基于網絡藥理學探索延胡索治療血栓的潛在作用機制

黎毅 李浩玲 周濃 祁俊生 蔣雪梅 戚文華

摘 要：為探索延胡索治療血栓的潛在作用機制，檢索中藥系統藥理學數據庫（TCMSP），對延胡索藥效成分進行篩選，利用PubChem數據庫獲得藥效成分3D結構，并通過Pharmmapper數據庫篩選出各活性成分可能存在的靶點；通過CTD數據庫挖掘與血栓相關的作用靶點，利用STRING獲得與血栓相關的作用靶點的蛋白相互作用網絡，通過GO功能富集和KEGG通路分析延胡索干預血栓的分子機制。結果表明：從延胡索中共篩選出13個主要成分，預測出延胡索與血栓相關靶點238個，選出26個關鍵靶點。GO富集分析結果主要涉及各種功能蛋白的活性、調控等過程。KEGG通路富集得到4條通路，包括蛋白聚糖在癌癥中的應用、前列腺癌、膀胱癌以及丁酸代謝通路。綜上所述，延胡索發揮抗血栓作用可能通過多成分、多靶點起作用，為延胡索藥材質量標準的制訂和提升提供了參考。

關鍵詞：延胡索；血栓；作用機制；信號通路

中圖分類號：R93 文獻標志碼：A文章編號：1673-5072（2024）02-0142-08

隨著人們生活水平的提高及人口老齡化情況加劇，心血管疾病的發病率逐年升高，根據《中國心血管病報告2021》，2019年我國農村和城市心血管病均占死因的40%以上［1］。血栓是引發心血管疾病的重要原因之一，引發血栓的菲爾紹（Virchow）三要素有：靜脈血液瘀滯、靜脈系統內皮損傷和血液高凝狀態。血栓性疾病目前嚴重威脅人類的生命健康，其發病率高，老年人更易患病。近年來，中藥及其制劑逐漸應用于血栓性疾病，已有研究表明，丹參具有抗血小板聚集作用，其多種制劑可用于腦梗死、冠心病及心絞痛等心腦血管疾病［2］；紅花注射液對小鼠腦梗塞、大鼠“血瘀”癥狀有明顯治療作用［3］。李冰［4］通過建立大鼠體內的血栓模型發現，延胡索提取物可降低大鼠的全血比粘度，提高血液流變性，對大鼠的動-靜脈旁路所誘發形成的血栓有抑制作用；此外，延胡索對電刺激動脈形成的血栓有抑制作用［5］。

延胡索（Corydalis yanhusuo）為罌粟科（Papaveraceae）紫堇屬（Corydalis）植物，別名玄胡素、元胡、延胡、玄胡索、元胡索，其味辛苦，性溫，含多種異喹啉類生物堿，具有活血、行氣、止痛的功效。它是一味中醫常用的中藥藥材，沿用千年至今［6］，主要用于氣血瘀積所致的各種疼痛。近年來，延胡索已用于治療心力衰竭、冠心病、痛經等疾病，療效好、副作用小。李彩虹［7］利用人參延胡索湯對冠心病心絞痛患者進行對照治療，對照組給予西醫常規治療，治療組在對照組治療基礎上給予自擬中藥人參延胡索湯治療，對比結果表明，治療組總有效率明顯高于對照組。延胡索是臨床治療血栓性疾病的常用藥物之一，但其作用機制仍有待探究。

網絡藥理學通過對數據庫檢索分析，采用復雜網絡模型，從系統水平解釋藥物與機體靶點相互作用關系，其復雜性符合中藥多成分、多靶點的特點，是中醫藥現代研究的新熱點。本研究通過網絡藥理學方法初步研究延胡索干預血栓的主要活性成分和可能的靶點，探尋其作用的分子機制，對延胡索臨床應用提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 延胡索藥物活性成分的篩選

目前用于查詢中藥成分的數據庫較多，其中疾病-靶標網絡的藥理學平臺——中藥系統藥理數據庫TCMSP（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）是一個較為理想的綜合中藥平臺［8］，其中包含了499味中藥以及對應的超2.9萬個化學成分，數據豐富，可信度高。本研究通過TCMSP數據庫搜索草藥名“yanhusuo（延胡索）”，收集延胡索的藥效活性成分，根據成分的藥動學（吸收、分布、代謝、排泄（ADME））進一步篩選［9］，篩選條件為：口服生物利用度（Oral bioavailability，OB）≥30%、藥物相似性（Drug-likeness，DL）≥0.18和生物半衰期（Biological Half Life，HL）≥4，以獲取延胡索的主要藥效活性成分，通過PubChem Database（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）等化學成分數據庫檢索篩選延胡索化學成分的分子3D結構，以sdf格式保存，以此構建延胡索藥效成分的化合物結構數據庫。

1.2 應用軟件準備

Strawberry-perl-5.30.0.1-64bit，JAVA8.0，Cytoscape_v3.7.1，R×64 3.6.1，安裝路徑為C盤，不得出現中文和空格。

1.3 延胡索藥效成分靶點預測與疾病靶點查詢

利用Pharmmapper Server（http：//www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/submitfile.html）數據庫，根據化合物的3D結構預測延胡索潛在的化合物藥效靶點基因信息。使用CTD（http：//ctdbase.org/ about/）數據庫，以“Thrombosis”為關鍵詞進行查詢，獲得血栓性疾病過程中已知的靶蛋白。

1.4 延胡索干預血栓性疾病潛在作用靶點蛋白質相互作用網絡構建與分析

通過韋恩圖將延胡索的藥效成分靶點同血栓性疾病靶點取交集，獲得延胡索與血栓性疾病相關的化合物靶點并將其導入String（http：//string-db.org）數據庫，獲取蛋白質相互作用（PPI）網絡，下載并保存為tsv格式，以此構建延胡索潛在藥效作用靶點的蛋白相互作用網絡圖。

1.5 延胡索干預血栓性疾病成分-靶點的網絡構建

將篩選出的延胡索化合物信息以及靶點PPI網絡對應關系導入Cytoscape，構建延胡索治療血栓性疾病的成分-靶點網絡。對其風格（style）、節點（nodes）、線條（edges）等進行設置，構建延胡索干預血栓性疾病的成分-靶點網絡關系圖，并進行可視化分析。

1.6 GO和KEGG分析

為研究藥效團可能作用的生物學通路，探尋靶點間相互作用及基因功能的富集情況，對藥效團的各個靶點基因進行GO（Gene Ontology）功能富集分析和KEGG（Kyoto Encyclopedia of genes and genomes）生物學通路注釋分析。使用R3.6.1，載入相應的程序包，設置氣泡圖和柱狀圖的高、寬、顯示目錄以及P值等參數，獲得GO和KEGG可視化結果。

2 結果與分析

2.1 延胡索活性成分及相應靶蛋白的篩選

利用TCMSP檢索獲得延胡索藥效成分77個，符合篩選條件的主要藥效成分有26個，其中13個藥效成分的藥物相似性較高，在0.8以上（表1），說明這些成分藥動學性質較好，安全性較高，選取這些藥效成分進行藥物靶點預測。

2.2 藥物靶點預測

對延胡索篩選出的13個藥效成分在Pharmmapper數據庫中進行靶點預測并進行基因名稱的注釋，獲得了849個與人類有關的藥效靶點基因，去除重復項，剩余241個靶點。查詢CTD數據庫，獲得血栓相關靶點29 046個，通過Venny圖與藥效化合物靶點取交集，得到延胡索中與血栓相關的靶點有238個，占延胡索化合物靶點的98.76%，占血栓靶點的0.82%，延胡索化合物靶點中不參與血栓的延胡索化合物靶點僅有3個，占延胡索化合物靶點的1.43%，即RBM41、GSTT2B、ADRBK1（圖1）。

2.3 延胡索干預血栓靶點的蛋白質相互作用網絡構建

利用String數據庫篩選獲得238個靶點的PPI網絡，該相互作用網絡圖包含139個表示靶蛋白的節點和269條表示靶點間相互作用關系的線，各靶點間相互作用網絡較復雜（圖2）。進一步分析發現，延胡索干預血栓靶點的節點度大于均值（3.87），且介數中心性大于均值（0.038）的關鍵靶蛋白有26個，分別為RAC1、POLR2H、POLR2F、CCNA2、PCNA、CUL1、APP、B2M、NCBP1、CCND1、ESR1、CPSF3、DDB1、NOTCH1、HSP90AB1、HDAC7、HDAC6、ERBB2、NUP214、CAT、RAN、DLAT、HSD17B4、NAE1、EPHB2、AR。其中，靶蛋白RAC1的節點度和介數中心性均最大，表明RAC1可能在整個蛋白質網絡中作用很大。

2.4 成分-靶點網絡構建

成分-靶點網絡分析結果顯示（圖3）：該網絡共有150個表示化合物和靶點的節點，735條表示靶點之間以及靶點與化合物之間相互作用的線，473個藥效團與靶點之間的關系，262個靶點之間的相互作用關系。化合物與篩選出的靶點的聯系越密集，說明該化合物干預血栓的可能性越大。在該網絡圖中，排名前七位的化合物是紫堇醇靈堿（18797-79-0，節點度=40）、荷包牡丹堿（bicuculline，節點度=40）、二氫白屈菜紅堿（dihydrochelerythrine，節點度=40）、刺罌粟堿（stylopine，節點度=39）、黃連堿（coptisine，節點度=38）、偽原阿片堿（24240-05-9，節點度=37）、巖黃連堿（dehydrocavidine，節點度=37），說明這些藥效成分可能是延胡索起到治療血栓作用最關鍵的成分。

2.5 延胡索干預血栓靶點GO功能富集分析

將篩選出的延胡索可能干預血栓的238個靶點進行GO功能富集分析，得到共43個GO條目，排在前20位的GO可視化分析結果顯示（圖4）：延胡索治療血栓性疾病的生物學過程、分子功能較多，其中，熱休克蛋白Hsp90結合（Hsp90 protein binding），P值最小，是最為明顯的生物過程，該過程涉及8個作用靶標，分別為RPS3、UNC45A、USP19、CYP2E1、GBP1、HDAC6、HDAC8、KDR，這可能是延胡索治療血栓性疾病最重要的生物過程。此外，其他生物過程還包括類固醇激素受體活性（steroid hormone receptor activity）、受損DNA結合（damaged DNA binding）、細胞核受體活性（nuclear receptor activity）、轉錄因子活性（transcription factor activity）、細胞粘附分子結合（cell adhesion molecule binding）、酪氨酸蛋白激酶活性（protein tyrosine kinase activity）等，也是延胡索治療血栓性疾病可能較重要的生物過程，應該重視這些過程對血栓的影響。

2.6 延胡索干預血栓性疾病靶點KEGG通路富集分析

將238個靶點進行KEGG通路富集分析，預測出延胡索干預血栓的靶點通路較少，富集到4個KEGG通路（圖5），分別是蛋白聚糖在癌癥中的應用（Proteoglycans in cancer）、前列腺癌（Prostate cancer）、膀胱癌（Bladder cancer）以及丁酸代謝（Butanoate metabolism）通路，KEGG通路富集分析結果顯示，蛋白聚糖在癌癥中的應用是最明顯的通路，涉及15個作用靶標，分別是IGF1R、VAV3、PPP1CB、ARHGEF12、ESR1、FLNB、ARHGEF1、ERBB2、CCND1、MMP2、RAC1、MDM2、THBS1、MSN、KDR，這可能是延胡索治療血栓最重要的作用通路。蛋白聚糖在癌癥中的應用和前列腺癌通路富集圖如圖6、圖7所示。從圖6可看出，蛋白聚糖在癌癥中的應用通路可能涉及的靶點還有RAC1、cyclinD1、MP以及LARG等，與該通路聯系緊密的通路還有MAPK信號通路、鈣離子信號通路等。由圖7可見，前列腺癌通路涉及的靶點有GFR、AR、HSP、MDM2、CDK2以及CyclinD1等，與該通路聯系緊密的通路還有PI3K-Akt信號通路、p53信號通路等。因此，延胡索可能在前列腺癌及膀胱癌等癌癥通路中對血栓治療發揮作用。

3 討 論

3.1 延胡索干預血栓的主要靶點及藥效成分

本研究通過TCMSP篩選得到延胡索的13個主要活性成分，獲得延胡索干預血栓的238個靶點，735個可能存在的相互作用關系，說明延胡索在治療血栓性疾病上有一定生化聯系。延胡索的關鍵作用靶點主要有RAC1、POLR2H、POLR2F、CCNA2、PCNA、CUL1、APP、B2M、NCBP1、CCND1等，這些靶點在網絡中起的作用較大。其中CCNA2基因可以使心肌梗塞的豬心心臟組織再生，以及在心肌梗塞區域的周圍有出現新心肌細胞的跡象以及心臟泵血功能的顯著改善［10］。APP（急性期蛋白）在創傷、感染等引起應激時，有抑制多種水解酶的作用，在炎癥區域具有凝血和溶纖作用，延胡索通過對APP作用，可能對干預血栓形成有一定幫助。延胡索化合物-靶點網絡構建結果顯示，延胡索起到治療血栓性疾病作用最可能的成分包括紫堇醇靈堿、荷包牡丹堿、二氫白屈菜紅堿、刺罌粟堿、黃連堿、偽原阿片堿、巖黃連堿，這些成分對治療血栓性疾病的療效可能較大。其中紫堇醇靈堿可緩解高血壓心力衰竭［11］；荷包牡丹堿對抑制人肝癌MHCC97-H細胞的轉移及侵襲有顯著作用［12］，汪波［13］利用小鼠實驗發現荷包牡丹堿對小鼠有較好的抗心律失常活性。此外，刺罌粟堿存在抗炎活性，Velayutham等［14］發現刺罌粟堿具有調節血管內皮生長因子受體（VEGFR-2）的潛力，并能抑制骨肉瘤細胞；Jang等［15］研究表明，刺罌粟堿通過抑制一氧化氮合酶（iNOS）和環氧合酶-2（COX-2）表達來抑制巨噬細胞中的一氧化氮和前列腺素E2（PGE2）產生。

3.2 延胡索干預血栓靶點功能分析

GO結果顯示，延胡索治療血栓性疾病靶點的功能主要體現在熱休克蛋白Hsp90的結合、類固醇激素受體活性、受損DNA結合、細胞核受體活性、轉錄因子活性等，這些功能主要涉及有關基因的轉錄、翻譯以及有關蛋白的活性，其中熱休克蛋白Hsp90的結合是最為明顯的生物過程，涉及8個作用靶標。KEGG結果則涉及蛋白聚糖在癌癥中的應用、前列腺癌等4個通路。有研究表明，腫瘤可導致血液的高凝，引發血栓，所以延胡索可能不僅對于治療癌癥有一定功效，在治療血栓方面也可能有作用。在蛋白聚糖在癌癥中的應用通路中，通路下游的多個蛋白如RAC1、CyclinD1、MP、LARG等可能直接或間接作用于細胞的增殖和存活，促進血管內皮細胞的增生和在內皮化，從而促進有血栓的血管愈合，這對于延胡索治療血栓性疾病提供了依據。此外，下游RTKs（受體酪氨酸激酶）可以間接性地抑制腫瘤血管生成，Moesin（膜突蛋白）可間接作用于腫瘤細胞轉移和侵襲。腫瘤形成是引發血栓的重要原因之一，有研究表明，血栓常作為隱性癌的臨床表現［16］，因此延胡索可能通過抑制癌癥的通路中的相關基因或靶點治療血栓性疾病。在前列腺癌通路中，GFR（表皮生長因子）作為其下游分子，可介導PI3K-Akt信號通路和MAPK通路。PI3K-Akt信號通路主要與細胞生長和凋亡密切相關［17］，參與血小板的粘附聚集等過程，使纖維蛋白發生聚集［18］。PI3K-Akt信號通路可通過減少mPTP釋放，在線粒體水平上發揮心肌保護作用，從而達到治療心力衰竭的作用［19］，為治療血栓性疾病提供了思路。由圖6可知，MDM2基因可間接地抑制細胞凋亡，此外，楊娟［20］通過大鼠電刺激模型實驗發現延胡索乙素可有效減少動脈血栓形成、增加動脈血流量，同時對其抗血栓機制深入研究，發現其作用機制與拮抗損傷后的血管內皮細胞凋亡和抑制組織因子表達有關，所以蛋白聚糖在癌癥中的應用通路對治療血栓性疾病可能有一定療效。

3.3 延胡索在治療血栓性疾病中的常見案例

在現代各種疾病中，常見的臨床血栓性疾病多種多樣，如動脈粥樣硬化、腦血栓形成、冠心病、心絞痛、心肌梗死、血栓性閉塞性脈管炎、風濕性心臟病、心力衰竭以及心律失常等。血栓形成有三個關鍵因素為炎癥反應、血管生成和纖維蛋白聚集。延胡索主要成分為生物堿、甾體、有機酸和糖類［21］。有研究表明，延胡索有增加血液流通，緩解大鼠心力衰竭的功效［22］，陳岑［23］通過實驗發現延胡索具有顯著的抗血小板聚集作用。此外，臨床上延胡索對冠心病有較高的療效［24］。何四琴［25］發現，在缺血性心律失常患者中應用復方延胡索湯劑與美托洛爾聯合治療療效顯著，可加速患者心率變異性指標及臨床癥狀改善，增強心肌功能，且不會導致不良心臟事件，安全性高。由此可見，延胡索在治療血栓性疾病（如冠心病、心絞痛等）方面有重要作用。

4 結束語

以上研究分析可知，延胡索藥物介導血栓性疾病的治療機制具有復雜性、多樣性，不能從單一角度進行研究，通過對其復雜網絡的分析，可從中找出多個干預血栓性疾病的靶點、功能和通路，在此基礎上可探索多樣化的治療方法。在中醫治療血栓疾病過程中，醫生常常運用復方制劑以及多種藥物聯合用藥以增強用藥效果，本研究僅對延胡索這一種藥物內的多種藥效成分進行研究，發現其對血栓性疾病的作用機制主要是通過介導炎癥反應、抑制細胞凋亡、介導免疫途徑及抑制癌癥等方式發揮療效。本研究主要預測了延胡索抗血栓的可能機制，僅為后續藥物復方制劑的配伍機制研究提供參考，但藥物在體內可能還受到機體自身以及其他因素影響，因此后期還需進行體外實驗對本研究的預測結果進行驗證。

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Potential Action Mechanism of Corydalis yanhusuoin the Treatment of Thrombus Based on Network Pharmacology

Abstract：The pharmacodynamic components of Corydalis yanhusuo are screened by searching the TCM Systematic Pharmacology Database（TCMSP） in order to explore the potential action mechanism of C.yanhusuo in the treatment of thrombus.PubChem database is employed to obtain the 3D structure of pharmacodynamic components and Pharmmapper database is utilized to screen out the potential targets of each active component.The target associated with thrombus is mined through CTD database and the protein interaction network （PPI） of the target associated with thrombus is obtained by STRING.The molecular mechanism of C.yanhusuo in intervention of thrombus is analyzed by GO functional enrichment and KEGG pathway.The results show that a total of 13 main components are screened from C.yanhusuo and 238 targets related to thrombus are predicted，including 26 key targets screened.The results of GO enrichment analysis have mainly involved the activity and regulation of various functional proteins.KEGG pathway is enriched to obtain 4 pathways，including the application of proteoglycans in cancer，prostate cancer，bladder cancer and butanoate metabolic pathways.In conclusion，the antithrombotic effect of C.yanhusuo may be achieved through multi-components and multi-targets，providing references for the formulation and improvement of the quality standard of C.yanhusuo.

Keywords：Corydalis yanhusuo；thrombus；action mechanism；signaling pathway