基于多鏈結(jié)構(gòu)的CD30 CAR-T細(xì)胞的抗腫瘤作用研究

宋羽佳,汪 晨,王恩秀,汪 波

霍奇金淋巴瘤主要來(lái)源于B細(xì)胞譜系,包括兩種亞型,經(jīng)典型霍奇金淋巴瘤和結(jié)節(jié)性淋巴細(xì)胞為主的霍奇金淋巴瘤?；羝娼鹆馨土鍪且环N罕見(jiàn)的淋巴瘤,經(jīng)典型霍奇金淋巴瘤占所有霍奇金淋巴瘤病例的近95%[1]。霍奇金淋巴瘤具有雙峰年齡分布,峰值分別在20～30歲和50～70歲,偶爾會(huì)發(fā)生在≥75歲的患者中[2]。靶向CD30的抗體偶聯(lián)藥物本妥昔單抗治療霍奇金淋巴瘤的客觀緩解率能達(dá)到75%,完全緩解率為34%[3]。然而,抗體療法受限于體內(nèi)分布,臨床獲益是短暫的,因此必須探索其他方法。過(guò)繼性細(xì)胞療法是治療癌癥的一種策略,近年來(lái)展示出極大的應(yīng)用前景[4-5]。對(duì)于霍奇金淋巴瘤,CD30是作為CAR-T細(xì)胞治療靶點(diǎn)的極好候選者,因?yàn)槠湓诨羝娼鹆馨土瞿[瘤細(xì)胞上的豐富和特異性表達(dá),但在正常組織上的表達(dá)有限[6-8]。因此,該研究基于DAP12的多鏈嵌合抗原受體開(kāi)發(fā)靶向CD30 CAR-T,研究CD30 CAR-T對(duì)霍奇金淋巴瘤腫瘤細(xì)胞的體外和體內(nèi)臨床前藥效。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1細(xì)胞及質(zhì)粒 HEK-293T細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)細(xì)胞培養(yǎng)物收藏中心,由南京卡提醫(yī)學(xué)科技有限公司保存。L428人霍奇金淋巴瘤細(xì)胞保存于南京卡提醫(yī)學(xué)科技有限公司。T細(xì)胞來(lái)源于健康志愿者外周血。慢病毒表達(dá)載體包裝質(zhì)粒 pMDLg/PRRE、pRSV-Rev、pMD2.G購(gòu)自湖南豐暉生物科技有限公司。JM109感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自上海唯地生物技術(shù)有限公司。

1.1.2主要試劑 T4 DNA連接酶和限制性內(nèi)切酶購(gòu)自NEB(北京)有限公司,中提質(zhì)粒抽提試劑盒購(gòu)自南京諾維贊生物科技有限公司,PEI轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司,Ficoll分離液購(gòu)自 GE公司;T細(xì)胞分選試劑盒(EasySepTMHuman T Cell Isolation Kit)購(gòu)自STEMCELL Technologies;T細(xì)胞激活試劑(CD3/CD28 Dynabeads)、Optmizer培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)購(gòu)自Gibco公司,X-VIVO 15培養(yǎng)基購(gòu)自LONZA公司;人白介素-2(interleukin-2,IL-2)和干擾素-γ(interferon-γ,IFN-γ)細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒購(gòu)自R&DSystems公司,無(wú)血清細(xì)胞凍存液CS10購(gòu)自BioLife公司?？谷薈D3抗體(FITC)、抗人CD3抗體(APC-Cy7)、鏈霉親和素(PE)、鏈霉親和素(APC)和抗人CD30 antibody(APC)均購(gòu)自BD公司;Biotinylated Human CD30蛋白購(gòu)自 Acro Biosystems公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1腫瘤細(xì)胞培養(yǎng) L428細(xì)胞為人經(jīng)典型霍奇金淋巴瘤細(xì)胞,用含有滅活的10%FBS、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每隔2～3 d待細(xì)胞長(zhǎng)滿后分瓶傳代,將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的腫瘤細(xì)胞用于體內(nèi)腫瘤的接種。

1.2.2CAR慢病毒表達(dá)載體構(gòu)建及包裝 CD30 scFv委托上海生工生物工程有限公司合成含有CD30 scFv的DNA片段。CD30 scFv基因序列通過(guò)雙酶切將CD30 scFv片段插入CAR慢病毒骨架載體(KIRS2/DAP12-BB和BBζ)中構(gòu)建CD30-KIRS2/Dap12-BB 和CD30-41BBζ慢病毒表達(dá)載體,選取篩選得到的陽(yáng)性克隆細(xì)菌進(jìn)行搖菌并且抽提質(zhì)粒小提。質(zhì)粒送上海生工進(jìn)行測(cè)序。選擇測(cè)序結(jié)果正確的克隆進(jìn)行搖菌,用去內(nèi)毒素的質(zhì)粒大提試劑盒提取質(zhì)粒。采用第三代慢病毒包裝系統(tǒng)進(jìn)行病毒包裝:將293T細(xì)胞培養(yǎng)于T150 培養(yǎng)瓶中,5%CO2、37 ℃培養(yǎng),每48 h進(jìn)行換液傳代及規(guī)模放大,最終放大至8個(gè)T150方瓶。待匯合度達(dá)到 80%～90%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染;將CAR質(zhì)粒和3個(gè)包裝質(zhì)粒,通過(guò)PEI轉(zhuǎn)染,每個(gè)T150瓶需要添加10.9 μg pMDLg/PRRE、5.5 μg pRSV-Rev、5.5 μg pMD2.G、21.8 μg CAR質(zhì)粒。PEI轉(zhuǎn)染6 h換液,24 h第一次收集慢病毒懸液保存至4 ℃冰箱,48 h第2次收集慢病毒懸液,與第1次收集到的慢病毒懸液合并,用0.45 μm 的濾膜過(guò)濾去除細(xì)胞碎片,4 ℃、12 000～24 000 r/min離心過(guò)夜,離心后,傾倒全部上清液,每管加入 200 μl X-vivo15培養(yǎng)基重懸,進(jìn)行病毒分裝,迅速存放于-80 ℃冰箱備用。

1.2.3CAR-T細(xì)胞的制備和鑒定 通過(guò)淋巴細(xì)胞分離液提取外周血單個(gè)核細(xì)胞,磁珠分選CD3+T細(xì)胞。加入完全培養(yǎng)基(optmizer培養(yǎng)基+10%人AB血清+100 IU/ml IL-2+2 mmol/L Glutamax+Supplement)重懸,按數(shù)量比3 ∶1加入CD3/CD28刺激磁珠。24 h后,取所需量的T細(xì)胞,以感染復(fù)數(shù)MOI=3將T細(xì)胞與慢病毒混合鋪入合適的培養(yǎng)容器中,未轉(zhuǎn)導(dǎo)(not transduced,NTD)組不加入慢病毒,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。每隔1～2 d傳代補(bǔ)液一次,培養(yǎng)至細(xì)胞處于靜息狀態(tài),去除CD3/CD28磁珠后,將細(xì)胞凍存于液氮中,用于后續(xù)細(xì)胞功能分析。制備的 CAR-T 細(xì)胞分別命名CD30-KIRS2/Dap12-BB組和CD30-41BBζ組,未做病毒侵染的T細(xì)胞命名為NTD組。

1.2.4CAR-T 細(xì)胞體外殺傷能力的檢測(cè) 用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)L428,收集細(xì)胞,1×104細(xì)胞/孔接種于96孔板中,按照效靶比(E ∶T)為0 ∶1、1 ∶1、5 ∶1、10 ∶1將CAR-T細(xì)胞加入到靶細(xì)胞中,以NTD作為陰性對(duì)照,置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h,根據(jù)乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)檢測(cè)CAR-T細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞殺傷作用。

1.2.5CAR-T細(xì)胞因子分泌試驗(yàn) 靶細(xì)胞培養(yǎng):L428用含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),37 ℃、5% CO2進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞因子釋放試驗(yàn)在96孔板上通過(guò)共培養(yǎng)靶細(xì)胞與CAR-T共培養(yǎng)進(jìn)行,E ∶T為2 ∶1,靶細(xì)胞接種1×104細(xì)胞/孔,共培養(yǎng)培養(yǎng)基為200 μl 含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基。共培養(yǎng)24 h后,參考IFN-γ的ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū),檢測(cè)上清液中IFN-γ含量。

1.2.6實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及倫理 實(shí)驗(yàn)所用動(dòng)物的種屬為 Mus Musculus,品系為 NCG,6～8周齡,性別為雌性。動(dòng)物級(jí)別為 SPF級(jí),體質(zhì)量18～22 g,由江蘇集萃藥康生物科技有限公司提供。動(dòng)物試驗(yàn)設(shè)計(jì)和實(shí)施符合赫爾辛基宣言、醫(yī)學(xué)倫理道德標(biāo)準(zhǔn)及我國(guó)的法律法規(guī),并得到中山大學(xué)附屬第七醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。許可證號(hào):SCXK(蘇)2023-0009。

1.2.7腫瘤細(xì)胞的接種、分組及給藥方案 將PBS重懸的L428腫瘤細(xì)胞接種于小鼠右側(cè)脅肋部皮下,5×105細(xì)胞/只,在腫瘤細(xì)胞注射接種20 d后,根據(jù)荷瘤小鼠腫瘤體積將其隨機(jī)分為3組(NTD組、CD30-KIRS2/Dap12-BB組和CD30-41BBζ組)進(jìn)行治療(當(dāng)天記為分組后0 d, D0),給藥途徑采用尾靜脈給藥,每組5只。

2 結(jié)果

2.1 CAR表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建及驗(yàn)證通過(guò)上海生工生物工程有限公司全基因合成CD30 scFv,在實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有載體pWC032和pKT004的基礎(chǔ)上,通過(guò)酶切連接的方法,分別構(gòu)建CD30-KIRS2/Dap12-BB CAR質(zhì)粒和CD30-BBζ CAR質(zhì)粒,對(duì)CAR質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定,CD30-KIRS2/Dap12-BB CAR質(zhì)粒條帶約為756 bp和8 583 bp,CD30-41BBζ CAR質(zhì)粒條帶約為756 bp和8 449 bp。載體示意圖及酶切鑒定結(jié)果如圖1所示,兩個(gè)CAR質(zhì)粒條帶大小均正確。

圖1 CAR質(zhì)粒酶切電泳圖

2.2 CAR慢病毒及CAR-T 細(xì)胞制備將CAR表達(dá)質(zhì)粒與包裝質(zhì)粒用PEI轉(zhuǎn)染 293T 細(xì)胞進(jìn)行慢病毒包裝,經(jīng)超速離心濃縮后,CD30-KIRS2/Dap12-BB CAR慢病毒和CD30-41BBζ CAR慢病毒滴度分別為 2.7×107TU/ml 和 4.6×107TU/ml。T 細(xì)胞激活 24 h后,以 MOI=3加入慢病毒進(jìn)行感染,在細(xì)胞收獲凍存時(shí)檢測(cè)CAR陽(yáng)性率,兩種CD30 CAR結(jié)構(gòu)示意圖見(jiàn)圖2A,結(jié)果表明兩種CD30 CAR-T細(xì)胞均能較好表達(dá)CAR分子,CAR表達(dá)都在50%以上(圖2B)。

圖2 CAR結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)及表達(dá)

2.3 基于多鏈結(jié)構(gòu)的CD30 CAR-T細(xì)胞體外功能測(cè)試為了檢測(cè)CD30 CAR-T細(xì)胞的殺傷活性,本研究采用L428作為抗原陽(yáng)性的靶細(xì)胞,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明L428高表達(dá)CD30抗原(圖3A)。

圖3 腫瘤細(xì)胞抗原表達(dá)及靶向CD30 CAR-T體外功能分析

細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明兩種CD30 CAR-T細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞均有顯著的殺傷作用,其中CD30-KIRS2/Dap12-BB組殺傷作用優(yōu)于CD30-41BBζ組(圖3B)。NTD組沒(méi)有展現(xiàn)出特異性殺傷作用,表明兩種CD30 CAR-T是依賴CD30抗原的特異性殺傷作用,CD30-KIRS2/Dap12-BB組抗腫瘤效果更好。

CAR-T與靶細(xì)胞共培養(yǎng)的細(xì)胞因子分泌實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,CD30-KIRS2/Dap12-BB組分泌IFN-γ能力最強(qiáng),CD30-41BBζ組分泌IFN-γ能力稍弱于CD30-KIRS2/Dap12-BB組,兩種CD30 CAR-T與抗原陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)均能產(chǎn)生顯著的響應(yīng)作用(圖3C)。

2.4 基于多鏈結(jié)構(gòu)的CD30 CAR-T細(xì)胞體內(nèi)抗腫瘤作用為了研究CD30-KIRS2/Dap12-BB CAR-T的體內(nèi)抗腫瘤活性,本研究用L428細(xì)胞建立了NCG小鼠皮下移植瘤模型。20 d后,待腫瘤體積大小達(dá)到50 mm3時(shí),將荷瘤小鼠隨機(jī)分為3組,并且尾靜脈注射細(xì)胞進(jìn)行治療。結(jié)果表明,CD30-KIRS2/Dap12-BB組和CD30-41BBζ組可以迅速實(shí)現(xiàn)腫瘤消退,而NTD組沒(méi)有產(chǎn)生腫瘤抑制作用。結(jié)果表明CD30-KIRS2/Dap12-BB抗腫瘤效果更持久,具備強(qiáng)大的靶向CD30的抗腫瘤活性(圖4)。

圖4 小鼠腫瘤體積變化情況(n=5)

3 討論

霍奇金淋巴瘤是一種影響跨越兒童和成人人群的惡性淋巴瘤。雖然大多數(shù)霍奇金淋巴瘤患者通過(guò)一線治療治愈,但約15%的患者要么是原發(fā)難治性疾病,要么是在最初治療有反應(yīng)后復(fù)發(fā)[9]。CAR-T細(xì)胞是治療復(fù)發(fā)或難治性血液系統(tǒng)惡性腫瘤(包括淋巴瘤)的一種具有前景的新療法[10-12]。CD30是一個(gè)高特異性的靶點(diǎn),因?yàn)樗趲缀跛械慕?jīng)典霍奇金淋巴瘤、間變性大細(xì)胞淋巴瘤以及其他部分淋巴瘤類(lèi)型(包括皮膚T細(xì)胞淋巴瘤和彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤)中普遍表達(dá)[13]。傳統(tǒng)的CAR結(jié)構(gòu)體系普遍采用的是單鏈嵌合分子結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì),主要結(jié)構(gòu)包括抗原結(jié)合區(qū)、鉸鏈區(qū)、跨膜區(qū)和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)區(qū)[14],然而在生理狀態(tài)下細(xì)胞的免疫受體通常是以多鏈復(fù)合物的結(jié)構(gòu)存在,例如包括配體結(jié)合鏈和免疫酪氨酸活化序列[15]。

本項(xiàng)目組根據(jù)免疫受體的這一生理特性設(shè)計(jì)了獨(dú)特的多鏈CAR結(jié)構(gòu)體系,以殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體(KIR)和DAP12為基礎(chǔ)的多鏈體系。該CAR結(jié)構(gòu)優(yōu)點(diǎn)在于允許所有相關(guān)信號(hào)結(jié)構(gòu)域位于細(xì)胞膜附近[16]。從研究結(jié)果可以看出,CD30-KIRS2/Dap12-BB CAR-T細(xì)胞與CD30-41BBζ組對(duì)L428細(xì)胞體外殺瘤效應(yīng)相當(dāng)。ELISA法檢測(cè)IFN-γ分泌水平結(jié)果顯示,在L428腫瘤細(xì)胞刺激下CD30-KIRS2/Dap12-BB組較CD30-41BBζ組IFN-γ分泌水平顯著提高。分別將兩種CD30 CAR-T治療NCG小鼠皮下移植瘤模型,結(jié)果顯示CD30-KIRS2/Dap12-BB組能夠?qū)崿F(xiàn)腫瘤完全消退且100 d內(nèi)腫瘤沒(méi)有復(fù)發(fā)。結(jié)果表明CD30-KIRS2/Dap12-BB組抗腫瘤效果更持久,具備強(qiáng)大的靶向CD30的抗腫瘤活性。

本研究從體外殺傷、細(xì)胞因子分泌以及體內(nèi)藥效等多個(gè)方面證明了多鏈CAR-T在抗腫瘤藥效活性方面優(yōu)于傳統(tǒng)二代CAR-T。盡管如此,CAR-T的臨床治療在開(kāi)發(fā)高效抗腫瘤候選藥物的同時(shí)需要考慮到臨床的安全性,高抗腫瘤活性可能帶來(lái)更大的臨床毒副作用(如細(xì)胞因子釋放綜合征等),多鏈CAR-T雖然在臨床前藥效評(píng)估中具有一定的優(yōu)勢(shì),但細(xì)胞因子分泌水平更高可能會(huì)給臨床的副作用處理帶來(lái)更大的挑戰(zhàn)。