需要在活性位點上結合鑭系元素（如鑭或鈰等）和PQQ 才具有生物活性，實現對甲醇的氧化[16]。HIBI 等[17]從含有La3+培養基中生長的細胞中純化的MDH 對應于XoxF，而從Ca2+生長的菌體中純化得到的MDH 與MxaF相對應。在甲醇代謝過程中，MxaFI和XoxF兩種類型的MDH 存在著某種聯系和分工。CHISTOSERDOVA 等[16]研究發現，MxaF缺陷菌株不能在甲醇上生長，且認為在甲基營養菌中Ca2+依賴型的MxaF型MDH 是甲醇代謝中唯一活躍的MDH；后又發現缺失XoxF1和XoxF2的菌株不能利用甲醇作為碳源和能源生長，且幾乎完全喪失甲醇脫氫酶活性，與MxaF敲除菌株的表型相同。隨著對甲醇脫氫酶的深入研究，發現La3+能夠對甲醇脫氫酶進行調控。NAKAGAWA 等[18]向MxaF缺失株的培養基中補充La3+，發現能夠恢復菌體的生長，實驗表明XoxF在菌株AM1 中作為La3+依賴型的MDH 參與甲醇代謝。

甲醇脫氫酶對菌株生長及PQQ 合成有較大的影響[19]，李淼鑫等[20]發現提高MDH 的表達水平能夠影響PQQ 的生物合成水平。孫曉宇等[21]通過突變甲醇脫氫酶的啟動子來降低其活性，達到了提高PQQ 產量的目的。李大攀等[22]將MDH 基因敲除后，MDH 的活力、PQQ 合成水平及氧化甲醇的能力均下降。本實驗室從土壤中分離篩選得到一株PQQ 產生菌食葡糖食甲基桿菌MP688，能夠以甲醇為唯一碳源進行生長，后經多輪物理和化學誘變得到了高產菌株J1-1。在前期研究結果中，將菌株J1-1中的mpq0771基因敲除后，敲除菌不能利用甲醇生長，與Ca2+依賴的MDH 特征相似[21]。現經過基因比對分析，在基因組上找到了另外一個甲醇脫氫酶基因mpq2496，推測可能為La3+依賴的MDH。通過考察菌株生長狀態、PQQ 合成、MDH 表達及酶活等因素，初步分析了mpq0771和mpq2496基因在菌株生長代謝中的作用和關系，為闡明甲醇脫氫酶在食甲基桿菌的生長和代謝產物合成過程中的調控機制提了供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

食葡糖食甲基桿菌（Methylobacterium glucophilum）J1-1、大腸桿菌（Escherichia coli）pTIG、敲除菌J1-1Δmpq0771本實驗室保存；細菌基因組DNA提取試劑盒 北京天根生化科技有限公司；快速質粒小提試劑盒 南京諾唯贊生物科技有限公司；限制性內切酶（10 U/μL）、瓊脂糖凝膠DNA 回收純化試劑盒 賽默飛世爾科技公司；Pfu DNA 聚合酶（2.5 U/μL）、2×Basic Assemble Mix 北京全式金生物技術有限公司；細菌RNA 提取試劑盒、cDNA 第一鏈合成試劑盒、熒光定量PCR 試劑盒、大腸桿菌感受態細胞DH5α北京擎科生物科技有限公司；甲醇、酵母提取物、胰蛋白胨、瓊脂粉、NaCl、MgSO4·7H2O、（NH4）2SO4、Na2HPO4·12H2O、KH2PO4、MnCl2·4H2O、ZnSO4·7H2O、CuSO4·5H2O、CaCl2、檸檬酸鐵 分析純，國藥集團化學試劑有限公司；LaCl3·7H2O、慶大霉素（Gentamicin，Gm）、氨芐青霉素（Ampicillin，Amp）分析純，上海源葉生物科技有限公司；Tris-HCl 分析純，北京酷萊博科技有限公司；LB 培養基：蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 10 g/L，121 ℃滅菌；MP 基礎培養基：MgSO4·7H2O 0.2 g/L，KH2PO41.4 g/L，（NH4）2SO43.0 g/L，Na2HPO43.0 g/L，CaCl230.0 mg/L，MnCl2·4H2O 5.0 mg/L，ZnSO4·7H2O 5.0 mg/L，CuSO4·5H2O 0.5 mg/L，檸檬酸鐵30.0 mg/L，115 ℃滅菌，使用時添加甲醇至10 mL/L，得到MP 培養基，在MP 培養基中添加CaCl2或LaCl3的至終濃度為30 μmol/L，得到含各種金屬離子的培養基。

A-14 型常溫高速離心機、1-15K 型低溫高速離心機 美國Sigma 公司；9080 型恒溫培養箱 上海一恒科技公司；BP211D 型分析天平（精度0.01 mg） 德國Sartorius 公司；DYY-Ⅲ-8B 型穩壓穩流型電泳儀 北京六一儀器廠；WDP-160 型低溫振蕩搖床 北京沃德創新醫藥科技中心；Gel-pro 2020D 型凝膠成像儀 美國Pharmacia Biotech 公司；FLC-3 型超凈臺 哈爾濱東聯有限公司；PRO-2612433 型金屬浴 北京金銀杏生物科技有限公司；HZQ-F160型恒溫振蕩搖床 蘇州培英實驗設備有限公司；CFX96TM 型熒光定量PCR 儀、MiniPROTEAN?3 Cell 型蛋白電泳儀 美國Bio-RAD 公司；T-1 型PCR 儀 德國Biometra 公司；UV-2100 型紫外分光光度計 美國UNICO 公司；VC505 型超聲細胞破碎儀 美國Sonics 公司；Milropulser 型電轉化儀北京友華照欽醫療器械有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 生物信息學分析 利用J1-1 基因組序列和生物信息學分析篩選出基因組中甲醇脫氫酶基因，再通過BLAST 與扭脫甲基桿菌AM1 中的甲醇脫氫酶基因進行比對分析。基因和蛋白序列獲得及序列比對分析網址：http//www.ncbi.nlm.nih.gov/，MP688登錄號為CP002252.1，AM1 登錄號為CP001510.1。

1.2.2 分子生物學操作 基因組提取、質粒提取、PCR 產物擴增、酶切、連接、轉化等常規分子生物學操作參照文獻[23]方法。

1.2.3 引物設計 文中所需引物序列如表1。

表1 引物名稱及序列Table 1 Names and sequences of primers

1.2.4 敲除菌J1-1Δmpq0771的構建 以J1-1 基因組為模板，采用表1 引物UP-F、UP-R、DOWN-F、DOWN-R 分別擴增上、下游同源臂基因片段（1500 bp），引物Gm-F 和Gm-R 擴增Gm 抗性基因片段（789 bp），產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后，用膠回收試劑盒純化。pTIG 質粒用EcoRI、XhoI 內切酶進行雙酶切，37 ℃反應2 h，產物經1%瓊脂糖凝膠電泳回收。將上述回收產物利用2×Basic Assemble Mix 重組試劑盒進行連接，獲得的產物通過熱激轉化法轉入E.coliDH5α感受態細胞中，轉化后涂布至含有Amp 抗性的LB 平板上，37 ℃培養。挑取單克隆并活化，菌液PCR 進行驗證，結果為陽性的菌液進行測序鑒定。鑒定結果正確后，提取質粒pTIGUP-Gm-DOWN，以該質粒為模板，使用引物UP-F、DOWN-R 擴增片段UP-Gm-DOWN，片段經1%瓊脂糖凝膠電泳回收，回收后電擊轉入J1-1 感受態細胞中，通過Gm 抗性篩選得到敲除菌J1-1Δmpq0771。

1.2.5 生長曲線及PQQ 生物合成測定 將菌株接種至MP 基礎培養基中，30 ℃、200 r/min 進行活化，活化后分別接種至含有不同金屬離子的培養基中，每隔12 h 測定OD600及PQQ 合成水平，繪制生長曲線及PQQ 合成曲線圖，PQQ 測定方法參考文獻[24]中的光譜法。

1.2.6 甲醇脫氫酶酶活測定 取1 mL 培養至對數中期的菌液，10000 r/min 離心10 min 后棄上清，重懸于1 mL 20 mmol/L 的Tris-HCl（pH7.0）緩沖液中，置于冰浴中超聲處理，4 ℃低溫10000 r/min 離心5 min，上清液用于酶活性檢測，測定方法參考文獻[20]。

1.2.7 甲醇脫氫酶蛋白表達測定 取1 mL 已培養至對數中期的菌液，12000 r/min 離心1 min 后棄上清，重懸于500 μL 1×TE（10 mmol/L pH8.0 Tris-HCl）緩沖液中，置于冰上進行超聲破碎（工作3 s，間歇3 s，2 min）。破碎后的菌液在12000 r/min 下離心1 min，取上清進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodiumdodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）。

1.2.8 質譜鑒定 目的電泳條帶切下裝入無酶EP管中，封口膜封閉管口，送至北京華大基因有限公司進行蛋白質譜鑒定。

1.2.9 實時熒光定量PCR 將菌株J1-1 分別接種至甲醇/無、甲醇/Ca2+、甲醇/La3+和甲醇/Ca2++La3+培養基中，培養至對數生長期，利用試劑盒提取RNA 并逆轉錄為cDNA 后進行熒光定量PCR，檢測不同培養條件下mpq0771、mpq2496基因相對表達情況。

1.3 數據處理

各實驗的指標測定均重復3 次，結果用平均值±標準偏差表示，使用Microsoft Excel 進行繪圖；序列比對使用DNAMAN 軟件進行比對。

2 結果與分析

2.1 菌株J1-1 中甲醇脫氫酶基因的生物信息學分析

通過對J1-1 全基因組序列系統的比對，J1-1 中mpq0771基因與MxaF基因的核苷酸序列同源性為72%，氨基酸序列同源性為53%；mpq2496基因與XoxF基因的核苷酸序列同源性為66%，氨基酸序列同源性為53%；mpq0771基因與mpq2496基因的核苷酸序列同源性為61%，氨基酸序列同源性為48%。如圖1 所示，與MxaF 型MDH 的氨基酸序列的D303、E177 對應mpq0771 的D323、E198，推測為催化反應過程中所必需的，與Ca2+發生相互作用[25]；如圖2 所示，與XoxF 型MDH 的氨基酸序列的D320 對應mpq2496 的D357，推測參與催化反應并與La3+進行配位[26]。綜上結果提示，在菌株J1-1 中可能也存在兩種類型的甲醇脫氫酶。

圖1 mpq0771 中198、323 位氨基酸序列與MxaF 中177、303 位氨基酸序列比對Fig.1 Alignment of amino acid sequences 198 and 323 in mpq0771 and 177 and 303 in MxaF

圖2 mpq2496 中357 位氨基酸序列與XoxF 中320 位氨基酸序列比對Fig.2 Alignment of amino acid sequences 320 in mpq2496 and 357 in XoxF

2.2 Ca2+、La3+對菌株J1-1 生長及PQQ 生物合成的影響

將菌株J1-1 分別在甲醇/無、甲醇/Ca2+、甲醇/La3+和甲醇/Ca2++La3+4 種培養基中培養，每隔12 h取樣測定其OD600及PQQ 產量并繪制曲線（如圖3）。菌株J1-1 在含有Ca2+、La3+的培養基中的生長速率均高于在無離子添加培養下的生長速率。前期時，菌株J1-1 在添加Ca2+條件下的PQQ 合成量高于野生菌，后期時合成量低于野生菌；菌株J1-1 在兩種含La3+培養基中的PQQ 合成量一直低于野生菌。實驗表明Ca2+、La3+均能夠促進菌體的生長，但會顯著降低PQQ 合成量。

圖3 菌株J1-1 在不同培養條件下表型圖Fig.3 Phenotypic maps of J1-1 strain under different culture conditions

2.3 Ca2+、La3+對菌株J1-1 甲醇脫氫酶活力的影響

取1 mL 在甲醇/無、甲醇/Ca2+、甲醇/La3+和甲醇/Ca2++La3+4 種培養基中的J1-1 菌液，測定甲醇脫氫酶總酶活。如圖4 所示，在甲醇/La3+和甲醇/Ca2++La3+的培養條件下，菌株J1-1 的甲醇脫氫酶活性高于甲醇/Ca2+的培養條件。前期研究表明，菌株J1-1 的甲醇脫氫酶活性與PQQ 產量呈負相關，MDH 氧化甲醇速率加快，導致生成的甲醛累積，菌體“中毒”，從而PQQ 產量下降[21]，該實驗結果與J1-1在甲醇/La3+和甲醇/Ca2++La3+中的PQQ 合成量低于甲醇/Ca2+的現象相符。

圖4 菌株J1-1 在不同培養條件下甲醇脫氫酶酶活測定Fig.4 Determination of methanol dehydrogenase activity of strain J1-1 under different culture conditions

2.4 Ca2+、La3+對菌株J1-1 甲醇脫氫酶蛋白表達的影響

取1 mL 在甲醇/無、甲醇/Ca2+、甲醇/La3+和甲醇/Ca2++La3+4 種培養基中的J1-1 菌液，進行超聲處理，取全菌進行SDS-PAGE，蛋白電泳圖譜如圖5。根據前期實驗結果可知，65 kDa 處的蛋白條帶為mpq0771基因編碼的甲醇脫氫酶。mpq0771 在甲醇/無（泳道1 和2）、甲醇/Ca2+（泳道3 和4）條件下有明顯的表達；在甲醇/La3+（泳道5 和6）和甲醇/Ca2++La3+（泳道7 和8）的條件下無肉眼可見的條帶，但在其上方處出現一條蛋白表達量增加的條帶（蛋白分子量大約為68 kDa），膠內酶切并進行質譜分析鑒定。質譜結果如表2 所示，該蛋白條帶與mpq2496基因編碼的甲醇脫氫酶匹配最佳，分值為4757，覆蓋率為46%，且分子量大小也相符。以上結果顯示mpq2496與文獻[27-28]報道中XoxF 的特征相似，La3+存在時XoxF 基因表達更強。

圖5 菌株J1-1 在不同培養條件下蛋白表達圖Fig.5 Protein expression map of J1-1 strain under different culture conditions

表2 質譜檢測結果Table 2 Results of mass spectrum detection

2.5 Ca2+、La3+對菌株J1-1 甲醇脫氫酶基因相對表達量的影響

以cDNA 為模板，GAPDH為內參基因，測定菌株J1-1 在不同條件下mpq0771、mpq2496基因相對表達水平，結果分別如圖6a 和圖6b 所示。mpq0771和mpq2496 參與甲醇代謝并發揮作用，且Ca2+、La3+對二者的表達水平均有影響。與甲醇/無條件相比，La3+存在時，mpq2496的表達水平均上調，mpq0771的表達水平均下調。與SDS-PAGE 電泳結果相符，無離子添加和只添加Ca2+時，mpq0771 表達水平較高，但在La3+存在時，mpq0771 表達受到阻遏，mpq2496 表達被激活。WANG 等[29]研究也表明La3+可能會阻遏Ca2+依賴型酶和其他蛋白表達。

圖6 不同基因在不同培養條件下相對表達水平Fig.6 Relative expression of different genes under different culture conditions

2.6 Ca2+、La3+對敲除菌J1-1Δmpq0771 生長及PQQ生物合成的影響

mpq0771所編碼的甲醇脫氫酶是菌株J1-1 能夠利用甲醇進行生長的關鍵基因，在甲醇代謝過程中發揮重要作用。如圖7a 所示，菌株J1-1 在缺失mpq0771基因后，培養5 d 后其菌密度仍低于0.2，不能利用甲醇生長。圖7b 為PQQ 合成量圖，結果顯示J1-1Δmpq0771菌株可在含La3+的培養基中利用甲醇生長并能合成PQQ，說明有除mpq0771基因編碼的甲醇脫氫酶在發揮作用，使菌株能夠正常生長。

圖7 敲除菌J1-1Δmpq0771 在不同培養條件下表型圖Fig.7 Phenotypic maps of J1-1Δmpq0771 knockout strain under different culture conditions

2.7 Ca2+、La3+對敲除菌J1-1Δmpq0771 甲醇脫氫酶活力的影響

如圖8 所示，敲除菌J1-1Δmpq0771在Ca2+的培養基中不能利用甲醇進行生長，檢測不到甲醇脫氫酶的活性；在甲醇/La3+和甲醇/Ca2++La3+條件下的甲醇脫氫酶酶活，敲除菌J1-1Δmpq0771可以利用甲醇且能檢測到甲醇脫氫酶活性，說明mpq2496 能夠發揮甲醇脫氫酶的作用，也進一步反映了甲醇脫氫酶對于菌株利用和代謝甲醇的重要性。

圖8 敲除菌J1-1Δmpq0771 在不同培養條件下甲醇脫氫酶酶活測定Fig.8 Determination of methanol dehydrogenase activity of J1-1Δmpq0771 knockout strain under different culture conditions

2.8 Ca2+、La3+對敲除菌J1-1Δmpq0771 甲醇脫氫酶蛋白表達的影響

敲除菌J1-1Δmpq0771的SDS-PAGE 電泳結果如圖9 所示。J1-1Δmpq0771在甲醇為碳源的培養基中不能生長，但可在果糖為碳源的培養基中生長。在MP/果糖中J1-1Δmpq0771（泳道2）相較于野生菌J1-1（泳道1）的蛋白指紋圖譜缺失一條65 kDa 的甲醇脫氫酶蛋白條帶，說明在J1-1Δmpq0771中mpq0771 編碼的甲醇脫氫酶不能正常表達，也印證了敲除基因mpq0771后菌株不能再利用甲醇。J1-1Δmpq0771菌株在La3+（泳道3）和Ca2++La3+（泳道4）的培養條件下，mpq2496編碼的甲醇脫氫酶蛋白表達量較野生菌高，說明當La3+存在時，mpq2496 能夠代替mpq0771 發揮甲醇脫氫酶的作用，即能夠利用甲醇進行生長。

圖9 敲除菌J1-1Δmpq0771 在不同培養條件下蛋白表達圖Fig.9 Protein expression profiles of J1-1Δmpq0771 knockout bacteria under different culture conditions

3 結論

在菌株J1-1 中存在著兩種類型的甲醇脫氫酶，mpq0771基因編碼的是Ca2+依賴的MxaF 型MDH，mpq2496基因編碼的是La3+依賴的XoxF 型MDH，且均參與甲醇代謝。通過考察Ca2+、La3+對菌株J1-1生長狀態、PQQ 合成、MDH 表達及酶活等的影響，發現敲除mpq0771基因會對菌株的生長及對甲醇的利用產生較大影響，提示該基因在甲醇代謝中的重要性，且當其表達量高時PQQ 合成水平較高。研究還發現，La3+能使敲除菌J1-1Δmpq0771利用并代謝甲醇，該結果反映了La3+存在時mpq2496 可以代替mpq0771 發揮甲醇脫氫酶的作用，維持菌體生長，即La3+可使XoxF 型MDH 成為食甲基桿菌的主要甲醇脫氫酶[30]，mpq0771 與mpq2496 之間還具有分工作用。

綜上，菌株J1-1 中mpq0771及mpq2496基因編碼的甲醇脫氫酶在甲醇代謝中具有重要作用，也進一步說明了甲醇脫氫酶是甲醇代謝過程中的關鍵調控點[31]。菌株J1-1 中的兩種甲醇脫氫酶具有高表達的特性，提示可利用基因工程技術對此開發一種表達外源蛋白的系統。甲基營養菌具有特殊的一碳代謝網絡，可實現利用生物轉化生產高附加值產品，如化工產品、天然產物、食品添加劑等[32-33]，因此對甲醇脫氫酶作用的研究不僅可為后續深入研究甲基營養菌甲醇利用途徑提供理論依據，還有利于生物發酵業的發展。

? The Author(s) 2024.This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License (https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).