非諾多泮抑制小鼠胸主動脈瘤的實驗研究

周 瑩,武栗妃,3,杜文靜,曹濟民

胸主動脈瘤(thoracic aortic aneurysm, TAA)為胸主動脈直徑是正常動脈直徑的1.5倍以上,與基質降解、彈力板斷裂、平滑肌表型轉換、炎癥浸潤等密切相關[1]。TAA易并發(fā)破裂,死亡率極高,目前無有效藥物[2],因此尋找治療TAA的藥物迫在眉睫。

多巴胺受體根據其生物活性和藥理學性質可以分為一型受體和二型受體,一型受體包括多巴胺受體1(dopamine receptor D1, D1DR)和多巴胺受體5(dopamine receptor D5, D5DR);二型受體包括多巴胺受體2(dopamine receptor D2, D2DR)、多巴胺受體3(dopamine receptor D3, D3DR)和多巴胺受體4(dopamine receptor D4, D4DR)[3]。有研究顯示激活多巴胺一型受體可通過其下游的環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)抑制NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3(NOD-, LRR- and pyrin domain-containing protein 3, NLRP3)炎癥小體的活化,從而抑制炎癥反應[3-4];直接抑制NLRP3也可減輕主動脈瘤[5-6]。此外,激動多巴胺一型受體也可以抑制平滑肌細胞的增殖[7]。因此,激活多巴胺一型受體可能在TAA中具有保護作用。該研究采用多巴胺一型受體激動劑非諾多泮(fenoldopam, FNDP)探究其在TAA中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物雄性3周齡C57BL/6J小鼠25只,體質量9～10 g,購自山西醫(yī)科大學實驗動物中心[SCXK(晉)2019-0004]。小鼠購買后常規(guī)飼養(yǎng)3 d后開始正式實驗(飼養(yǎng)環(huán)境為SPF級)。在實驗過程中,遵循3R原則的指導,給予實驗動物以人道主義關懷,倫理批準編號為SYDL2023020。

1.2 主要試劑FNDP(SML0198)和β-氨基丙腈(β-aminopropionitrile,BAPN)(A3134)購自美國Sigma公司;抗白細胞分化抗原68(cluster of differentiation 68,CD68)單克隆抗體(ab283654)、抗基質金屬酶2(matrix metallopeptidase 2, MMP2)單克隆抗體(ab86607)和抗基質金屬酶9(matrix metallopeptidase 9,MMP9)單克隆抗體(ab228402)購自美國Abcam公司;兔超敏二步法試劑盒(PV9001)及DAB顯色試劑盒(ZLI-9019)購自北京中杉金橋生物技術有限公司; 彈力蛋白(Elastin)染色試劑盒購自福州邁新生物技術開發(fā)有限公司;明膠酶譜電泳試劑盒購自南京信帆生物技術有限公司;TRIzol 購自美國Ambion公司;RNA反轉錄試劑盒購自日本Takara公司;熒光定量試劑盒購自中國聚合美生物科技有限公司;RNA引物購自上海生工生物工程技術服務有限公司;PCR儀購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 小鼠分組及TAA模型的建立將25只小鼠分為三組:對照組(n=5),飲用無菌水;BAPN組(n=10),飲用含有BAPN[1.0 g/(kg·d)]的無菌水;BAPN + FNDP組(n=10),在飲用含有BAPN[1.0 g/(kg·d)]的無菌水基礎上,第14天開始每隔1 d腹腔注射FNDP(10 mg/ kg),共注射7次;對照組和BAPN組注射等體積的生理鹽水。

1.4 胸主動脈組織取材及處理28 d造模結束后,用3%異氟烷對小鼠進行麻醉,打開胸腔,從心尖部灌注生理鹽水將心腔及主動脈內血液沖洗掉,將心臟及主動脈及連通的腎臟取下進行拍照;然后將胸主動脈用4%多聚甲醛固定,逐級乙醇脫水,二甲苯透明,石蠟包埋,切片,并將切片貼敷于載玻片上。

1.5 Elastin染色對制備好的石蠟切片進行烤片(65 ℃,2 h)、二甲苯脫蠟、梯度乙醇復水、PBS清洗,再用碘液孵育切片5 min,PBS清洗;將硫代硫酸鈉溶液滴于切片上,5 min后用流水沖洗;用醛品紅染色2 min后再用水洗;用碘橙黃G染液滴染后,水洗,二甲苯透明,中性樹脂封片,拍照。

1.6 免疫組化染色烘烤組織切片(65 ℃,2 h),然后脫蠟、復水、蒸餾水清洗;將切片置于100 ℃的1×檸檬酸鈉溶液中20 min進行抗原修復;用無菌水清洗切片,再用內源性過氧化酶抑制劑室溫孵育切片20 min,無菌水清洗,用血清室溫封閉切片20 min,甩干,滴加一抗抗體,4 ℃濕盒過夜;次日將切片在室溫下平衡30 min,PBS清洗;滴加辣根過氧化酶標記二抗抗體,室溫孵育30 min,PBS清洗;DAB顯色;之后進行蘇木精染色,鹽酸分化、脫水、透明、封片。

1.7 明膠酶譜用明膠酶譜法測定血清中的MMP2和MMP9的活性。收集小鼠血液,離心(1 000 r/min,10 min),獲得上層血清。采用非還原上樣緩沖液對血清進行制樣,在含有0.2%明膠的分離膠和濃縮膠中進行電泳;膠體用A液室溫搖床孵育48 h;B液37 ℃孵育5 h;考馬斯亮藍染色,脫色液脫色直到條帶清晰,之后采圖。

1.8 RT-PCR將獲取的小鼠胸主動脈組織用TRIzol方法提取總RNA,按照反轉錄試劑盒方法將mRNA反轉錄為cDNA,之后用熒光定量PCR試劑盒進行cDNA擴增。所用引物序列見表1。

表1 引物序列

1.9 統(tǒng)計學處理應用GraphPad Prism 9.0統(tǒng)計軟件對數據進行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布的數據以均數±標準差表示,兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗,多組間比較采用方差分析;P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 TAA中多巴胺受體轉錄水平的變化與對照組相比,給予BAPN 28 d后,小鼠胸主動脈形成瘤體,Elastin染色可見胸主動脈彈力纖維出現(xiàn)紊亂,見圖1A、1B,提示造模成功。與對照組相比,BAPN組的D1DR、D5DR及D3DR的mRNA表達水平顯著降低(D1DR:P<0.05; D5DR:P<0.01; D3DR:P<0.01);但D2DR的mRNA表達水平顯著升高 (P<0.01),見圖1C-1F。

2.2 FNDP對小鼠TAA進展的抑制作用與對照組相比,BAPN組小鼠胸主動脈肉眼可見膨大,見圖2A箭頭所示,而BAPN+ FNDP組小鼠的胸主動脈膨大程度較BAPN組小鼠明顯減輕,見圖2A。BAPN組10只小鼠有7只形成動脈瘤,TAA發(fā)生率為70%,7只發(fā)生死亡,其中3只因動脈瘤破裂而死亡,破裂率為30%;而在BAPN+FNDP組,10只小鼠僅有3只形成動脈瘤,TAA發(fā)生率為30%,且僅有2只死亡,其中1只因動脈瘤破裂發(fā)生死亡,破裂率為10%。對照組5只小鼠全部存活,且血管形態(tài)無異常,見圖2B、2C。與BAPN組相比,BAPN+FNDP組小鼠生存率顯著增高(P<0.01),見圖2C。提示FNDP具有抑制TAA進展、降低TAA發(fā)生率和提高TAA生存率的作用。

圖2 FNDP對小鼠TAA進展的抑制作用

2.3 FNDP對彈力纖維斷裂和基質降解的改善作用彈力纖維染色結果顯示,與BAPN組小鼠相比,BAPN+FNDP組小鼠的胸主動脈彈力纖維紊亂情況明顯減輕,見圖3A。免疫組化結果顯示,各組小鼠胸主動脈組織內的MMP2(圖3B、3D)和MMP9(圖3C、3D)的陽性信號差異有統(tǒng)計學意義(MMP2:F=26.958 0,P<0.01;MMP9:F=21.041 4,P<0.01)。與對照組相比,BAPN組MMP2和MMP9表達增加(MMP2:P<0.01;MMP9:P<0.01);而相對于BAPN組,BAPN+FNDP組的MMP2和MMP9表達減少(MMP2:P<0.01;MMP9:P<0.01)。小鼠血清中的MMP2的活性檢測結果顯示,BAPN+FNDP組血清MMP2的活性顯著低于BAPN組(P<0.05),但血清MMP9(圖3E、3F)活性無顯著差異(P=0.147 5)。

圖3 FNDP對彈力纖維斷裂和基質降解的改善作用

2.4 FNDP對巨噬細胞浸潤和炎癥因子表達的抑制作用免疫組化結果顯示,各組小鼠動脈組織中巨噬細胞標志物CD68的表達(圖4A、4B)差異有統(tǒng)計學意義(F=43.3171,P<0.01)。相比于對照組,BAPN組CD68表達增加(P<0.01);而相較于BAPN組,BAPN+FNDP組CD68表達明顯降低(P<0.01)。

圖4 FNDP對巨噬細胞浸潤和炎癥因子表達的抑制作用

RT-PCR結果顯示,各組小鼠動脈組織中炎癥因子的表達(圖4C-4F)差異有統(tǒng)計學意義(MCP-1:F=17.757 5,P<0.01;IL-6:F=102.046 0,P<0.01;TNF-α:F=13.632 3,P<0.01;IL-1β:F=30.139 4,P<0.01)。與對照組相比,BAPN組小鼠動脈炎癥因子MCP-1、IL-6、TNF-α、IL-1β水平明顯增加(MCP-1:P<0.01; IL-6:P<0.01;TNF-α:P<0.01; IL-1β:P<0.01);而與BAPN組相比,BAPN+FNDP組小鼠動脈炎癥因子MCP-1、IL-6、TNF-α、IL-1β的水平下降 (MCP-1:P<0.05; IL-6:P<0.05;TNF-α:P<0.01; IL-1β:P<0.01)。

2.5 FNDP對TAA平滑肌細胞收縮表型的影響動脈平滑肌細胞在正常功能狀態(tài)下表達收縮蛋白,如α-SMA和SM22α。RT-PCR結果顯示(圖5),各組小鼠動脈組織中α-SMA的表達差異有統(tǒng)計學意義(F=10.756 4,P<0.01),然而SM22α表達差異無統(tǒng)計學意義(F=3.352 3,P=0.087 6)。相比于對照組,BAPN組α-SMA和SM22α的表達顯著下降(α-SMA:P<0.01;SM22α:P<0.05);然而,相較于BAPN組,FNDP + BAPN組中α-SMA和SM22α的表達無顯著差異(α-SMA:P=0.128 5;SM22α:P=0.094 3)。

圖5 α-SMA和SM22α 的mRNA相對表達水平

3 討論

FNDP在不同的疾病中均表現(xiàn)出抗炎作用。Joseph et al[8]發(fā)現(xiàn)腹腔注射FNDP可減輕糖尿病內毒素小鼠的高血糖和全身炎癥反應;Amatya et al[9]發(fā)現(xiàn)FNDP可降低腎臟細胞內的氧化應激和炎癥反應;之前的研究[10]也顯示FNDP可激動巨噬細胞膜上的多巴胺一型受體,使胞內cAMP生成增多,繼而抑制巨噬細胞的炎癥因子表達,緩解心衰小鼠心肌早期炎癥。在本研究中,FNDP抑制了TAA管壁巨噬細胞的浸潤,降低了炎癥因子的產生,而炎癥反應是TAA的一個重要病理特征,這提示FNDP可能通過減輕炎癥反應從而減緩TAA的進展,但對于減緩TAA是否通過cAMP及其下游信號分子仍待進一步研究。

細胞外基質成分包括蛋白聚糖、糖蛋白、層粘連蛋白、膠原蛋白和彈性板等,這些蛋白共同維持著血管壁的彈性[11]。MMP2和MMP9可以降解細胞外基質,炎癥細胞釋放的炎性因子會刺激動脈壁使得MMP9的表達量增加[1]。此外,有研究[12]顯示可通過D5DR調節(jié)多巴胺信號轉導通路使得腦腫瘤中MMP9表達降低。在本研究中,小鼠腹腔注射FNDP后,細胞外基質降解減緩可能與炎癥反應的減輕有關,也可能與FNDP激活多巴胺一型受體信號通路密切相關,這可能是FNDP在TAA中具有保護作用的機制。

平滑肌細胞可以在收縮表型和合成表型之間轉換。收縮型平滑肌細胞會表達高水平的收縮蛋白,包括α-SMA和SM22α等;平滑肌細胞在受到刺激的情況下會轉換為合成表型。在TAA中,平滑肌細胞會由收縮表型轉化為合成表型,這意味著平滑肌細胞收縮蛋白的表達減少,對于主動脈壁強度和正常收縮功能的維持不利[1, 13]。本研究在BAPN誘導的TAA中,主動脈平滑肌細胞收縮蛋白α-SMA和SM22α顯著降低,與文獻[14]報道一致。過往研究[7, 15]顯示激動多巴胺一型受體可以通過硫化氫影響小鼠平滑肌細胞的增殖,本研究表明FNDP對平滑肌收縮蛋白α-SMA和SM22α無顯著影響。這提示FNDP對TAA進展的減緩可能與平滑肌細胞向收縮表型轉化無關。