煮制壓力和保壓時間對雞肉肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)的影響

何 珊，王昱蘇，張 碩，金 嫘，查恩輝

（錦州醫(yī)科大學(xué)食品與健康學(xué)院，遼寧錦州 121000）

雞肉是人類最主要的膳食蛋白質(zhì)來源之一，雞肉中的脂質(zhì)含量較低，富含多不飽和脂肪酸[1]，具有理想的營養(yǎng)特性和多種保健功能，如溫補(bǔ)氣血、補(bǔ)精補(bǔ)髓、強(qiáng)健筋骨等[2]。此外，因低膽固醇、價格低廉、沒有文化和宗教限制等特點(diǎn)，雞肉在全球范圍內(nèi)的消費(fèi)量不斷增加[3-4]。在發(fā)達(dá)國家，消費(fèi)者越發(fā)重視肉類的質(zhì)量安全和營養(yǎng)健康[5-6]。雞胸肉作為其最大的主要部位，烹飪方便快捷，有一定市場前景[7]。脂質(zhì)以及蛋白質(zhì)發(fā)生氧化損傷是影響肉制品保質(zhì)期和營養(yǎng)價值的主要原因[8-9]。肌肉內(nèi)脂肪含量和肌肉纖維類型是影響各類肉質(zhì)口感、嫩度和多汁性等特征的主要因素[10-11]。

在肉制品的熱處理方式中常壓蒸煮和高壓煮制是世界范圍內(nèi)廣泛使用的肉類加工技術(shù)[12]。代媛媛等[13]研究發(fā)現(xiàn)不同的煮制溫度和保溫時間對雞胸肉嫩度和蒸煮損失率均產(chǎn)生明顯的影響。劉晶晶等[14]研究表明隨著加熱的時間和溫度的增大，牛肉的剪切力值降低，蒸煮損失率增加，水分含量下降。Zielbauer 等[15]研究發(fā)現(xiàn)，煮制豬肉時，蒸煮損失和煮制時間和溫度呈正相關(guān)，水分損失主要出現(xiàn)在240 min 內(nèi)、煮制溫度大于60 ℃時。近年來，關(guān)于高壓技術(shù)在改善肉類品質(zhì)方面的研究日益廣泛。鄭海波[16]的研究表明，對雞肉糜進(jìn)行較長時間的高壓處理能提高肉的嫩度，這是由于壓力作用下肌肉肌節(jié)結(jié)構(gòu)被破壞，肌纖維結(jié)構(gòu)也產(chǎn)生變化。雖然高壓對肉品嫩化起到優(yōu)化作用[17]，但高壓技術(shù)在工業(yè)實施中成本較高，設(shè)備成本與其經(jīng)濟(jì)產(chǎn)出不平衡，并且伴隨著強(qiáng)烈的脫色反應(yīng)[18]，而肉類顏色作為肉類新鮮度和質(zhì)量的重要指標(biāo)之一，會大大減少消費(fèi)者購買欲望[19]。相比于高壓煮制，微壓煮制可以更少地?fù)p害食品營養(yǎng)和風(fēng)味，同時縮短加熱煮制時間。目前微壓煮制主要應(yīng)用在米飯、豆?jié){熟制方面，對食品品質(zhì)具有改善作用[20-21]。雞肉中的蛋白質(zhì)是人類所需的必需氨基酸和營養(yǎng)物質(zhì)的來源之一。蛋白氧化不僅會改變蛋白質(zhì)的一些功能特性和質(zhì)構(gòu)特征，還會對肉品中的蛋白質(zhì)微觀結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，進(jìn)而對肉制品加工產(chǎn)生一定的影響。對比已有研究發(fā)現(xiàn)，微壓煮制對食品品質(zhì)的效果更好，但對于微壓煮制對雞肉肌原纖維蛋白的影響研究在國內(nèi)外較少且不深入。

因此，本研究的目的是對比常壓煮制、微壓煮制、高壓煮制對雞胸肉的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及氧化穩(wěn)定性的影響，找到最佳的煮制工藝參數(shù)，明確微壓煮制的特點(diǎn)及優(yōu)勢，為醬鹵雞肉預(yù)制產(chǎn)品的生產(chǎn)提供數(shù)據(jù)參考和技術(shù)支持。以雞肉蛋白質(zhì)氧化為標(biāo)準(zhǔn)對雞肉進(jìn)行評價，為更低成本、更高效率地獲得高品質(zhì)雞肉提供相關(guān)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雞胸肉（新鮮）購于錦州市比優(yōu)特超市；磷酸溶液、氯化鈉、氯化鎂、氫氧化鈉等試劑 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；濃鹽酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、鹽酸胍、甲醇、溴化鉀、乙醇、尿素、十二烷基硫酸鈉（SDS）等試劑 天津博迪化工有限公司；磷酸二氫鉀、溴酚藍(lán)、2,4-二硝基苯肼、磷酸氫二鉀、乙酸乙酯、三氯乙酸、乙二胺四乙酸（EDTA）等試劑 恒興化學(xué)試劑制造有限公司；所有試劑均為分析純。

FA1004 電子天平 青島聚創(chuàng)環(huán)保集團(tuán)有限公司；KH20R 高速冷凍離心機(jī) 上海雙旭電子有限公司；CH6 數(shù)字顯示溫度計 廣州海倫儀器儀表有限公司；JJ-2 高速勻漿機(jī) 上海啟前電子科技有限公司；HH-WO 恒溫水浴鍋 山東千司科學(xué)儀器有限公司；U-T6 紫外可見分光光度計 讓奇（上海）儀器科技有限公司；V-PHSJ-5 型pH 計 上海熠昕電子科技有限公司；W-Great20 傅立葉紅外光譜儀 中科瑞捷科技有限公司；X-FD-1A-50 冷凍干燥機(jī) 杭州漢德空分設(shè)備有限公司；JSM-IT200 掃描電子顯微鏡 惠州市華高儀器設(shè)備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品前處理 用流水將肉表面洗干凈，均勻切割為4 cm×3 cm×3 cm 的小塊，放在燒杯內(nèi)，用保鮮膜蓋緊，在4 ℃的冰箱中保存。

1.2.2 雞肉煮制處理 常壓煮制處理：將肉樣放入裝有500 mL 的燒杯中，再放入85 ℃恒溫水浴鍋中，用電子溫度記錄儀檢測肉塊中心溫度達(dá)到72 ℃。

微壓樣品處理：將被測肉樣放入微壓鍋，壓力為4 kPa。

高壓樣品處理：把被測試的肉樣放入高壓鍋，壓力為70 kPa。

保壓時間分別為15、20、25、30、35 min，完成后取出冷卻至室溫[22]。

用吸水紙吸干肉樣表面汁液，測定其余指標(biāo)。實驗進(jìn)行三次獨(dú)立重復(fù)測定。

1.2.3 肌原纖維蛋白的提取 參考文獻(xiàn)[23-24]方法稍作修改。稱取肉樣，添加其四倍量的4 ℃提取液（10 mmol/L 磷酸緩沖溶液，其中包括100 mmol/L NaCl、1 mmol/ EDTA 以及2 mmol/L MgCl2，pH7.0），混合搖勻后進(jìn)行勻漿，勻漿120 s 后在3500 r/min、4 ℃下離心15 min。取沉淀，將勻漿反復(fù)離心三次，于以上條件下棄去上清液，得到的沉淀以四倍量4 ℃洗液洗滌（25 mmol/L 磷酸鹽緩沖液，含0.6 mol/L NaCl，pH7.0）反復(fù)洗滌三次后過濾，用0.1 mol/L HCl 將濾液pH 調(diào)節(jié)至6.0，所得濾液在3500 r/min和4 ℃的條件下再次離心15 min。所得沉淀放入封閉瓶內(nèi)，4 ℃保存，待用。采用牛血清蛋白作標(biāo)準(zhǔn)，540 nm 處測其吸光度和雙縮脲法檢測蛋白濃度（y=0.0485x+0.0032，R2=0.9997）。

1.2.4 羰基含量的測定 參考Pérez-Alvarez 等[25]方法稍加修改。取1 mL 質(zhì)量濃度為2 mg/mL 的蛋白溶液和1 mL 濃度為0.01 mol/L 的2,4-二硝基苯肼溶液（DNPH，溶劑為2 mol/L HCl），空白樣品不加DNPH，暗室避光反應(yīng)1 h，每次間隔20 min 振蕩1 次，加1 mL TCA 溶液，搖勻后離心，在10000 r/min，4 ℃條件下離心15 min，除去上清液。得到的沉淀使用1 mL 乙酸乙酯-乙醇溶液（V/V=1:1）清洗3 次。再加入5 mL 6 mol/L 的鹽酸胍溶液，于38 ℃水浴條件下反應(yīng)20 min，隨后在10000 r/min 和4 ℃的條件下繼續(xù)離心5 min。在370 nm 波長處測定吸光度，羰基含量通過22000 L/（mol·cm）的摩爾吸收率計算。

式中：A370為370 nm 下的吸光度；n 為稀釋倍數(shù)；106為摩爾基礎(chǔ)單位；C 為測得的蛋白濃度（mg/mL）。

1.2.5 巰基含量的測定 參考Yang 等[26]方法稍加修改。取蛋白溶液用0.1 mol/L 的磷酸緩沖液（pH7.4）稀釋為質(zhì)量濃度2 mg/mL，所得溶液取0.5 mL 于試管中，加入2.0 mL 尿素-SDS 溶液和0.5mL DTNB 溶液，混合搖勻，室溫下置于暗處反應(yīng)25 min，在412 nm 處測定吸光度。巰基含量由11400 L/（mol·cm）的摩爾吸收率計算。

式中：A412為412 nm 下的吸光度；n 為稀釋倍數(shù)；106為摩爾基礎(chǔ)單位；C 為測得的蛋白濃度（mg/mL）。

1.2.6 掃描電鏡觀察 參考孫慧琳[27]的方法稍加修改。將雞肉樣品沿肌纖維方向切成0.1 cm×0.1 cm×0.2 cm 的小肉片，用2.5%戊二醛浸泡12 h，加入0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液浸泡固定3 次，每次20 min；完成后進(jìn)行梯度脫水，分別用30%、50%、70%、80%和90%的乙醇，每次15 min，再用無水乙醇進(jìn)行脫水兩次，每次15 min；最后，在冷凍干燥及金噴涂后用掃描電鏡觀察并拍攝肉樣結(jié)構(gòu)。

1.2.7 傅里葉變換紅外光譜測定 參考Yang 等[28]方法稍加修改。在-20 ℃的條件下冷凍蛋白樣品5 h，之后取出冷凍干燥12 h，稱量1 mg 所得樣品向其中加入100 mg 溴化鉀，于研缽內(nèi)充分研磨。將所得粉末均勻平鋪模具中并橫向置于模座內(nèi)，加壓至10 t/cm2，保持1 min，用傅里葉紅外光譜儀進(jìn)行分析，條件為：光譜范圍：500～4000 cm-1，分辨率：4 cm-1，掃描積累32 次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組實驗均重復(fù)3 次以上，采用SPSS 26 對數(shù)據(jù)處理和方差分析，多重比較采用Duncan 法，并采用Origin2021 進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 煮制壓力對雞肉蛋白羰基含量的影響

在蛋白質(zhì)的氧化性反應(yīng)中，最常見的指示劑是羰基的含量，雞肉內(nèi)羰基直接被蛋白質(zhì)側(cè)鏈上的氨基酸氧化或主肽鏈發(fā)生斷裂而產(chǎn)生，也可由于雞肉被氧化而產(chǎn)生非蛋白羰基化合物。這類氨基酸側(cè)鏈直接氧化是目前公認(rèn)的生成蛋白質(zhì)羰基衍生物最重要的方法[29]，結(jié)果見圖1。

圖1 不同壓力及時間對蛋白羰基含量的影響Fig.1 Effects of different pressure and time on protein carbonyl content

由圖1 可知，保壓時間為15～35 min 時，常壓煮制下羰基含量從0.86 nmol/mg 增加到1.91 nmol/mg，增加了1.22 倍；微壓煮制下羰基含量從1.14 nmol/mg 增加至2.71 nmol/mg，增加了1.38 倍；高壓煮制下羰基含量從1.33 nmol/mg 增加至2.91 nmol/mg，增加了1.19 倍。三種壓力下隨著保壓時間的增加羰基含量均升高，原因是脂質(zhì)氧化的產(chǎn)物與肌原纖維蛋白相結(jié)合，使得蛋白質(zhì)羰基的含量升高，而在雞肉中較少的脂肪發(fā)生氧化反應(yīng)，也會引起羰基的升高[30]。

2.2 煮制壓力對雞肉蛋白巰基含量的影響

蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)主要通過分子間各種作用力共同形成，其中二硫鍵對蛋白質(zhì)的一級、二級和三級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性都起著重要的作用[31]。二硫鍵與巰基之間是一種動態(tài)的相互轉(zhuǎn)化關(guān)系。蛋白質(zhì)之間疏水性質(zhì)、相互作用力等功能的改變是代表蛋白質(zhì)變性情況的主要指標(biāo)，其改變的主要原因之一是二硫鍵與巰基的共價交聯(lián)與斷裂改變蛋白質(zhì)的作用力情況并影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)[32]。巰基有維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及功能特性的作用，屬于功能基團(tuán)中活性較強(qiáng)的一類基團(tuán)，結(jié)果見圖2。

圖2 不同壓力及時間對蛋白巰基含量的影響Fig.2 Effects of different pressure and time on protein sulfhydryl content

由圖2 可知，常壓煮制時間為15～20 min 時，巰基含量從68.5 nmol/mg 增加至78.4 nmol/mg，繼續(xù)延長保壓時間至35 min，巰基含量下降到55.2 nmol/mg，下降了29.6%。當(dāng)煮制時間持續(xù)延長，巰基含量先上升再下降，這是因為肉樣受熱影響了肌動球蛋白的解離程度，當(dāng)保壓時間達(dá)到20 min 時肌動蛋白最大程度解離，巰基含量在此時達(dá)到最高，繼續(xù)煮制后改變了肌動球蛋白構(gòu)象，巰基氧化生成為二硫鍵[33]，使得巰基含量降低。微壓煮制下，保壓時間為15～35 min，巰基含量從76.1 nmol/mg 減少至53.4 nmol/mg，下降了29.8%。高壓煮制下，保壓時間為15～35 min 時，巰基含量從70.4 nmol/mg 減少至48.3 nmol/mg，下降了31.4%。高壓及微壓條件下，當(dāng)保壓時間延長，巰基含量同步減少，原因是壓力處理使肌原纖維蛋白展開，更多隱藏的巰基暴露，增加疏水性，使分子間巰基間距變小，促進(jìn)二硫鍵的形成，致使巰基減少[34]。

2.3 煮制壓力對肌纖維微觀結(jié)構(gòu)的影響

采用最佳加工工藝組合處理雞胸肉，同時進(jìn)行對照處理（生雞胸肉）。不同的煮制壓力下各組雞胸肉的掃描電鏡圖結(jié)果見圖3。

圖3 雞胸肉的微觀纖維結(jié)構(gòu)圖（5000×）Fig.3 Microscopic fiber structure of chicken breast (5000×)

圖3A 為對照組生雞胸肉樣品的肌纖維結(jié)構(gòu)圖，可以看出生雞胸肉肌纖維空隙較小，組織結(jié)構(gòu)致密且有序，紋理清晰，肌束膜以及肌內(nèi)膜的結(jié)構(gòu)比較完整，具有疏松的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。圖3B 為常壓煮制下雞胸肉樣品的肌纖維結(jié)構(gòu)圖，與生雞肉樣品相比，常壓煮制下雞胸肉樣品表面紋理模糊，膜結(jié)構(gòu)開始出現(xiàn)部分?jǐn)嗔驯澜猓屑?xì)微顆粒化物質(zhì)出現(xiàn)，結(jié)構(gòu)的有序度被破壞；圖3C 為4 kPa 微壓煮制下雞胸肉樣品的肌纖維結(jié)構(gòu)圖，可以看出雞胸肉的肌纖維與常壓煮制下雞胸肉樣品類似，但在肌纖維空隙中呈現(xiàn)出更明顯的顆粒化物質(zhì)；圖3D 為70 kPa 高壓煮制下雞胸肉樣品的肌纖維結(jié)構(gòu)圖，相較于常壓蒸煮及微壓煮制，高壓煮制下雞胸肉中肌纖維結(jié)構(gòu)被完全破壞，肌節(jié)斷裂，幾乎看不到顆粒化物質(zhì)，絕大部分肌束膜裂解，基本完全消失。綜上所述，經(jīng)三種不同壓力煮制后的雞胸肉結(jié)構(gòu)被破壞程度大小為高壓煮制＞微壓煮制＞常壓煮制。

2.4 煮制壓力對肌原纖維蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響

傅里葉變換紅外光譜用于分析蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)，可定量分析蛋白各二級結(jié)構(gòu)含量[35]，各子峰與其二級結(jié)構(gòu)的對應(yīng)關(guān)系如下：1615～1637 cm-1為β-折疊；1637～1645 cm-1為無規(guī)則卷曲；1646～1661 cm-1為α-螺旋；1660～1695 cm-1為β-轉(zhuǎn)角[24]。在此基礎(chǔ)上，通過對不同水煮壓力下的傅里葉光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行基線修正，然后通過計算二階導(dǎo)數(shù)和去卷積等方法剔除多余的子峰，最后通過Peakfit 擬合得到最小的剩余值。根據(jù)其峰面積來計算各類二級結(jié)構(gòu)比率，結(jié)果如圖4～圖6。

圖4 常壓煮制下不同時間對雞胸肉肌原纖維蛋白的二級結(jié)構(gòu)相對含量圖Fig.4 Relative content of secondary structure of myofibrillar protein in chicken breast at different time under atmospheric pressure cooking

圖5 微壓煮制下不同時間對雞胸肉肌原纖維蛋白的二級結(jié)構(gòu)相對含量圖Fig.5 Relative content of secondary structure of myofibrillar protein in chicken breast at different time under micro-pressure cooking

圖6 高壓煮制下不同時間對雞胸肉肌原纖維蛋白的二級結(jié)構(gòu)相對含量圖Fig.6 Relative content of secondary structure of myofibrillar protein in chicken breast at different time under high pressure cooking

由圖4～圖6 可知，不同煮制壓力下，肌原纖維蛋白的二級結(jié)構(gòu)含量隨保壓時間延長發(fā)生的變化不相同。在常壓煮制下，保壓15～35 min 時，α-螺旋的百分比含量從28.74%下降至10.52%，β-折疊的百分比含量從18.13%增加至57.42%，無規(guī)則卷曲的百分比含量從20.59%增加至45.5%，β-轉(zhuǎn)角從11.48%增加至13.53%。隨著壓力保持時間的延長，α-螺旋的含量降低，β-折疊、無規(guī)則卷曲和β-轉(zhuǎn)角的含量則增加。在微壓煮制下，保壓15～35 min，α-螺旋含量由27.16%降低至9.63%；無規(guī)則卷曲含量從27.46%增加至46.69%；β-轉(zhuǎn)角呈波動性變化；保壓15～35 min，β-折疊含量呈明顯上升趨勢，由28.52%升高至45.09%。在高壓煮制下，保壓15～25 min，β-折疊含量從30.03%增加至58.01%，直到35 min，β-折疊含量下降至43.23%；當(dāng)保壓15～35 min 時，無規(guī)則卷曲含量從28.70%增加至58.61%，α-螺旋含量由25.74%減小到8.05%，β-轉(zhuǎn)角含量隨時間延長波動。

總的來說，保壓時間的持續(xù)延長導(dǎo)致β-折疊和無規(guī)則卷曲的含量逐漸升高，α-螺旋含量逐漸降低，造成這種現(xiàn)象的原因是壓力的增長以及保壓時間的延長促進(jìn)肌原纖維蛋白的α-螺旋向β-折疊和無規(guī)則卷曲轉(zhuǎn)換[36]。α-螺旋是一種由分子中的氫鍵形成的有序結(jié)構(gòu)。在不同的煮制壓力下，隨著保壓時間的增加，α-螺旋的含量都有所下降，這說明加熱可以削弱保持α-螺旋結(jié)構(gòu)的氫鍵作用，從而對蛋白質(zhì)的去折疊起到了促進(jìn)作用；β-折疊結(jié)構(gòu)也是一種由分子間的氫鍵維持的有序排列，當(dāng)它被加熱后，它的含量會增加，這就意味著分子間的氫鍵作用會加強(qiáng)，從而導(dǎo)致它的聚集程度會變得更大[37]。此外，高壓煮制過程中β-折疊的含量呈先增加后減少的趨勢，而水的分子因高壓煮制的后期會隨著二級結(jié)構(gòu)的膨脹而遷移，疏水基團(tuán)與巰基的接觸為蛋白質(zhì)提供了更大的空間，蛋白質(zhì)在這個過程中逐漸發(fā)生團(tuán)聚，β-折疊結(jié)構(gòu)也開始解體，分子之間疏水作用也開始產(chǎn)生無規(guī)則卷曲[38]。

3 結(jié)論

隨著保壓時間的延長，羰基含量呈現(xiàn)上升趨勢，常壓、微壓、高壓煮制羰基含量分別增加了1.22 倍、1.38 倍、1.19 倍，巰基含量呈下降趨勢，常壓、微壓、高壓煮制巰基含量分別減少了29.6%、29.8%、31.4%；隨著保壓時間的延長肌原纖維蛋白二級結(jié)構(gòu)中β-折疊含量和無規(guī)則卷曲含量增加，α-螺旋含量降低；對雞胸肉蛋白結(jié)構(gòu)的破壞程度為高壓＞微壓＞常壓。本研究結(jié)論明確了不同煮制壓力下蛋白質(zhì)氧化規(guī)律，下一步將蛋白氧化程度與雞肉的食用品質(zhì)進(jìn)行相關(guān)性分析，為優(yōu)化煮制的方法和工藝參數(shù)提供參考依據(jù)。

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