黃刺多糖中單糖含量與體外降血糖活性相關性分析

岳慶明，韓麗娟，鄧永蓉，馬娜娜，趙玉欣

（青海大學農牧學院，青海 西寧 810016）

黃刺，學名直穗小檗（Berberis dasystachyaMaxim.），是青藏高原一種藥食兩用的植物漿果資源。目前，市場上黃刺漿果相關產品有“三刺果汁[1]”“三刺果粉[2]”“三刺面霜[3]”等。黃刺果實中富含多種生物活性物質，如小檗堿、植物甾醇、有機酸、黃酮、多糖和多酚等，一直以來備受科學界關注。黃刺多糖（Berberi dasystachyapolysaccharides，BDPs）作為一種功能性植物多糖，具有抗腫瘤、降血糖及抗氧化活性等功能[3-5]。

韓麗娟等[5]研究發現黃刺果粉可改善糖尿病大鼠血液中的葡萄糖水平，并對血清及組織中的氧化應激酶和丙二醛（malondialdehyde，MDA）具有調節作用。本課題組前期研究表明，分級醇沉的BDPs在抗氧化活性和降血糖活性方面具有良好效果[6]。Zhou Wen等[7]研究表明，超濾BDPs可有效改善2型糖尿病大鼠癥狀，提高機體抗氧化能力，調節氧化應激水平，通過逆轉2型糖尿病大鼠腸道菌群失調和代謝紊亂，調節代謝產物-腸道微生物的相互作用達到治療2型糖尿病目的。BDPs作為功能性多糖，其降血糖效果顯著。α-葡萄糖苷酶作為消化酶將淀粉和雙糖轉化為葡萄糖，加速葡萄糖生成速率；α-淀粉酶作為淀粉水解酶，水解后產生的糊精、葡萄糖等產物可導致2型糖尿病發生，針對兩種酶的抑制劑可延緩葡萄糖生成速率，抑制腸道消化吸收降低餐后血糖水平[8]，因此檢測這兩種體外酶抑制率可作為主要的體外降血糖活性評價體系。譚西等[9]研究表明，多糖的降血糖活性與多糖結構密切相關。研究表明，不同產地的植物多糖中單糖含量及單糖組成不同且導致其生物活性會有所差異[10]。目前，國內外對不同產地BDPs其體外降血糖活性的比較及其單糖含量與體外降血糖活性相關性研究鮮有報道。

You Shu等[11]研究表明，身體各組織長期暴露在高水平游離脂肪酸（或棕櫚酸）和葡萄糖條件下會對身體組織造成嚴重損傷，稱為糖脂毒性損傷，尤其對胰島β細胞損傷更為嚴重。高糖高脂引起的糖脂毒性（glucolipotoxicity，GLTy）是導致β細胞凋亡和氧化應激發生的罪魁禍首，進而導致β細胞功能受損。因此，預防胰島β細胞免受GLTy引起的氧化應激和細胞凋亡對阻止2型糖尿病進展至關重要[12]。通過無毒無害天然活性物質保護已受GLTy損傷的胰島β細胞，進而有效提高胰島細胞存活率達到治療和預防2型糖尿病效果迫在眉睫。課題組前期研究發現，BDPs可提高H2O2誘導損傷的胰島細胞抗氧化酶活性，降低活性氧（reactive oxygen species，ROS）和MDA水平，進而達到保護氧化損傷胰島細胞的作用[4]。然而，鮮見關于BDPs對GLTy誘導損傷的胰島細胞活性的報道。

本實驗以青海省5 個不同產地黃刺漿果為研究對象，超聲輔助熱水浸提不同產地BDPs，首先對其理化性質及單糖組成、含量進行對比分析研究；其次，通過建立高糖高脂雙誘導劑聯合誘導RIN-m5F胰島細胞GLTy模型，測定不同產地BDPs干預后細胞增殖活性、ROS、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α水平；最后采用Pearson相關性分析方法，對不同產地BDPs單糖含量與降血糖活性、胰島細胞增殖活性、ROS及TNF-α間的相關性進行分析。以期明確黃刺單糖含量與體外降血糖活性相關性，為藥食同源黃刺漿果在降血糖方面開發利用及其構效關系的深入研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃刺漿果采自青海省周邊州縣互助縣（BDPs-I）、大通縣（BDPs-II）、循化縣（BDPs-IV）、湟源縣（BDPs-V）及西寧市（BDPs-III），采摘時間為2021年8月下旬—10月上旬果實成熟期。

RIN-m5F胰島細胞（胰島β細胞瘤細胞）賽百慷生物技術股份有限公司；石油醚、無水乙醇、正丁醇、氯仿、甲醇（均為分析純）國藥集團化學試劑有限公司；三氟乙酸（色譜純）上海安譜生物科技有限公司；α-淀粉酶、α-葡糖糖苷酶 上海源葉生物科技有限公司；細胞計數試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8）生工生物工程（上海）股份有限公司；RPMI-1640培養基 上海逍鵬生物科技有限公司；胎牛血清 浙江天杭生物科技股份有限公司；ROS檢測試劑盒、TNF-α檢測試劑盒 南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設備

QYLDZ-6真空冷凍干燥機 上海喬躍電子有限公司；UV-2600紫外-可見分光光度計 日本島津企業有限公司；Reacti-thermo氮氣吹掃儀、ICS5000離子色譜儀、酶標儀、熱重儀、U3000液相色譜儀 美國Thermo Fisher Scientific公司；SU8220冷場發射掃描電子顯微鏡 日本日立有限公司；BSC-1304IIA2生物安全柜 蘇州安泰空氣技術有限公司；AE31E倒置生物顯微鏡 麥克奧迪實業集團有限公司；HF90二氧化碳培養箱 上海力申科學儀器有限公司；H1850醫用離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司；Optilab T-rEX示差檢測器、DAWN HELEOS II激光光散射檢測器 美國懷亞特科技公司。

1.3 方法

1.3.1 BDPs提取

不同產地黃刺干果→粉碎過篩（100 目）→石油醚脫脂（40 ℃，料液比1∶5）→85%（V/V）乙醇溶液脫單糖（50 ℃，料液比1∶3）→超聲熱水浸提（80 ℃，料液比1∶30）→Sevag法除蛋白→D101大孔樹脂脫色→透析袋除小分子物質→80%（V/V）乙醇溶液醇沉（4 ℃，靜置過夜）→冷凍干燥→得不同產地黃刺粗多糖。由圖1可見，相同條件下由不同產地黃刺干果制備的多糖組織形態存在較大差異，BDPs-I和BDPs-IV整體呈現細小顆粒狀和細膩粉末狀，BDPs-II以輕盈絮狀物為主，而BDPs-III和BDPs-V中呈大小不一的沙粒狀，說明黃刺粗多糖最終外貌形態與產地存在較大關聯。

圖1 不同產地BDPs外貌形態Fig.1 Pictures of BDPs from different geographical origins

1.3.2 BDPs化學成分測定

分別采用苯酚-硫酸法[13]、硫酸-咔唑法[14]、DNS試劑法[15]、考馬斯亮藍法[16]測定BDPs中的多糖、糖醛酸、還原糖和蛋白質量分數。

1.3.3 單糖組成分析

精確稱量BDPs樣品5 mg至色譜瓶，加入1mL 2mol/L三氟乙酸酸溶液，121 ℃加熱2 h。氮氣吹干，加入甲醇清洗吹干，重復操作2～3 次，加入無菌水溶解待測。采用離子色譜系統，色譜柱DionexTMCarboPacTMPA20（150 mm×3.0 mm，10 μm），進樣量為5 μL。流動相A為0.1 mol/L NaOH溶液，流動相B為0.1 mol/L NaOH和0.2 mol/L NaAc混合液；流速0.5mL/min；柱溫為30 ℃；洗脫梯度程序：0～30 min，95%～80% A、5%～20% B；30.1～45 min，60% A、40% B；45.1～60 min，95% A、5% B。

1.3.4 單糖含量測定

采用外標法定量，通過配制不同濃度標樣制定標準曲線。線性關系信息如表1所示，再以樣品中各單糖對應的峰面積代入標準曲線計算質量濃度，進一步計算各單糖含量。單糖含量（W）計算如式（1）所示：

表1 單糖含量標準曲線參數Table 1 Standard curve parameters for determination of monosaccharide contents

式中：c為通過標準曲線計算的質量濃度/（μg/mL）；V為樣品提取液體積/mL；F為稀釋因子；M為樣品稱取總量/mg。

1.3.5 BDPs分子質量測定

采用凝膠色譜儀、激光散射儀和示差檢測器連用測定BDPs分子質量。將樣品溶解在0.1 mol/L NaNO3溶液（含質量分數0.02% NaN3）中，終質量濃度為1 m g/m L，通過孔徑為0.4 5 μ m 的過濾器過濾后上機檢測。采用凝膠排阻色譜柱O h p a k S B-805 HQ（300 mm×8 mm）和Ohpak SB-803 HQ（300 mm×8 mm）串聯，柱溫45 ℃，進樣量100 μL，流動相0.02% NaN3溶液和0.1 mol/L NaNO3溶液，流速0.6 mL/min，0～75 min內等度洗脫[17]。

1.3.6 BDPs初級結構表征

1.3.6.1 紫外光譜分析

將BDPs配制成質量濃度為1 mg/mL的溶液，用紫外-可見分光光度計在波長200～800 nm范圍內進行全波長掃描[18]。

1.3.6.2 傅里葉變換紅外光譜分析

將干燥的多糖粉末與KBr按1∶5的比例充分研磨混合后壓片，用傅里葉變換紅外光譜儀在4 000～400 cm-1范圍內進行掃描[19]。

1.3.6.3 掃描電子顯微觀察

將表面涂有薄層金的BDPs在電子顯微鏡系統下掃描觀察[20]。

1.3.6.4 剛果紅試驗

精確稱取BDPs配制成3 mg/mL的多糖溶液，取1 mL BDPs溶液與0.2 mmol/L剛果紅溶液等體積混合，之后分別加入1 mol/L NaOH溶液控制最終溶液中NaOH濃度為0～0.5 mol/L，在200～600 nm下進行全波長掃描測定其最大吸收波長[21]。

1.3.7 BDPs熱重分析

準確稱取定量的BDPs多糖，使用熱重儀在氮氣環境下將多糖溫度由25 ℃升高到900 ℃，升溫速率為10 ℃/min，進行熱重分析[22]。

1.3.8 BDPs體外降血糖活性測定

1.3.8.1α-葡萄糖苷酶抑制活性分析

參考文獻[23]稍作改動，配制質量濃度分別為16、8、4、2、1、0.5 mg/mL的BDPs溶液，同時配制2 U/mL的α-葡萄糖苷酶。按表2添加各試劑，利用酶標儀在405 nm處測量吸光度。通過式（2）計算α-葡糖苷酶的抑制率：

表2 α-葡萄糖苷酶抑制率測定體系Table 2 Preparation of reaction systems for α-glucosidase inhibitory assay

式中：A1為空白組的吸光度；A2為空白對照組的吸光度；A3為樣品組的吸光度；A4為樣品對照組的吸光度。

1.3.8.2α-淀粉酶抑制活性分析

參考文獻[24]稍作改動，配制質量濃度分別為16、8、4、2、1、0.5 mg/mL的BDPs溶液及15 U/mLα-淀粉酶溶液。按表3添加各試劑，利用酶標儀在540 nm處測定吸光度。按式（3）計算α-淀粉酶的抑制率：

表3 α-淀粉酶抑制率測定體系Table 3 Preparation of reaction systems for α-amylase inhibitory assay

式中：A1為空白組的吸光度；A2為空白對照組的吸光度；A3為樣品組的吸光度；A4為樣品對照組的吸光度。

1.3.9 細胞實驗

RIN-m5F細胞在標準細胞培養條件下（5% CO2、37 ℃）在含有10%（V/V）胎牛血清、1%（V/V）雙抗（100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素）的完全培養基中生長直至細胞貼壁。在細胞密度達到80%～90%時，用0.25%胰蛋白酶消化后進行傳代、凍存及后續鋪板實驗。

1.3.10 GLTy誘導RIN-m5F細胞凋亡模型建立

前期課題組分別成功建立了45 mmol/L高糖誘導胰島細胞和0.2 mmol/L高脂誘導胰島細胞的單一誘導RIN-m5F細胞毒性模型。在此基礎上混合兩種單一誘導劑溶液，使雙誘導劑中高糖終濃度為22.5 mmol/L，高脂終濃度為0.1 mmol/L進行共同誘導，通過控制時間（12、24、36、48 h）確定最終RIN-m5F細胞GLTy模型。

1.3.11 不同產地BDPs對GLTy細胞損傷的保護作用研究

1.3.11.1 實驗分組

空白對照組：無細胞+完全培養基；正常對照組（NC）：細胞+完全培養基；模型組（MC）：細胞+完全培養基+雙誘導劑；BDPs干預組：細胞+完全培養基+0.062 5 mg/mL BDPs溶液+雙誘導劑。

按細胞分組，使用對數生長期內RIN-m5F胰島細胞，以1×105cells/mL的密度將細胞接種于96 孔板，加入100 μL完全培養基鋪板使細胞貼壁，之后棄去培養基，NC組加入完全培養基，其余組別均加入雙誘導劑經細胞建模后，再此棄去培養基，NC組和MC組重新加入新完全培養基，其余多糖干預組加入BDPs多糖進行干預。每組做6 個復孔平行，培養24 h后進行后續實驗。

1.3.11.2 不同產地BDPs干預后細胞增殖活性測定

按1.3.11.1 節實驗分組處理細胞，待細胞處理完成后，采用CCK-8法測定細胞存活率，每孔加入100 μL CCK-8溶液（V（CCK-8試劑）∶V（無血清培養基）＝1∶10），于37 ℃細胞培養箱中孵育0.5 h，在450 nm處測定吸光度，通過式（4）計算測定經不同產地BDPs干預后細胞存活率：

式中：A1為NC、MC、BDPs干預組的吸光度；A2為空白對照組的吸光度；A3為NC組的吸光度。

1.3.11.3 不同產地BDPs干預后細胞胞內ROS水平和TNF-α水平測定

按1.3.11.1節實驗分組處理細胞，通過2’,7’-二氯熒光素雙乙酸鹽熒光探針法測定ROS水平，參照酶聯免疫吸附測試試劑盒說明書測定各組細胞上清液中TNF-α水平。

1.3.11.4 細胞形態觀察

按1.3.11.1節實驗分組接種細胞至6 孔板處理細胞，通過倒置顯微鏡觀察細胞數量及生長狀態，10 倍鏡下觀察并留取圖像[4]。

1.4 數據處理與統計分析

2 結果與分析

2.1 BDPs的化學組成分析

5 種BDPs中的蛋白質、還原糖、多糖及糖醛酸質量分數結果如表4所示，BDPs中化學組成存在一定的差異。其中BDPs-I中多糖質量分數顯著高于其他產地多糖，為58.41%（P＜0.05）。BDPs-II中糖醛酸質量分數為62.22%，顯著高于其他產地多糖（P＜0.05），但與BDPs-IV 中糖醛酸質量分數差異并不顯著。BDPs-III和BDPs-IV中蛋白質量分數顯著低于其他多糖（P＜0.05），均為0.22%，5 種BDPs中蛋白質量分數均在0.22%～0.40%之內，說明蛋白質去除較干凈。BDPs-III中還原糖質量分數高達0.67%，且與其他BDPs差異顯著（P＜0.05）。由此可知，通過超聲輔助熱水浸提同一提取方法所得不同產地BDPs化學組成均存在顯著差異。

表4 不同產地BDPs化學組成Table 4 Chemical compositions of BDPs from different regions

2.2 BDPs的單糖組成及含量分析

采用Thermo IC5000離子色譜系統，利用電化學檢測器對BDPs單糖組成進行分析檢測。BDPs單糖組成離子色譜圖如圖2所示，結果表明各產地BDPs中共有單糖含有8 種，分別是Fuc、Rha、Gal、Glc、Xly、Man、Glc-UA、Gal-UA。其中BDPs-III和BDPs-V單糖組成中比其他3 個樣品多含有一種Ara。由此可知不同產地BDPs中多糖組成存在差異。

圖2 不同產地BDPs單糖組成離子色譜圖Fig.2 Ion chromatograms of monosaccharide compositions of BDPs from different regions

由表5可知，BDPs-I、BDPs-II、BDPs-IV樣品單糖組成一致，均由8 種單糖組成，但各單糖組分所占百分比卻大相徑庭。而BDPs-III和BDPs-V多糖樣品由Fuc、Ara、Rha、Gal、Glc、Xly、Man、Glc-UA、Gal-UA 9 種單糖組成，各單糖組分所占百分比也不相同；通過比較其他3 種多糖樣品發現，Ara僅存在于BDPs-III和BDPs-V中，且BDPs-III中Ara含量是BDPs-V的2 倍。由此可知不同產地黃刺粗多糖中單糖含量存在較大差異，推測可能與黃刺漿果產地海拔、氣候條件、生長環境等不同有著密不可分的關系。

表5 不同產地BDPs單糖含量占比Table 5 Monosaccharide contents in BDPs from different regions%

2.3 BDPs的分子質量分析

結合圖3分子質量分析圖和表6分子質量分布表可知，BDPs-III重均分子質量最小（8.673 kDa），BDPs-IV重均分子質量最大（1 322.854 kDa）。說明BDPs分子質量大小受到產地影響較大，推測可能與產地海拔、環境氣候、年降雨質量等外界因素有較大關聯。

表6 不同產地BDPs分子質量分布Table 6 Molecular mass distribution of BDPs from different regions

圖3 BDPs分子質量分析圖Fig.3 Molecular mass analysis of BDPs

2.4 BDPs的初級結構表征

2.4.1 紫外光譜分析

如圖4所示，對BDPs進行紫外光譜掃描，發現BDPs均在200 nm左右波長處有強烈吸收峰，為多糖特征峰；在260 nm和280 nm左右處有較弱吸收峰，表明BDPs中可能均存在少量蛋白質及核酸，與蛋白質含量測定的結果一致。

圖4 不同產地BDPs紫外光譜圖Fig.4 Ultraviolet spectra of BDPs from different regions

2.4.2 紅外光譜分析

如圖5所示，在3 432 cm-1左右顯現出1 個寬而強的吸收峰，此峰是由多糖分子間亦或是分子內因O—H的伸縮振動引起的。而在2 928 cm-1附近的吸收峰為烷基C—H的伸縮振動引起的[18]。在1 746 cm-1和1 616 cm-1附近出現弱吸收峰表明多糖中存在酯羰基（—CO—）和羧基（COO—）[4]。此外，在1 442 cm-1附近存在吸收峰，推測BDPs中含有糖醛酸[20]，這與粗多糖中糖醛酸含量測定結果相一致。1 248 cm-1處出現的吸收峰可能是由C—O糖苷鍵的伸縮振動引起的[25]，1 070 cm-1和1 024 cm-1處波峰表明黃刺粗多糖中存在吡喃糖，而779 cm-1處波峰顯示的信號表明吡喃糖是以β型結構存在于BDPs中[5]。通過紅外光譜分析發現不同產地BDPs糖苷鍵連接方式一致，均由β-糖苷鍵連接且是具有吡喃糖環骨架構型的雜多糖。

圖5 不同產地BDPs紅外光譜圖Fig.5 Infrared spectra of BDPs from different regions

2.4.3 掃描電子顯微鏡觀察分析

由圖6可知，BDPs結構形態呈現一定的差異性，BDPs-I以片狀結構組成，表面較為平整且結構疏松，存在孔洞（圖6A）。BDPs-II存在條帶狀結構，有細微裂縫（圖6B）。BDPs-III表面整體較為光滑，但存有細微裂縫（圖6C），推測由于較小的分子質量賦予了BDPs-III較為細膩光滑的外貌形狀。BDPs-IV表面粗糙、凹凸不平，呈石泥堆積狀（圖6D），由此推測可能是由于BDPs-IV擁有較大的分子質量有關。BDPs-V表面無孔洞及裂縫，且有大小不一顆粒狀存在（圖6E）。掃描電子顯微鏡發現不同產地BDPs外貌形態差異明顯，造就該現象的原因可能與BDPs分子質量大小有密不可分的關系。

圖6 不同產地黃刺粗多糖掃描電子顯微鏡圖Fig.6 Scanning electron micrographs of BDPs from different regions

2.4.4 剛果紅試驗結果

由圖7可以看出，隨著NaOH濃度的增大，BDPs剛果紅試劑作用產生絡合物的最大吸收波長均呈現連續下降的趨勢，造成這種結果的原因可能是因為BDPs結構復雜，分子質量大，在水溶液中呈現無規卷曲構象，說明BDPs均不具備三螺旋結構。

圖7 不同NaOH濃度下BDPs與剛果紅絡合物的最大吸收波長Fig.7 Maximum absorption wavelengths of BDPs and Congo red complex at different NaOH concentrations

2.5 BDPs熱穩定性結果分析

如圖8所示，BDPs在50～850 ℃范圍間其熱穩定性效果均存在較大差異。BDPs-I、BDPs-II、BDPs-IV在整體溫度范圍內其熱解過程分為2 個階段，其中BDPIII和BDPs-V在整體溫度范圍內其熱解過程分為3 個階段。BDPs-I～BDPs-V樣品第一階段質量損失率依次為7.12%、7.68%、9.26%、9.47%、9.55%，第一階段最大質量損失速率分別出現在97.92、97.74、101.61、97.73、99.34 ℃。這一階段損失了樣品中水分，表明樣品中含有不同含量的結合水以及部分吸附水[22]。其次也印證了由于多糖相對穩定的結構進一步造就了多糖在50～200 ℃范圍內保持相對穩定，同時說明該溫度范圍的熱處理不會引起多糖的熱分解，說明BDPs可應用于巴氏殺菌食品、藥品等需高溫處理的領域[26]。該階段BDPs-I質量損失最低，損失率為7.12%。說明第一階段中BDPs-I中水分含量較低，其穩定性較好。

圖8 不同產地BDPs熱穩定性Fig.8 Thermal stability of BDPs from different regions

第二階段BDPs-I～BDPs-V樣品質量損失率依次為66.17%、68.25%、61.23%、64.37%、65.51%，該階段最大質量損失速率分別出現在BDPs-I：252.57；BDPs-II：300.32 ℃；BDPs-III：303.81 ℃；BDPs-IV：247.59 ℃；BDPs-V：303.81 ℃。表明不同產地BDPs樣品第二階段發生熱解的溫度點各不相同，且各溫度點相差較大，其發生熱解溫度點跨度范圍為237.98～460.12 ℃。推測該階段是由于高溫熱解過程使得BDPs樣品中多糖糖苷鍵斷裂而造成的一次較大的質量損失。

樣品BDPs-III和BDPs-V第三階段熱解過程分別為587.22～845.83 ℃和543.36～845.93 ℃，該階段樣品質量損失率分別為5.26%和7.05%，最大質量損失速率出現在699.12 ℃和688.80 ℃。推測可能是樣品中色素以及未去除干凈的雜質在688 ℃以上高溫條件下發生的熱解而造成的較小的質量損失，由此說明BDPs-III和BDPs-V中含有少量雜質。

2.6 BDPs的體外降血糖活性

BDPs對α-葡萄糖苷酶抑制率見圖9a。在實驗質量濃度范圍內（0.5～16 mg/mL），雖然BDPs對α-葡萄糖苷酶抑制效果顯著低于阿卡波糖陽性組（P＜0.05），但其對α-葡萄糖苷酶仍具有較強的抑制能力，且抑制率與樣品質量濃度呈正相關。BDPs-III對α-葡萄糖苷酶抑制能力較其他產地BDPs強，于16 mg/mL質量濃度下其抑制率為66.56%（P＜0.05）。不同產地BDPs對α-葡萄糖苷酶半抑制濃度（half-maximal inhibitory concentration，IC50）值由小到大依次為BDPs-III（3.717 mg/mL）＜BDPs-V（14.556 mg/mL）＜BDPs-I（15.701 mg/mL）＜BDPs-II（17.155 mg/mL）＜BDPs-IV（17.697 mg/mL）。由此可見，BDP-III對于α-葡萄糖苷酶抑制能力強于其他產地BDP，該結果與Ji Xiaolong等[27]所報道的低分子質量的多糖由于其分子內氫鍵較弱，會有更多的游離氨基和羥基，更利于多糖發揮生物活性的結論一致。

圖9 不同產地BDPs體外降血糖活性Fig.9 In vitro hypoglycemic activitiesof BDPs from different regions

BDPs對α-淀粉酶活性抑制率測定見圖9b。在實驗質量濃度范圍內（0.5～16 mg/mL），雖然BDPs對α-淀粉酶抑制效果顯著低于阿卡波糖陽性組（P＜0.05），但其對α-淀粉酶表現較好的抑制能力，且抑制率與樣品質量濃度之間存在一定的劑量依賴關系。在低質量濃度范圍（0.5～4 mg/mL）內，BDPs-III對α-淀粉酶抑制能力顯著優于其他產地樣品，在高質量濃度范圍（8～16 mg/mL）內，BDPs-I對α-淀粉酶抑制能力顯著優于其他產地樣品。在最大質量濃度條件下，BDPs-I對α-淀粉酶抑制率顯著優于其余樣品，其最大抑制率為67.41%（P＜0.05），其余4 種BDPs樣品抑制率彼此并無統計學差異（P＞0.05）。其中不同產地BDPs對α-淀粉酶IC50值按序依次為BDPs-I（9.875 mg/mL）＜BDPs-V（10.056 mg/mL）＜BDPs-III（11.782 mg/mL）＜BDPs-IV（13.208 mg/mL）＜BDPs-II（16.264 mg/mL）。由此可見BDPs-I對于α-淀粉酶抑制效果最優。

2.7 不同產地BDPs對RIN-m5F胰島細胞的保護作用

2.7.1 建立GLTy胰島細胞模型

由圖10可知，當誘導劑濃度不變（葡萄糖終濃度為22.5 mmol/L，棕櫚酸終濃度為0.1 mmol/L），高糖高脂雙誘導劑作用12 h后，細胞存活率相比NC組顯著上升（P＜0.05）。之后隨著建模時間延長，相比NC組細胞存活率顯著降低（P＜0.01）。當誘導劑不變，雙誘導劑作用24 h后，細胞存活率為（53.3±5.01）%，顯著低于NC組（P＜0.01），且其值接近50%，后續可采用該條件建立GLTy胰島細胞模型。隨著后續時間延長至36～48 h后發現細胞存活率顯著低于NC組，且值遠小于50%，故不考慮其作為GLTy胰島細胞模型建模條件。

圖10 結合高糖高脂雙誘導RIN-m5F細胞GLTy模型篩選Fig.10 Determination of culture time for induction of GLTy in RIN-m5F cells by glucose and palmitic acid

2.7.2 BDPs對GLTy誘導胰島細胞活性影響

如圖11所示，通過高糖高脂聯合誘導24 h后，與NC組相比，MC組細胞存活率顯著降低（P＜0.05），說明GLTy細胞模型具有一定的可靠性和穩定性。通過不同產地BDPs干預后，細胞存活率均顯著高于MC組細胞（P＜0.01），同時經不同產地BDPs干預后，細胞存活率均高于NC組細胞（P＞0.05），其中BDPs-I組細胞存活率高達（105.47±3.32）%。由此可知不同產地BDPs對GLTy誘導的胰島損傷細胞均具有促進胰島細胞生長作用，其中BDPs-I其增殖效果最優。

圖11 BDPs對RIN-m5F胰島細胞的增殖活性Fig.11 Proliferation-promoting effect of BDPs on RIN-m5F cells subjected to glucolipotoxicity

2.7.3 BDPs對GLTy誘導胰島細胞ROS和TNF-α水平影響

如圖12所示，高糖高脂的糖脂毒性作用于細胞后，細胞內ROS和TNF-α水平明顯增加，顯著高于NC組（P＜0.01）。經過不同產地BDPs組干預24 h后，細胞內ROS和TNF-α水平相比模型組有顯著下降趨勢（P＜0.05）。不同產地BDPs干預后可抑制ROS和TNF-α產生，其ROS抑制效果按優劣排序依次為：BDPs-V＞BDPs-I＞BDPs-IV＞BDPs-III＞BDPs-II；其TNF-α抑制效果按優劣排序依次為：BDPs-I＞BDPs-V＞BDPs-II＞BDPs-III＞BDPs-IV。通過對ROS和TNF-α抑制優劣可知，不同BDPs對ROS和TNF-α抑制產生效果存在較大差異，其中BDPs-V對ROS水平的抑制產生作用最強，BDPs-I對TNF-α水平的抑制效果最優。由此說明高糖高脂誘導細胞使胞內ROS和TNF-α水平升高，經不同產地BDPs干預后可以降低GLTy損傷的RIN-m5F細胞內ROS和TNF-α水平，可抑制GLTy造成的細胞氧化損傷。

圖12 BDPs對ROS水平（a）和TNF-α質量濃度（b）的影響Fig.12 Effects of BDPs on ROS levels (a) and TNF-α concentrations (b)

2.7.4 細胞形態學觀察

如圖13所示，未經處理的NC組RIN-m5F胰島細胞整體呈聚集圓球狀或梭狀；經高糖高脂誘導24 h后MC組RIN-m5F胰島細胞發生皺縮及細胞潰爛導致細胞凋亡，細胞密度逐漸降低等細胞形態變化。然而經過不同產地BDPs干預后，細胞形態逐漸恢復，細胞密度明顯增加，細胞邊界逐漸變圓滑。這表明不同產地BDPs對受損胰島細胞具有促進細胞增殖、抗糖脂毒性能力。

圖13 BDPs干預后的RIN-m5F細胞形態圖Fig.13 Morphological changes of RIN-m5F cells after BDP interventions

2.8 相關性分析

通過化學方法測定不同產地中多糖、糖醛酸、蛋白及還原糖質量分數，結合各產地單糖組成進行相關性分析，結果如圖14a所示，僅有Man與多糖、糖醛酸質量分數間呈現較強的正相關性，相關系數分別為0.52、0.54，其中多糖質量分數與Fuc、Xyl、Glc-UA等單糖存在較強的負相關性，Glc、Gal-UA與糖醛酸質量分數呈現較強的負相關性。除Fuc、Xly與蛋白質量分數呈現較強的負相關性外，其余單糖與蛋白質量分數間相關性較弱。還原糖質量分數與單糖組成間存在較強的相關性，尤其是Fuc、Xly、Glc-UA，其與還原糖呈現較強的正相關性，相關系數均大于0.66，其余單糖與還原糖間存在較弱的相關性。

圖14 多糖化學組成、降血糖活性與單糖組成相關性熱圖Fig.14 Heatmaps of correlation between monosaccharide composition and chemical composition and hypoglycemic activity

為探明BDPs中單糖質量分數與降血糖活性間的關系，將二者數據進行相關性分析研究。如圖14b所示，BDPs中單糖含量與降血糖活性具有較強的相關性。其中α-葡萄糖苷酶與Glc呈現正相關性，Gal、Rha兩種單糖與α-淀粉酶具有正相關關系，相關系數均在0.65以上，說明當多糖中存在Rha、Gal、Glc等單糖有助于提高其降血糖能力。除此之外，與α-葡萄糖苷酶呈現正相關性的單糖還有Gal-UA和Glc-UA，其余單糖與α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶呈現負相關性且相關性均不顯著。細胞增殖活性與Man、Rha和Gal呈現正相關性，其相關系數分別為0.052（P＞0.05）、0.17（P＞0.05）和0.25（P＞0.05），其余單糖與細胞增殖活性均呈現負相關性，其中Fuc和Xly與細胞增殖活性呈現較強的顯著負相關性，其相關系數均為-0.91（P＜0.05）。細胞ROS水平與單糖Rha、Gal、Glc、Gal-UA、Glc-UA等單糖及糖醛酸含量呈現正相關性，其中與Gal-UA、Gal正相關性較強，相關系數均在0.67以上（P＞0.05），與其余單糖呈現負相關性尤其與Man間負相關較強。細胞TNF-α水平與Fuc、Glc、Xly、Gal-UA、Glc-UA等單糖及糖醛酸含量呈現正相關性，其中Fuc、Xly、Gal-UA具有較強的正相關性，相關系數均大于0.68（P＞0.05），與其余單糖呈現負相關性。由此說明BDPs降血糖活性、細胞增殖活性、ROS水平及TNF-α水平與單糖組成之間存在較強的相關性。

3 討論

本研究中，首先采用化學方法對不同產地BDPs進行化學成分測定說明不同產地黃刺粗多糖中化學組成含量存在較大差異；不同產地粗多糖中單糖組成存有差異。表明各樣品間化學組成和單糖組成及含量與樣品產地、生長環境、果實品質等因素息息相關[28]。于小芳[29]、黃國英[30]等也證實多糖化學組成和單糖組成及含量與其產地有較大關系。

在一定實驗質量濃度范圍內，5 個產地黃刺粗多糖對α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶均有抑制能力，但抑制率均小于阿卡波糖對照組，這可能是與BDPs為粗多糖有關，因多糖未進行純化處理故而導致生物活性不高。李井雷等[31]研究羊肚菌胞外多糖體外降血糖結果，顯示該多糖對α-淀粉酶及α-葡萄糖苷酶抑制率均小于阿卡波糖對照組，在高濃度下抑制率分別達到20%和40%左右，而黃刺粗多糖在高質量濃度下抑制率可達60%左右，說明BDPs降血糖活性優于羊肚菌胞外多糖，而黃刺粗多糖純化后的降血糖活性有待進一步研究。Ji Xiaolong等[27]報道，多糖的降血糖活性與多糖分子質量大小和單糖組成復雜程度有著直接關系，表明多糖分子質量越小，單糖組成種類越多會使得多糖具有更高降血糖活性，這也可能是BDPs擁有較高的降血糖活性的原因之一。

胰島細胞的GLTy是導致其功能障礙的重要原因之一，其與炎癥因子，氧化應激等密切相關[32]，因此，預防胰島細胞凋亡及促進胰島細胞增殖、抑制胰島細胞氧化應激降低炎癥因子水平是防治糖尿病的有效途徑之一。長期暴露于高水平高糖高脂中的胰島β細胞會發生胰島細胞損傷，同時ROS水平及TNF-α顯著升高[33]，這與本文研究結果一致。胡朝恩等[34]發現高糖高脂造成的GLTy會使胰島細胞產生大量炎癥因子和免疫因子，抑制胰島β細胞增殖，導致胰島β細胞功能障礙。本研究中發現結合高糖高脂聯合誘導可成功建立胰島β細胞損傷模型細胞活性，與模型組相比，經BDPs干預后細胞存活率顯著上升，ROS和TNF-α水平顯著下降，其中BDPs-I展現了最優的增殖活性，最大程度降低了TNF-α水平。BDPs-I相比其他產地BDPs樣品對受損胰島β細胞具有更強的增殖作用，同時通過降低ROS和TNF-α水平緩解胰島細胞凋亡，從而達到保護胰島細胞免受GLTy侵擾的目的。

已有研究表明，植物多糖的單糖組成及含量與生物活性有著密不可分的關系，倪力軍等[35]研究發現8 種多糖樣品中，除Glc以外其余單糖與抗氧化活性均具有較強的相關性。黨參多糖對HepG2的細胞活性與其單糖的種類存在相關性，發現含有Gal-UA相對較高的黨參多糖其細胞活性較強[36]。因此，為探究BDPs中單糖含量與降血糖活性間的相關性，本研究通過Pearson相關性分析方法分析BDPs與降血糖活性間的相關性研究，發現Rha、Gal與降血糖活性相關檢測指標（α-淀粉酶抑制率）呈現較強的正相關，推測多糖中含有的Rha、Gal、Gal等單糖有助于提高降血糖能力。Xly與細胞存活率呈現負相關性，其余單糖與細胞存活率相關性較弱，由此推測BDPs其較高的細胞增殖活性可能與多糖高級結構及復雜連接方式有關。Man與ROS呈現較強的負相關，說明Man可有助于抑制ROS積累，提高ROS清除效率，對GLTy損傷的細胞起到較強的保護作用。

4 結論

不同產地BDPs在初級結構表征、體外降血糖活性及細胞水平均存在較大的差異，其中BDPs-I具有優良的化學組成、單糖組成及含量，體現了較優的體外降血糖活性。通過促進細胞增殖、降低ROS水平和TNF-α水平達到保護胰島細胞因受GLTy而造成的細胞凋亡，篩選出最佳產地樣品為BDPs-I。BDPs中單糖含量Rha、Gal與降血糖活性（α-淀粉酶抑制率）存在較強的正相關性，Man與ROS呈現較強的負相關關系。本研究為BDPs在糖尿病治療中的應用提供了一定依據，為BDPs在GLTy胰島凋亡模型引起的糖尿病防治中的推廣應用奠定了基礎。