通腦飲治療急性腦梗死的臨床療效及作用機制研究：基于網絡藥理學和分子對接技術

張林，高錦，吳明華，王廣梅

1.210000 江蘇省南京市，南京中醫藥大學附屬南京市中西醫結合醫院神經內科

2.210000 江蘇省南京市，南京中醫藥大學

3.210000 江蘇省南京市，南京中醫藥大學附屬醫院 江蘇省中醫院神經內科

4.210000 江蘇省南京市，南京中醫藥大學附屬南京市中西醫結合醫院藥劑科

腦卒中是全球最嚴重的公共健康問題［1-2］，其中70%為腦梗死。目前，腦梗死最直接和有效的治療手段是采用靜脈溶栓、動脈溶栓、機械取栓等手段迅速開通閉塞血管，促進血運重建，挽救半暗帶區瀕死的神經元［3］。但是，血運重建后的缺血-再灌注損傷則會加重腦損害，治療缺血-再灌注損傷的藥物有自由基清除劑、阿片受體阻斷劑、興奮性氨基酸受體阻斷劑等神經保護劑，但還沒有足夠的臨床證據支持廣泛運用這些藥物［4］。

通腦飲能顯著改善急性腦梗死患者的神經功能缺損癥狀，提高日常生活自理能力，在一定程度上降低致殘率，改善急性腦梗死患者的腦血流，改善血液供應［5-6］。此外，其可以在急性腦梗死早期更大程度上發揮與抗血小板藥物的協同作用，顯著抑制血小板聚集，并改善血小板相關參數［7］。

通腦飲包含川芎、鉤藤、天南星、紅景天、九節菖蒲、天麻、僵蠶、水蛭。多藥配伍被認為是中醫理論的精髓，然而，由于所涉及的成分復雜和目標眾多，使用傳統方法充分闡明其機制具有挑戰性。因此，有必要從系統層面揭示通腦飲治療腦梗死的潛在機制。《中醫藥振興發展重大工程實施方案》指出：支撐開展中醫藥交叉學科研究，充分利用現代科學技術說明白中醫藥療效，講清楚中醫藥作用原理。而網絡藥理學是一門基于系統生物學理論、生物系統網絡分析和多靶點藥物分子設計特定信號節點選擇的新學科。網絡藥理學強調信號通路的多渠道調節，提高藥物的治療效果，減少不良反應，從而提高新藥臨床試驗的成功率，節約藥物研發成本。隨著系統生物學和計算機技術的不斷創新和發展，網絡藥理學已被確認為有效和系統地闡明中藥的物質組成和分子機制的可行選擇［7-8］。此外，網絡藥理學方法已用于研究“復合蛋白/基因疾病”途徑，該途徑能夠從網絡角度描述生物系統、藥物和疾病之間的復雜性，與中醫藥共享類似的整體哲學［9］。應用系統生物學方法研究中藥的藥理作用、作用機制和安全性，對現代中藥研究和發展具有重要意義。因此，一種稱為中醫網絡藥理學的新的跨學科方法被提出，其開創了一種新的研究范式，將中醫從基于經驗的醫學轉變為循證醫學。張伯禮院士帶頭的構建“經典文獻-組分篩選-藥理評價-臨床驗證”技術流程將會為中醫現代化提供一個合適的技術平臺。此外，隨著分子生物學和基因組技術的最新進展，越來越多的數據可用［10］。例如，TCMSP［11］、STRING［12］、OMIM［13］、DisGeNET［14-15］等。分子對接是一種通過受體的特性以及受體和藥物分子相互作用的方式設計藥物的方法，其是一種理論模擬方法，主要研究分子（如配體和受體）之間的相互作用，并預測它們的結合模式和親和力。

本研究使用網絡藥理學預測通腦飲治療腦梗死的潛在機制。工作流程見圖1。

圖1 工作流程圖Figure 1 Work flow chart

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2019年1月—2020年6月江蘇省中醫院收治的199例腦梗死患者。根據隨機數字表法，將患者分為對照組（97例）和試驗組（102例）。本研究經江蘇省中醫院倫理委員會批準（倫理編號：2017NL-012-01）。在進入小組之前，患者及其家屬被告知所有研究內容和相關權益，并充分了解，并在自愿參與的前提下簽署知情同意書。治療期間，對照組有1例不配合治療，最終有效病例為對照組96例，試驗組102例。

1.2 納入、排除標準

1.2.1 納入標準：（1）符合《中國急性缺血性腦卒中診治指南2018》的診斷標準［16］且48 h內通過顱腦CT和磁共振檢查，確診為腦梗死；（2）通過頸動脈彩色多普勒檢測，確定頸動脈內膜中層厚度（CA-IMT）至少為1.2 mm；（3）自愿參加，依從性較好，并能堅持隨訪。

1.2.2 排除標準：（1）頸動脈超聲示管腔斑塊導致血流嚴重堵塞；（2）合并嚴重心肺功能不全、心律嚴重失常者；（3）肝腎功能嚴重失調者；（4）重癥感染者及惡性腫瘤感染者；（5）冠狀動脈急性癥候群；（6）過敏體質或者藥物過敏者；（7）妊娠或哺乳的婦女。

1.2.3 剔除、脫落及終止標準：（1）對本研究使用的藥物有嚴重不良反應者；（2）不遵醫囑或治療過程中因各種原因未完成療程或治療不全者；（3）治療期間發生嚴重疾病不能繼續治療者；（4）數據處理時發現數據缺失的患者。

1.3 治療方法

入院后，兩組均接受穩定型腦梗死的標準化治療，包括抗血小板聚集，口服拜阿司匹林片0.1 g，1次/d；氯吡格雷75 mg，1次/d，單用或兩藥聯用；抗動脈硬化、穩定斑塊（阿托伐他汀鈣片20 mg，1次/d或瑞舒伐他汀10 g，1次/d）、清除氧自由基等。試驗組在對照組基礎上加用通腦飲治療［天南星10 g、川芎10 g、天麻10 g、鉤藤（后下）30 g、紅景天15 g、水蛭5 g、僵蠶10 g、九節菖蒲10 g］，水煎服，1副/d，服用2周。

1.4 觀察指標

兩組均接受2周的治療，入院時和治療2周時評估美國國立衛生研究院卒中量表（NIHSS）評分和改良Rankin量表（mRS）評分。NIHSS用于評估腦卒中引起的功能損害程度，由11項測試組成，得分為0～42分。得分越高表示腦卒中越嚴重，與腦卒中造成的腦損傷呈正相關［17］。mRS用于測量腦卒中后患者神經功能的恢復情況，分值為0～5分，分值越低，恢復狀態越好［18］。

1.5 網絡藥理學分析

1.5.1 通腦飲化學成分篩選及成分靶點預測：從TCMSP和文獻中篩選通腦飲的化學成分（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）［19］。TCMSP是一個中草藥系統藥理平臺，可以得到藥物、靶標和疾病之間的關系。根據通腦飲中的各種化合物的藥代動力學吸收、分布、代謝和排泄，即ADME過程，對其進行篩選。TCMSP數據庫詳細描述了每種成分的ADME參數，包括口服生物利用度（OB）、藥物相似性（DL）、血-腦脊液屏障（BBB）等。OB表示藥物成分的口服可用性，DL表示成分和已知藥物之間的相似性。選擇滿足OB≥30%和DL≥0.18要求的成分來尋找該處方的有效成分。

1.5.2 預測所選化合物的靶蛋白：將所有活性成分輸入TCMSP數據庫以獲得其已知靶點，并使用Cytoscape 3.8.2工具繪制化合物和靶蛋白的網絡圖。

1.5.3 尋找與疾病相關的目標：以“腦梗塞”為關鍵詞，OMIM（http://www.omim.prg/）和GeneCards（http://www.genecards.org/）用于搜索和篩選用于后續研究的已知疾病靶標，并丟棄搜索結果中重復的靶標。UniProt知識庫［20-21］（http://www.uniprot.org/）用于獲取標準目標的名稱，并將該生物體選為“智人”。

1.5.4 通腦飲和腦梗死的常見靶點和關鍵靶點的研究：使用在線工具繪制Venn圖，Venn圖用于展示不同群組之間的聯系，在本研究中可以獲得靶點藥物與疾病的共同靶點。將獲得的交叉靶標用作藥物效應靶標，并使用Cytoscape 3.8.2構建藥物效應靶標組分相互作用網絡。分析網絡以獲得其Degree值，Degree值反映靶點的關鍵程度，Degree值越高，藥物和靶點越重要，最終獲得關鍵藥物效果目標。

1.5.5 蛋白質-蛋白質相互作用網絡的構建：使用STRING（檢索相互作用基因/蛋白質的搜索工具）數據庫，該數據庫包含已知和預測的蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）。通過該數據庫構建通腦飲在腦梗死中潛在靶基因的PPI網絡。

1.5.6 富集度分析：為了確定主要樞紐靶基因參與的生物過程和信號通路，使用注釋、可視化和集成發現數據庫（David）進行通路富集分析。將腦梗死中通腦飲的靶基因輸入到David基因本體（GO）生物過程分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路分析中。P≤0.01的GO生物過程和P≤0.01的KEGG途徑被認為具有顯著富集性。

1.5.7 分子對接：為了確定通腦飲治療腦梗死的主要活性成分，對蛋白質分子雄激素受體（androgen receptor，AR）的小分子進行分子對接操作。首先從Pub Chem數據庫下載SDF格式的活性成分，然后利用Chem 3D進行能量最小化計算將文件轉換為MOL2格式；通過RCSB PDB數據庫下載靶蛋白的PDB結構文件，使用Auto Dock Tools軟件去除雜原子、計算電荷等；最后運行Auto Dock Vina進行分子對接，通過CB-Docl（http://clab.labshare.cn/cb-dock）將結果可視化。

1.6 統計學方法

采用SPSS 25.0統計軟件進行數據處理與分析。計數資料和等級資料比較采用χ2檢驗或非參數檢驗。非正態分布的計量資料以M（P25，P75）表示，兩組間比較采用Mann-Whitney U檢驗，組內治療前后比較采用配對秩和檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 臨床試驗結果

治療前，兩組NIHSS和mRS評分比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；治療后，試驗組NIHSS、mRS評分均低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；兩組治療后NIHSS、mRS評分均低于治療前，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 兩組患者治療前后NIHSS、mRS評分比較［M（P25，P75），分］Table 1 Comparison of NIHSS and mRS scores before and after treatment between the two groups of patients

2.2 網絡藥理學分析結果

2.2.1 不同數據庫中通腦飲和CI的靶點識別：數據庫檢索篩選出通腦飲中的活性成分（表2），并使用Cytoscape 3.8.2構建了活性成分靶標相互作用網絡（圖2）。通過關鍵詞搜索，在Genecards數據庫和OMIM數據庫中獲得腦梗死的相關靶點。Venn圖構建了活性成分靶標和疾病靶標的交集（圖3）。共有134個交叉靶點用于后續的網絡藥理學分析。

表2 通腦飲中的有效成分Table 2 Active ingredients in Tongnao Decoction

圖3 通腦飲治療腦梗死的靶點Venn圖Figure 3 Target Venn map of Tongnao Decoction in the treatment of cerebral infarction

2.2.2 尋找關鍵目標并建立PPI網絡：將獲得的交叉靶標用作藥物效應靶標，使用Cytoscape 3.8.2構建藥物效應靶標組分相互作用網絡（圖4）。分析網絡以獲取其“度”值。具有Degree值的前20個藥效學靶點包括雌激素受體（ESR1）、AR、環氧合酶2（PTGS2）、細胞周期蛋白依賴性激酶2（CDK2）等（表3）。構建PPI網絡圖展示各靶點之間的關系（圖5）。

表3 通腦飲治療腦梗死的關鍵靶點Table 3 Key targets of Tongnao Decoction in the treatment of cerebral infarction

圖4 通腦飲治療腦梗死的靶點網絡圖Figure 4 Target network map of Tongnao Decoction in the treatment of cerebral infarction

圖5 通腦飲治療腦梗死的蛋白質相互作用網絡Figure 5 Protein interaction network of Tongnao Decoction in the treatment of cerebral infarction

2.2.3 GO和KEGG的富集分析：根據P值，GO分析的BP的重要項目是細胞對脂質的反應、細胞定位的調節、信號轉導、細胞對刺激的反應、化學刺激的細胞反應、刺激的反應，生物合成過程的正調節、信號傳導的調節、血壓的調節、運輸的調節，活性氧代謝過程的正調節等（圖6）。初步推斷通腦飲與腦梗死治療中的炎癥反應密切相關。

圖6 GO生物過程富集分析Figure 6 GO biological process enrichment analysis

根據P值，KEGG分析共篩選出20條通路，包括前列腺癌癥、神經活性配體-受體相互作用、白介素（IL）-17信號通路、催乳素信號通路、PI3K-Akt信號通路、鈣信號通路等（圖7）。

圖7 KEGG富集分析Figure 7 KEGG enrichment analysis

2.2.4 分子對接：得到3個活性成分與AR靶點的對接結果，其中，AR與β谷甾醇結合最穩定，得分為-10.1 kJ/mol，AR與山柰酚的對接組合得分為-7.5 kJ/mol，AR與胡蘿卜素的對接組合得分為-7.02 kJ/mol。對接三維視圖見圖8。

圖8 分子對接結果Figure 8 Molecular docking result

3 討論

3.1 概述

腦梗死主要是由向大腦供血動脈的動脈粥樣硬化和血栓形成引起的，使管腔狹窄甚至閉塞，導致局灶性急性腦功能不全；也有異常物體（固體、液體和氣體）沿著血液循環進入大腦動脈或供應大腦血液循環的頸動脈，導致血流受阻或血流突然減少，導致相應優勢區域的腦組織軟化和受損。在本研究中，通腦飲被用于治療腦梗死。然而，用傳統方法闡明通腦飲治療腦梗死的復雜機制具有挑戰性。因此，將基于大數據生物信息學的網絡藥理學整合到中醫藥治療疾病的分子機制研究中是至關重要的［22-23］。本研究采用網絡藥理學方法探討通腦飲治療CI的物質基礎和分子機制。

目前西醫治療腦梗死的藥物很多，但是存在呼吸困難、胃腸道反應等不良反應［24-26］。中藥具有多靶點、不良反應少等特點。本研究發現了121個藥物和疾病的共同靶點，這些靶點可能是治療腦梗死時該處方的靶點。基于拓撲分析，本研究進一步從121個后續研究的共同靶點中找到了23個關鍵靶點，包括ESR1、AR、DPP-4、PTGS2、CDK2等。其中，HSP90是一種普遍存在的分子伴侶［27］。HSP90抑制劑具有顯著的抗炎作用［28-29］。本研究GO分析、臨床試驗和其他現代研究的結合證實了炎癥在腦梗死中的重要作用。KEGG富集分析顯示了IL-17（腦梗死中的信號通路）的重要地位。HSP90在這些通路中起著至關重要的作用。

本研究主要關注AR基因作為子網絡中的關鍵節點。分子對接是在小分子和編碼蛋白質之間進行的。在分子對接后，發現3種分子與AR直接相互作用：β谷甾醇、山柰酚和胡蘿卜素。預計進一步的研究將評估這些分子之間的協同作用。

3.2 臨床意義

本研究使用NIHSS評分和mRS評分評價入院和出院時使用通腦飲和未使用通腦飲患者的狀況。結果顯示，治療后，試驗組NIHSS評分和mRS評分均低于對照組。在一般西藥治療的基礎上，加上江蘇省中醫院協定方通腦飲可以顯著改善患者生活質量。

3.3 局限性

網絡藥理學中確定的關鍵靶點和/或途徑尚未在臨床試驗中得到驗證，但本研究的臨床結果可以顯著比較使用通腦飲前后NHISS和mRS評分的改善，并證明通腦飲可以有效減少腦梗死的功能損害，對神經有一定的恢復作用，并且可以有效抑制炎癥。然而，本研究尚未能夠探索具體機制，也沒有進行實驗驗證，即使結合網絡藥理學和分子對接的結果，仍然不能完全理解通腦飲的確切治療機制，未來將會針對預測結果進行進一步的研究。

4 結論

本研究結合網絡藥理學和臨床試驗，探討通腦飲治療腦梗死的機制。結果表明通腦飲可能通過HSP90發揮抑制炎癥反應的作用。此外，IL-17、催乳素、PI3KAkt信號通路也可能是潛在的機制。本研究證明了在西醫標準治療的基礎上加上通腦飲，可以顯著改善腦梗死患者相關癥狀，通腦飲可以被認為是腦梗死的補充或替代療法。此外，希望計算機生物學能夠為中醫藥的現代研究提供一種途徑。

作者貢獻：吳明華提出研究思路，設計研究方案，研究命題的提出、設計；張林負責進行試驗或調查、調查對象的選取、樣本的采集、指標化驗與檢測等；張林、高錦負責數據收集、采集、清洗和統計學分析、繪制圖表等；高錦負責論文起草；王廣梅負責最終版本修訂，對論文負責。

本文無利益沖突。