亞臨界水萃取薄荷黃酮工藝優化及神經保護活性研究

張晴晴，張夢嬌，馬翊銘，蔡學一

（1.亳州學院中藥學院，安徽亳州 236800；2.江南大學化學與材料工程學院，江蘇無錫 214000；3.安徽雷允上藥業有限公司，安徽亳州 236800）

神經退行性疾病，包括阿爾茨海默病（Alzheimer disease，AD）、帕金森氏病（Parkinson′s disease，D）等，是一種中樞神經系統細胞組織發生的非正常蛻變現象[1-3]。隨著社會老齡化，AD 和PD 發病率和病死率逐年上升，嚴重地影響著老年人的生活質量，故預防和治療具有十分重要的意義[4-6]。近年來，研究報道黃酮類成分能夠保護神經元，能夠對抗神經細胞凋亡保護腦損傷，在一定程度上在退行性疾病中具有神經保護作用[7-9]。甘草黃酮中甘草素能夠保護大鼠腎上腺嗜鉻細胞（PC12 細胞）的凋亡，具有神經保護作用[10]。葛根素對β淀粉樣蛋白（Aβ）[11]、MPP+[12]、H2O2[13]誘導PC12 細胞的損傷均有抗凋亡的保護作用，說明能夠緩解對PC12 細胞的損傷。同時，黃酮類物質因具有多種促進人類健康的生物活性、且無毒副作用，因此被認為是功能性食品和藥品的重要原料，受到廣泛關注[14]。

薄荷（Mentha haplocalyxBriq.）是一種常用的藥食同源類植物，是唇形科植物薄荷的干燥地上部分[15]。現代研究表明，薄荷具有抗病毒、抗癌、抗菌、抗氧化和抗輻射等藥理作用，另外，薄荷還可以改善新型冠狀病毒肺炎患者的癥狀[16-17]。薄荷中具有多種化學成分，起主要作用的有黃酮類、醌類、揮發油、有機酸等，其中黃酮類物質為薄荷中重要的活性成分[18-19]。從薄荷中已分離出40 多種黃酮類化合物，例如橙皮苷、蒙花苷、蘆丁、二氫黃酮苷、香蜂草苷等[20-21]。目前，薄荷黃酮生物活性研究主要集中于抗氧化活性[16]、抗炎活性[17]、抗菌活性[18]等，而對其體外神經保護活性的研究鮮有報道[22-23]。

薄荷黃酮類物質常用的提取方法主要有機溶劑浸提法、超聲波提取法和超臨界CO2萃取法[24-26]，且提取溶劑（或夾帶劑）均為有機溶劑，以上方法存在溶劑易殘留、提取時間長、工藝復雜、產率低、對環境不夠友好等問題，因此不能滿足現代化醫藥的生產需求。近年來，亞臨界水提取技術（subcritical water extraction，SWE）因綠色環保、時間短、產率高等優勢成為研究的熱點，被廣泛用于天然產物活性成分的提取[27-29]。亞臨界水是指在一定壓力下，將水加熱到100～374 ℃下仍保持液態，通過控制溫度和壓力改變水的極性、黏度和表面張力，因此具有與有機溶劑類似的性質，有利于中、弱極性物質的提取[30-32]。Lachos-Perez 等[33]采用亞臨界水萃取法（SWE）從脫脂橙子中萃取黃烷酮，研究了通過改變介電常數來提取非極性黃酮類化合物的綠色工藝，并與三種常規提取方法進行了比較，結果表明，與常規提取相比，SWE 是一種高效的方法，用于回收具有高抗氧化活性的生物活性化合物。Zhang 等[34]首次采用亞臨界水作為萃取葛根異黃酮的有效溶劑。通過單因素實驗確定了4 種主要異黃酮的最佳提取工藝條件，并進一步通過響應面法確定了總異黃酮提取的最佳工藝條件。與常規溶劑相比，亞臨界水使用更少的溶劑并且需要更短的萃取時間。因此，SWE 因高效清潔、綠色環保等優點被廣泛應用于揮發油類、黃酮類等成分的提取。但有關亞臨界水萃取薄荷黃酮的研究尚未見報道。

本文采用亞臨界水提取薄荷中的黃酮類物質，利用響應面法優化提取工藝，體外建立H2O2誘導PC12 細胞自由基損傷模型，通過噻唑藍（methyl thiazolye tetrazolium，MTT）法考察薄荷黃酮對PC12細胞存活力的影響，旨在實現薄荷黃酮綠色高效萃取的同時，為薄荷資源的深度開發利用及工業化生產提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

薄荷全草 購于安徽省亳州市康美中藥材市場；PC-12（高分化）細胞株（大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤） 購于中國科學院上海生化細胞所；二甲基亞砜（DMSO）購于上海泰坦科技股份有限公司；噻唑藍試劑（methyl thiazolye tetrazolium，MTT）、PBS 緩沖液、1640 基礎培養基（無血清）、胰酶細胞消化液、PC12（高分化）細胞專屬培養基（RPMI 1640 培養基+10% FBS+1% P/S）均購于合肥博美生物科技有限責任公司；蘆丁對照品 購于中國藥品生物制品檢定所；其他試劑 均為分析純，購于國藥集團化學試劑有限公司。

KCFD05-03 型亞臨界反應釜 煙臺科立自控設備研究所；UV4150 紫外可見分光光譜儀 日本島津；IKA/RV10 數顯型旋轉蒸發儀 艾卡儀器設備有限公司（德國）；Axiovert 5 倒置生物顯微鏡 蔡司公司（德國）；Thermo Multiskan FC 全自動酶標儀、Thermo Scientific Forma CO2恒溫恒濕培養箱 賽默飛世爾科技公司（美國）。

1.2 實驗方法

1.2.1 亞臨界水萃取薄荷黃酮 將干燥的薄荷全草粉碎成粉末，過60 目篩，石油醚脫脂，準確稱取5.0000 g 粉末，置于亞臨界反應釜，控制溫度、壓力、時間、液料比等進行提取，冷卻后離心，收集上清液，減壓濃縮至無水，加乙醇定容至100 mL，測定薄荷黃酮質量，計算薄荷黃酮得率[34]。

將上述提取液離心后將上清液置于分液漏斗內，取適量石油醚倒入分液漏斗并搖勻，靜置，取上清液，將上清液與二氯甲烷以及70%乙醇溶液于分液漏斗中搖勻，靜置，取下清液。將得到的下清液進行減壓蒸餾，直至無醇味，即可得到薄荷黃酮濃縮液。將薄荷黃酮濃縮液置于AB-8 型大孔吸附樹脂，加入解析液（30%乙醇溶液），吸附流速1.5 BV·h-1，洗脫30 h，以致洗脫平衡，得到薄荷黃酮純化液，減壓蒸餾，60 ℃下于真空干燥箱中進行干燥，得到薄荷黃酮干燥樣品，用于配制藥物溶液。

1.2.2 薄荷黃酮含量的測定 參考高丹丹等[25]的蘆丁標準曲線的繪制方法，經改良后用于測定本實驗的薄荷黃酮。量取2 mL 1.2.1 制備的薄荷黃酮提取液，加入1.0 mL 的5% NaNO2溶液，充分振蕩，搖勻靜置，再加入1.0 mL 的10% Al（NO3）3溶液，振蕩搖勻，然后加入6 mL 的4% NaOH 溶液，充分振蕩后，放置15 min 后于510 nm 處測定吸光度，以蘆丁為標準對照品，繪制蘆丁標準曲線，帶入回歸方程：Y=12.329X+0.002（R2=0.9997）。按公式（1）計算薄荷黃酮的得率。

式中：W 表示薄荷黃酮得率，%；C 表示黃酮提取液濃度，mg·mL-1；V 表示黃酮提取液體積，mL；m 表示薄荷原料質量，g。

1.2.3 亞臨界水提取薄荷黃酮的工藝優化

1.2.3.1 單因素實驗 稱取5.0000 g 粉末，在液料比20:1 mL/g、提取時間40 min、提取壓力2.5 MPa條件下，考察不同提取溫度（110、120、130、140、150、160 ℃）對薄荷黃酮得率的影響。

稱取5.0000 g 粉末，在液料比20:1、提取溫度140 ℃、提取壓力2.5 MPa 條件下，考察不同提取時間（10、20、30、40、50、60 min）對薄荷黃酮得率的影響。

稱取5.0000 g 粉末，在提取溫度140 ℃、提取時間40 min、提取壓力2.5 MPa 條件下，考察不同液料比（10:1、15:1、20:1、25:1、30:1、35:1）對薄荷黃酮得率的影響。

稱取5.0000 g 粉末，在提取溫度140 ℃、提取時間40 min、液料比20:1 mL/g 條件下，考察不同壓力（1、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 MPa）對薄荷黃酮得率的影響。

1.2.3.2 Box-Behnken 響應面優化試驗 根據單因素實驗，選取3 個對薄荷黃酮得率影響較大的因素：提取溫度（A）、提取時間（B）和液料比（C），各取三個水平，利用Box-Behnken 進行響應面優化試驗設計，詳見表1。

表1 響應面分析因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface analysis

1.2.4 不同提取方法提取薄荷黃酮

1.2.4.1 回流提取薄荷黃酮 精密稱取薄荷粉5.0000 g，加入75 mL 60%乙醇，于80 ℃下提取2 h，離心，上清液加乙醇定容至100 mL，參照1.2.2 測定薄荷黃酮質量，計算薄荷黃酮得率[24]。

1.2.4.2 超聲波輔助提取薄荷黃酮 精密稱取5.0000 g 薄荷粉置于試劑瓶中，分別加入100 mL 的50%乙醇溶液，60 ℃恒溫水浴1 h，超聲處理30 min，離心，上清液加乙醇定容至100 mL，參照1.2.2 測定薄荷黃酮質量，計算薄荷黃酮得率[25]。

1.2.4.3 超臨界CO2萃取薄荷黃酮 精密稱取5.0000 g 薄荷粉裝入萃取釜中，啟動冷循環，設定萃取溫度55 ℃，達到設定溫度后，打開鋼瓶閥門，開啟CO2泵，CO2經過濾后由壓縮機壓縮入萃取罐，達到萃取壓力25 MPa，加入50 mL 70%乙醇為夾帶劑進行超臨界萃取，90 min 后收集萃取物，離心，用乙醇溶解定容100 mL，參照1.2.2 測定薄荷黃酮質量，計算薄荷黃酮得率[26]。

1.2.5 薄荷黃酮對PC12 細胞氧化損傷的保護作用

1.2.5.1 PC12 細胞的培養與傳代 將復蘇后的PC12細胞放入加有專屬培養基的培養瓶中，放于37 ℃、5% CO2培養箱中培養48 h 后取出，PBS 緩沖液潤洗細胞，胰酶細胞消解液消化90 s，于顯微鏡下觀察細胞形態趨于圓形，取少量PC12 專屬培養基于培養瓶中終止消化，離心，置于顯微鏡下觀察，當細胞懸液至1×105細胞/mL 即可，將細胞懸液接種至96 孔板，置于CO2細胞恒溫培養箱孵育48 h，即可用于實驗。

1.2.5.2 藥物溶液的配制 精密稱取1.2.1 制備的薄荷黃酮干燥樣品（標記為MF），加入一定體積的DMSO 使之溶解，配成0.1 g·L-1的藥物儲備液，隨后進行等比例稀釋即可。

1.2.5.3 MTT 法測定細胞活力 在正常對照組、空白對照組以及給藥組每孔分別加入濃度為10 μL 10 mg·mL-1的MTT 溶液，放入CO2培養箱中培養4～6 h 產生結晶，吸走上清液，每孔加入150 μL 的DMSO 溶液，振蕩10 min，使結晶充分溶解，酶標儀測OD 值（490 nm 處），根據公式（2）計算細胞存活率[35]。

1.2.5.4 薄荷黃酮對PC12 細胞增殖的影響 待PC12 細胞長至96 孔板室底面積的80%后，棄原培養液，PBS 緩沖液洗兩次，正常對照組加入無血清的1640 培養基，空白對照組加入20 μL 的PBS 緩沖液，給藥組加入不同濃度的藥液20 μL，于CO2培養箱中培養24 h，采用上述MTT 法測定各組細胞活力[36]。

1.2.5.5 過氧化氫（H2O2）誘導PC12 細胞自由基損傷模型的建立及細胞活力的測定 待PC12 細胞長至96 孔板室底面積的80%后，棄原培養液，PBS 緩沖液洗兩次，加入濃度為0.2 mmol/L 含過氧化氫的1640 基礎培養基100 μL/孔，作用1 h，造成細胞自由基損傷[13]。棄原培養液，用PBS 緩沖液清洗，棄PBS 緩沖液，于給藥組、空白對照組、造模組以及正常對照組中每孔各加入1640 基礎培養基200 μL，置于CO2培養箱中培養24 h 后取出，采用上述MTT法測定各組細胞存活率。每組8 孔，實驗重復2 次。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

單因素實驗結果詳見圖1。由圖1A 可知，隨著提取溫度的升高，薄荷黃酮的得率逐漸增加，當溫度超過140 ℃后，得率快速下降。溫度升高，溶劑水的黏度和極性減小，此時水的性質接近于有機溶劑，使得室溫下不易溶于水的薄荷黃酮溶解度增大，同時溫度升高增加了黃酮分子擴散的運動速度。但溫度超過140 ℃后，高溫使黃酮類物質發生分解，一些非目標產物（蛋白質、多糖等）溶解度增加，此時水的承載能力和密度也會減小，使得率下降，這與Wan 等[36]相關的研究結果一致。因此，在后續的響應面試驗中提取溫度選擇140 ℃為宜。

圖1 不同因素對薄荷黃酮得率的影響Fig.1 Effects of different factors on the yield of mint flavonoids

提取時間對薄荷黃酮得率的影響如圖1B 所示，反應40 min 時，得率最大，達到10.32%±0.1850%。合理的提取時間使固液相充分接觸，此時溶劑水在高溫高壓下具有較強的溶解能力，能夠充分滲入到細胞中，有利于傳質過程。反應達到平衡后，過分延長提取時間，不會明顯增加溶質黃酮的量，反而可能導致非目標產物溶出量的增加。這與Nkurunzizaad 等[37]相關的研究結果一致。因此，在后續的響應面試驗中提取時間選擇40 min 為宜。

液料比對薄荷黃酮得率的影響如圖1C 所示，隨著液料比的增加，薄荷黃酮得率呈現先升高后降低的趨勢。當液料比為20:1 mL/g 時，得率最大，達到13.25%±0.2914%。液料比的增大有利于降低亞臨界水的黏度，同時有利于增大濃度梯度，但液料比過大會降低提取液中薄荷黃酮含量。這與冀恬等[38]的研究結果一致。因此，在后續的響應面試驗中液料比選擇20:1 mL/g 為宜。

壓力對薄荷黃酮得率的影響如圖1D 所示，隨著壓力的增加，薄荷黃酮得率的變化幅度不大，由此可知壓力對薄荷黃酮得率的影響較小。這可能是由于在提取過程中，壓力僅起到使水保持液態的作用，而對水的極性以及黏度等影響較小[32]。而壓力過高將導致物料顆粒堆積，不利于與溶劑的充分接觸，從而使薄荷黃酮得率略有下降，這與董興葉等[39]相關的研究結果一致。

2.2 Box-Behnken 響應面優化試驗結果

2.2.1 響應面回歸模型分析 利用Box-Behnken 進行的試驗設計與結果詳見表2。以得率為響應值，運用Design expert 10.0.7 數據分析軟件進行多元回歸擬合，得到二次多項回歸方程：Y得率=14.28+0.43A-0.32B+0.42C-0.47AB-0.03AC+0.08BC-1.28A2-1.04B2-1.14C2。

表2 Box-Behnken 試驗設計與結果Table 2 Design and results of Box-Behnken experiment

回歸模型的方差分析以及回歸系數顯著性試驗分析結果見表3。由表3 可知，該回歸模型F=36.62，P＜0.0001，說明該模型極具顯著性，具有統計學意義。其失擬項P=0.4974（P＞0.05）（不顯著），表示該模型不具有顯著的誤差，對實驗工藝能進行較好的模擬，實驗誤差小較可靠。同時模型回歸系數R2=0.9792，調節后的R2=0.9525，說明95.25%的響應值變化來源于模型自變量。可利用該回歸方程確定最佳提取工藝。一次項A 提取溫度、B 提取時間對得率具有極顯著影響（P＜0.01），C 液料比對得率具有顯著影響（P＜0.05），各因素的主效應關系為：A（F=20.76）＞C（F=19.93）＞B（F=11.7），即提取溫度＞液料比＞提取時間。其二次項交互作用AB 對得率具有極顯著的影響（P＜0.01）。

表3 Box-Behnken 試驗回歸模型方差分析Table 3 AVOVA of Box-Behnken experiment

2.2.2 響應面交互作用分析 A 提取溫度、B 提取時間和C 液料之間的相互作用詳見圖2。圖2（a）為A 提取溫度和B 提取時間的交互作用對得率的影響圖，觀察提取溫度和提取時間的響應曲面可知，響應面坡度陡峭，等高線密集且趨于橢圓。隨著提取時間的增加，得率呈先增加后降低的趨勢，當提取時間較少時，隨著提取溫度的增加，得率的坡度呈先增加后緩慢降低的趨勢，降低的幅度較小。當提取時間較高時，得率的變化坡度隨提取溫度的增加呈先增加后降低的趨勢，降低的幅度較大。由此說明，提取溫度和提取時間之間存在顯著的交互效應。僅考慮二者交互作用的條件下，當提取溫度為135～145 ℃水平左右、提取時間在35～45 min 水平范圍內時，得率達到最大值，且得率隨提取溫度的變化坡度大于提取時間，說明提取溫度對得率的影響大于提取時間，曲面圖與表3 中的結果也是相一致的。

圖2 各因素間交互作用對響應值的影響Fig.2 Effects of interaction between various factors on response values

A 提取溫度和C 液料比的交互作用對得率的影響如圖2（b）所示，觀察提取溫度和液料比的響應曲面可知，響應面坡度相對平緩，等高線稀疏且趨于圓形，說明提取溫度與液料比之間的交互作用對響應值的影響不顯著。此外，得率的變化坡度隨提取溫度、液料比的增加呈先增加后降低的趨勢。僅考慮二者交互作用的條件下，當提取溫度為135～145 ℃、液料比為17～23 mL/g 水平范圍內，得率達到最大值，且得率隨液料比的變化坡度大于提取溫度，說明液料比對得率的影響大于提取溫度，曲面圖與表3 中的結果是一致的。

B 提取時間和C 液料比的交互作用對得率的影響如圖2（c）所示，觀察提取時間和液料比的響應曲面可知，響應面坡度相對平緩，等高線稀疏且趨于圓形，說明提取時間與液料比之間的交互作用對響應值的影響不顯著。此外，得率的變化坡度隨液料比、提取時間的增加呈先增加后緩慢降低的趨勢。僅考慮二者交互作用的條件下，在提取時間為35～45 min、液料比為17～23 mL/g 水平范圍內，其得率取得最大值，且得率隨液料比的變化坡度大于提取時間，說明液料比對得率的影響大于提取時間。曲面圖與表3 中的結果也是一致的。

2.2.3 驗證試驗結果 根據回歸方程模型，得到最佳提取工藝條件：提取溫度142.019 ℃、提取時間38.047 min、液料比20.877:1 mL/g，此模型實驗條件下預測薄荷黃酮的得率為14.39%。為驗證此模型的結果，考慮到實驗的實際條件，將最佳工藝條件修正為提取溫度142 ℃、提取時間38 min、液料比21:1 mL/g，在此條件下經3 次平行試驗，得到薄荷黃酮得率為14.07%±0.23%，與模型的相對誤差在5%范圍內，說明實驗值與模型值之間具有良好的相關性，此模型可靠。

2.3 不同提取方法對比試驗結果

由于薄荷產地不同、采收期不同、提取部位不同等會對薄荷黃酮類化合物的含量產生影響，因此文獻中已報道的薄荷黃酮提取率差異較大，不利于提取方法的比較[40]。本文參照已報道的提取方法進行實驗驗證[24-26]，以水和不同濃度的乙醇為溶劑進行提取，平行實驗3 次，驗證結果如表4 所示。由表4 可知，亞臨界水萃取法的薄荷黃酮得率比回流提取法提高了334%，比超聲波輔助提取法提高了75%，比超臨界CO2萃取法提高了173%，顯著高于以上的3 種提取方法的得率（P＜0.001），說明該法具有高選擇、高得率的特點。亞臨界水萃取法所需提取時間僅有38 min，其他方法提取時間均在90 min 以上，提取時間的縮短可以減少能耗。同時，乙醇回流法和超聲輔助提取法均以乙醇為溶劑，超臨界CO2萃取法雖然以CO2為萃取劑，但在萃取過程中仍需添加乙醇作為夾帶劑進行萃取，因此以上三種提取方法均存在有機溶劑殘留、對人體以及環境不夠友好的問題。而亞臨界水萃取法是以純水為溶劑，在萃取過程中無需添加任何有機溶劑，因此不存在有機溶劑殘留，且綠色環保。水不僅資源豐富且價格低廉，大大降低了提取過程的成本。這些特點為薄荷黃酮實現工業化生產提供了極大地可行性。

表4 不同提取方法的比較Table 4 Comparison of different extraction methods

2.4 薄荷黃酮的體外神經保護活性

2.4.1 薄荷黃酮對PC12 細胞增殖的影響 如圖3所示，不同濃度的薄荷黃酮作用PC12 細胞24 h 后，與正常對照組比較，給藥組在1～100 μg/mL 范圍內的細胞存活率均在90%以上，說明薄荷黃酮在此濃度范圍內對細胞存活率沒有顯著影響[41]。

圖3 薄荷黃酮對細胞增殖的影響Fig.3 Effects of flavonoids from Mentha haplocalyx Briq.on cell proliferation

2.4.2 薄荷黃酮對H2O2誘導細胞自由基損傷的影響 由圖4 可知，與正常組相比，H2O2組的細胞存活率降至50.09%±1.03%，當PC12 細胞經薄荷黃酮（MF）溶液處理后，在1～5 μg/mL 濃度范圍內，細胞存活率有一定的提高，從53.61%±0.64%提高到58.57%±0.86%，說明薄荷黃酮溶液對PC12 細胞具有一定的保護作用，并且隨著薄荷黃酮溶液濃度的增大，細胞存活率逐漸提高，細胞氧化損傷程度明顯降低，當溶液濃度為100 μg/mL 時，細胞存活率提高至78.49%±0.84%。說明在1～100 μg/mL 濃度范圍內，薄荷黃酮能明顯緩解細胞氧化損傷，對PC12 細胞具有極顯著的保護作用（P＜0.01）。

圖4 薄荷黃酮（MF）對H2O2 損傷PC12 細胞活力的影響Fig.4 Effects on the viability of MF for PC12 cells injured by H2O2

3 結論

本文建立了一套綠色、高效、可靠的提取薄荷黃酮的提取工藝，以薄荷黃酮得率為考察指標，通過單因素實驗、響應面試驗對提取工藝進行優化，建立亞臨界水萃取薄荷黃酮最佳提取工藝，具體工藝參數為：提取溫度142 ℃、提取時間38 min、液料比21:1 mL/g，在此條件下得到薄荷黃酮得率為14.07%±0.23%。與已報道的提取方法比較，亞臨界水萃取薄荷黃酮得率比回流提取法提高了334%，比超聲波輔助提取法提高了75%，比超臨界CO2萃取法提高了173%，顯著高于以上3 種提取方法的得率（P＜0.001）。亞臨界水萃取法具有得率高、選擇性好、時間短、無污染、成本低廉等優勢。這些優勢為薄荷黃酮實現工業化生產提供了極大地可行性。體外建立H2O2誘導PC12 細胞損傷模型，在1～100 μg/mL 濃度范圍內，薄荷黃酮能明顯緩解細胞氧化損傷，對PC12 細胞具有極顯著的保護作用（P＜0.01）。該結果暗示薄荷黃酮可能是預防與治療神經退行性疾病的一個有前景的候選天然產物。

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