產酯酶格氏乳球菌的篩選、鑒定與基因組注釋

陳 聰，鄒 偉,2, ，湯秀娟,3，陳曉松，吳成澤

（1.四川輕化工大學生物工程學院，四川 宜賓 644005；2.釀酒生物技術及應用四川省重點實驗室，四川 宜賓 644005；3.樂山職業技術學院，四川 樂山 614000）

酯酶是一類催化酯水解反應和酯合成反應的酶，主要包括脂肪酶、磷脂酶和酯合成酶。酯酶具有生物膜信號傳導、脂質降解和酯類化合物合成的功能，包括催化短鏈脂肪酸與醇發生酯合成、酯交換反應以及組合的酯發生酯水解反應[1-2]。同時酯酶也具有催化特性和底物選擇性，可以在不同的發酵食品中合成風味各異的酯化產物[3-5]。動植物及微生物等分泌的酯酶被廣泛應用于工業酯化物生產，其中微生物源酯酶在食品、化妝品、醫藥及造紙工業中應用最廣[6-10]。在產酯酶微生物的研究中，主要以霉菌、酵母和部分細菌為對象[11-12]。在白酒釀造過程中，霉菌和酵母等微生物合成的酯酶具有一定的特異性，容易將不需要分解的化合物分解，這可能會影響產品的口感和品質[13]。與霉菌和酵母相比，細菌的生長周期較短，它們合成酯酶速率也比較快，在白酒釀造中，在獲得最大的酯酶產量時可以提高生產效率和節約成本[14-15]。

由于酶法合成小分子脂肪酸酯具有高效、無污染、專一性強以及低雜質含量等優點[16-17]，這將為酯酶工業化生產應用于白酒產業提供了有利條件。酯酶作為白酒酯類化合物生產的重要催化劑，酶種類和酶活力決定著白酒的品質。研究表明，對酯酶的序列注釋和作用機理深入了解和對催化條件進行不同程度優化，可以有效提高釀酒過程中酯類物質的含量，從而改善酒的品質[18]。此外，產酯酶細菌可使黃水、酒糟、酒尾等副產品轉化為酯化液等附加值產物，應用到白酒釀造過程中可增加酯化物含量，從而改善其口味和風味[19-20]。目前，盡管關于酯酶研究不斷取得進展，但酯酶需求和生產成本仍然很高。因此，篩選高產酯酶細菌對豐富白酒微生物資源具有重要意義，有望提高白酒的品質和滿足更廣范圍的酯酶需求。

本研究從濃香型白酒大曲中篩選出一株高產酯酶的菌株S5-4，利用形態學、生理生化和分子生物學對其進行鑒定，通過基因組測序與功能基因組注釋對菌株S5-4的產酯酶信息和產酯化物代謝路徑進行深入研究，為其進一步開發利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大曲：四川某濃香型酒廠成品大曲。

篩選培養基[21]：牛肉膏3 g/L、蛋白胨10 g/L、氯化鈉5 g/L、3%聚乙烯醇-三丁酸甘油酯乳化液20%、制霉菌素質量濃度25 μg/mL，自然pH值。

3%聚乙烯醇-三丁酸甘油酯乳化液：將3%聚乙烯醇與三丁酸甘油酯以體積比4∶1的比例均勻混合。

種子液培養基[22]：牛肉膏3 g/L、蛋白胨10 g/L、氯化鈉5 g/L，自然pH值。

發酵培養基：葡萄糖20 g/L、牛肉膏20 g/L、氯化鈉5 g/L，pH 7.0。

產酯培養基：葡萄糖20 g/L、氯化鈉5 g/L、酵母膏5 g/L、蛋白胨10 g/L、牛肉膏10 g/L、L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5 g/L、乙酸鈉3 g/L、淀粉1 g/L、無水乙醇50 mL/L、1%生物素20 g/L，pH 6.8。

固體培養基為對應培養基加入2%的瓊脂、乙醇和1%生物素，過0.22 μm有機相濾膜除菌，上述培養基在121 ℃滅菌20 min。

三丁酸甘油酯、聚乙烯醇、制霉菌素、丁酸、己酸（分析純）上海麥克林生化科技有限公司；牛肉膏、蛋白胨 北京奧博星生物技術有限責任公司；瓊脂粉、葡萄糖、氯化鈉（分析純）成都市科隆化學品有限公司；乙酸正丁酯、乙酸乙酯、乳酸乙酯（色譜純）上海阿拉丁生化科技股份有限公司；0.22 μm有機相濾膜尤尼柯（上海）科學儀器有限公司。

1.2 儀器與設備

HZ150L型恒溫培養搖床 武漢瑞華儀器設備有限責任公司；VEGA3 SBU電子掃描顯微鏡 捷克TASCAN公司；MJ-250恒溫培養箱、TG-16醫用離心機四川蜀科儀器有限公司；SW-CJ2D超凈工作臺 上海蘇凈實業有限公司；HYQX-III厭氧培養箱 上海躍進醫療器械有限公司；TSQ8000氣相色譜-質譜（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）聯用儀 美國Thermo Fisher公司；ABI-2720聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國Applied Biosystems公司。

1.3 方法

1.3.1 產酯酶菌株篩選

1.3.1.1 富集液培養

從大曲樣品中取樣，混合并研細，稱取5 g研磨樣品于盛有45 mL生理鹽水的三角瓶中，28 ℃、150 r/min振蕩培養2 h，靜置30 min。

1.3.1.2 產酯酶菌株的初篩

將制備好的富集液在無菌條件下稀釋為10-1～10-7（稀釋梯度）菌懸液，取200 μL涂布于篩選培養基平板，每個梯度設置3 個平行。在37 ℃恒溫培養箱中培養3 d，觀察菌落周圍是否有透明圈（以D/d比值（細菌透明圈直徑與菌落直徑之比）表示）并做好記錄。選取透明圈較大的菌落在篩選培養基上分離純化，并做好斜面保存。

1.3.1.3 種子液的制備

接種斜面保藏的純種菌株于裝有10 mL種子液培養基的試管中，180 r/min、28 ℃的搖床活化12 h，再轉接于裝有100 mL種子液培養基的250 mL搖瓶中，180 r/min、28 ℃二次活化12 h，得到目的菌株種子液，備用。

1.3.1.4 產酯酶菌株的復篩及粗酶液的制備

挑取單菌株接種于25 mL種子液培養基中，置于37 ℃、180 r/min搖床培養24 h，同上條件連續活化3 次，吸取0.8 mL活化液加入1 mL 40%甘油的甘油管中，于-80 ℃冰箱中保存，同時做好斜面保藏。轉接5 mL上述活化種子液于50 mL發酵培養基，37 ℃、180 r/min搖床培養2 d后，吸取4 mL發酵液經5 000 r/min離心10 min，將上清液（即為粗酶液）保存在4 ℃條件中，備用。

1.3.1.5 酯酶活力的測定

測定方法[23]：量取4 mL 3%聚乙烯醇-三丁酸甘油酯乳化液與5 mL磷酸緩沖溶液（0.025 mol/L、pH 7.5）于錐形瓶中混勻，置于40 ℃水浴鍋中預熱大約5 min，加入1 mL提前制備好的粗酶液反應15 min后取出錐形瓶，繼續加入15 mL 95%乙醇溶液，滴加2～3 滴酚酞指示劑（5 g/L），使用NaOH標準溶液（0.05 mol/L）滴定（溶液由黃色變為無色，再變為粉紅色，以溶液變為粉紅色且30 s內不褪色為滴定終點），同時空白組加入等量滅菌后的無菌水，按照實驗組的步驟，對空白組進行滴定，分別記錄消耗的NaOH標準溶液體積。酯酶活力計算公式如下：

式中：V1為實驗組消耗的NaOH溶液體積/mL；V2為空白組消耗的NaOH溶液體積/mL；n為稀釋倍數；t為反應時間/min。

酯酶活力定義：40 ℃、15 min水解4 mL 3%三丁酸甘油酯乳化液所需的酶量為1 個酶活力單位（U）。

1.3.2 菌株形態學觀察與生理生化鑒定

1.3.2.1 菌株形態學觀察

將篩選出產酯酶活力最高的菌株接種至固體培養基中，35 ℃恒溫培養1 d。觀察菌落大小、顏色、表面形態、邊緣形狀、質地等，并記錄觀察結果。革蘭氏染色后，使用光學顯微鏡觀察菌株形態。

取培養對數期的種子液，5 000 r/min離心5 min，收集足量離心菌體。加入2.5%的戊二醛溶液（與菌體的體積比為40∶1），4 ℃條件下固定4～12 h；再次離心，用0.1 mol/L的磷酸緩沖液混勻，5 min后，使用同上轉速清洗2～3 次，收集菌體；用體積分數30%、40%、50%、70%、80%、90%、100%的乙醇溶液逐級脫水，每次15 min，5 000 r/min離心5 min；用體積比1∶1的乙醇-叔丁醇置換2 次，每次離心20 min，最后加入等體積的叔丁醇混勻，放入-80 ℃冰箱冷凍12 h以上，并檢查是否完全干燥[24]。將生長指數階段菌株樣品混勻呈粉末狀，取樣噴金，進行掃描電子顯微鏡觀察。

1.3.2.2 菌株生理生化特征測定

參照第8版《伯杰氏細菌鑒定手冊》，對篩選的菌株進行生理生化實驗，確定菌株種屬。

1.3.2.3 菌株的分子生物學鑒定

目的菌株在篩選培養基中分離純化得到單菌落，培養3 d后送至上海派森諾生物科技有限公司進行菌種鑒定。菌株基因組DNA提取：菌株在篩選培養基上劃線至培養出單菌，培養3 d后，按照細菌基因組快速提取試劑盒操作說明書提取菌株S5-4 DNA。采用細菌通用引物27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）、1492R（5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’）對目的菌株的16S rDNA基因序列進行PCR擴增，擴增體系：基因組DNA 1 μL、10×Buffer 5.01 μL、Taq聚合酶1 μL、dNTP 1.0 μL、引物1.5 μL、去離子水39 μL。反應條件：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，72 ℃終延伸7 min，循環35 次。取目的菌種純化后的PCR產物，使用ABI3730-XL測序儀進行DNA測序，將拼接結果提交至美國國家生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）的GenBank數據庫中進行BLAST同源性比對搜索，選擇13 株同源性較高菌株的16S rDNA基因序列，用MEGAX軟件，依據MEGA中的模型查找選擇和距離評估后選擇最大似然法（maximum likelihood，ML）構建系統進化樹[25]。

1.3.3 格氏乳球菌全基因組測序和注釋

1.3.3.1 基因組測序和組裝

目的菌株全基因組測序方法采用鳥槍法，該方法在Illumina NovaSeq測序平臺完成。所測得的數據使用Solexa管道計算Q值用于檢測數據的質量，再FastQC對數據進行質量評估（堿基質量和堿基含量）。為了去除帶接頭和低質量的reads，采用AdapterRemoval[26]管道去除3’端的接頭污染，用SOAPec[27]管道基于K-mer頻率對所有reads進行質量校正，校正所采用的K-mer設置為17。基因組序列組裝采用A5-MiSeq[28]和SPAdes[29]管道對去除接頭序列的測序數據進行從頭拼裝，構建contig和scaffold。對得到的拼裝結果進行評估和比較，使用Pilon[30]軟件進行堿基校正。

1.3.3.2 格氏乳球菌S5-4全基因組注釋和酯酶分析

使用CGView的循環基因組可視化工具進行功能注釋[31]，以獲取該菌的全基因組信息，包括編碼蛋白質的基因、轉運RNA（transfer tRNA，tRNA）、核糖體RNA（ribosomal RNA，rRNA）、開放閱讀框（open reading frame，ORF）等，并分析其GC含量。組裝后的基因組序列使用RAST和Cell-PLoc[32]工具注釋，得到基因組編碼蛋白信息和酶的亞細胞定位，將RAST注釋結果中的全基因組氨基酸序列文件通過KAAS注釋，根據注釋出的KO（KEGG Orthology）號在京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）中構建目的菌株的代謝路徑[33]。在RAST的注解文件中，獲得酯酶的氨基酸序列；利用Gpos-mPLoc[32]軟件對其進行亞細胞定位，并結合ClustalOmega[34]和Espript3.0[35]的多片段比對，對其進行系統進化分析。在KOBAS-i中，用該菌株全因組測序文件對Exp-data Enrichment功能對重要代謝途徑進行KEGG功能富集注釋[36]。找到目的菌株的中心碳代謝、氨基酸代謝和脂肪酸代謝，分析主要路徑中的生產酯類物質的基因、酶和反應。采用Blastp本地比對軟件，在TCDB數據庫中對格氏乳球菌轉運蛋白進行注釋[37]，從中選擇與乙酸、乳酸、乙醇等代謝相關的轉運蛋白。

1.3.4 菌株S5-4產酯化物代謝通路重建的驗證實驗

菌株S5-4制備成種子液后，以5%接種量加入100 mL產酯培養基的厭氧瓶中。35 ℃厭氧發酵15 d后，用一次性的注射器吸取適量發酵液于0.22 μm有機相濾膜過濾；取1 mL濾液裝于進樣瓶中，加入10 μL乙酸正丁酯混勻，利用GC-MS法和內標法進行定性定量檢測發酵液中乙酸乙酯、丁酸乙酯、乳酸乙酯和己酸乙酯的情況。每個樣品3 組平行檢測。

GC條件：DB-WAX UI譜柱（30 mm×0.25 mm，0.25 μm），程序升溫40 ℃保持1 min，以20 ℃/min升高至150 ℃，再以10 ℃升高至250 ℃，保持2 min。分流比30∶1，載氣為氦氣（He），流速1 mL/min，氫氣（H2）40 mL/min，氧氣（O2）300 mL/min，檢測器為火焰離子檢測器。

MS條件：電子電離源，傳輸線溫度250 ℃，電子能量為70 eV，光電倍增管電壓為350 V，質量掃描范圍為30～350 u。

1.4 數據處理與統計分析

圖片合成和代謝途徑由Adobe Illustrator CS6完成。柱狀圖使用Origin 2021制作。GC-MS原始譜圖采用Thermo Scientific Xcalibur進行峰提取和匹配。

2 結果與分析

2.1 大曲中產酯酶細菌的初篩

采用傳統的稀釋涂布法，富集液被涂布于三丁酸甘油酯篩選平板上，酯酶與三丁酸甘油酯反應形成的透明圈大小代表菌株的酯酶活力高低。初篩共計篩選出50 株產酯酶的菌株。結果如圖1所示，產酯酶菌株的D/d值在1.05～2.27，其中最高的11 株產酯酶菌株的D/d為1.35～2.27，菌株S5-4的D/d值最高，為2.27±0.02。

圖1 產酯酶細菌D/d值Fig.1 D/d ratio of esterase-producing strains

2.2 產酯酶細菌的復篩

對初篩結果中D/d值較大的菌株按照1.3.1.5節中的方法進行酯酶活力的測定。測定結果如表1所示，菌株產酯酶活力在10.75～15.74 U/mL，且與初篩時的D/d值較為對應。菌株S5-4的酯酶活力最高，為（15.74±0.03）U/mL。后續實驗確定以菌株S5-4為研究對象，對其進行形態學、生理生化和分子生物學鑒定。

表1 產酯酶細菌D/d及其活力Table 1 D/d ratio and esterase activity of 11 selected isolates

2.3 產酯酶細菌的鑒定

2.3.1 菌株S5-4的形態觀察

在三丁酸甘油酯平板上培養1 d后，菌株S5-4的菌落呈乳白色，表面光滑，菌落規則，邊緣整齊，中間低凸起，菌落周圍與邊緣顏色一致，半透明，質地濕潤黏稠（圖2a）。經過革蘭氏染色，于100（物鏡）×10（目鏡）倍光學顯微鏡下觀察，菌株S5-4呈革蘭氏陽性（紫色），圓球狀，無芽孢（圖2b）。用掃描電子顯微鏡放大1 000 倍觀察菌株S5-4，菌體形態顯示為球狀或球桿狀，排列方式為散落、成對或成短鏈，兩端鈍圓，部分兩端稍尖，無夾膜和芽孢（圖2c）。

圖2 菌株S5-4形態觀察Fig.2 Morphological observation of strain S5-4

2.3.2 菌株S5-4的生理生化鑒定

對菌株S5-4進行伯杰氏手冊標準的生理生化實驗，結果如表2所示，發現菌株S5-4的甲基紅試驗、D-葡萄糖試驗、V-P試驗均為陽性；吲哚試驗、硝酸鹽還原試驗、淀粉水解試驗均為陰性。依據菌株形態觀察、顯微鏡觀察和生理生化鑒定，確認菌株S5-4為Lactococcus屬。

表2 菌株S5-4的生理生化鑒定結果Table 2 Physiological and biochemical identification results of strain S5-4

2.3.3 菌株S5-4的分子生物學鑒定

為研究菌株S5-4系統進化關系，使用MEGA X計算機軟件的ML法構建系統進化樹。結果如圖3所示，菌株S5-4與格氏乳球菌（Lactococcus garvieae）的系統發育分支最相近；結合形態學鑒定、生理生化實驗和掃描電子顯微鏡觀察的菌株形態，最終確定菌株S5-4為格氏乳球菌，將其命名為L.garvieaeS5-4。本實驗中篩選出的L.garvieaeS5-4已保藏于廣東省微生物菌種保藏中心，保藏編號：GDMCC No:63054。

圖3 菌株S5-4基于16S rDNA序列的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequence of strain S5-4

2.4 格氏乳球菌S5-4基因組測序與功能注釋

通過Illumina NovaSeq測序平臺對目的菌株進行了全基因組測序，利用FastQC對數據進行質量控制，結果表明每個reads的單堿基質量都在36以下，4 種堿基的分布線平行且接近，高質量reads占總reads 98.05%，含有1 235 034 660 bp。對所有高質量reads進行基因組組裝，得到45 個Contig，共2 191 113 bp序列信息，用于衡量基因組拼接效果的N50大小是148 761 bp。目的菌株基因組通過RAST和CGView基因組注釋顯示GC平均相對含量37.99%，包括1 486 個基因，其中包含4 個rRNA、69 個tRNA和34 個非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA）基因（圖4、表3）。同時，通過RAST注釋基因組中酯酶的信息，并對酯酶進行亞細胞定位，發現其中酯酶主要包括磷酸酯酶（胞內酶5 個和細胞膜酶2 個）、酰基輔酶A脫酰酶（胞內酶）、丙酸三酯酶（胞外酶）、羧酸酯酶（胞外酶）和木聚糖酯酶（胞內酶）。通過酯酶蛋白序列比較，發現格氏乳球菌丙酸三酯酶序列明顯不同于酵母和霉菌（圖5），與霉菌酯酶的系統發育樹分支相距較遠，但它在親緣分布關系上與酵母酯酶更為接近（圖6）。

表3 L.garvieae S5-4基因組注釋信息表Table 3 Genome annotation of L.garvieae S5-4

圖4 L.garvieae S5-4基因組信息圖Fig.4 Genome map of L.garvieae S5-4

圖5 格氏乳球菌和酵母菌、霉菌的酯酶序列比對Fig.5 Alignment of esterase gene sequences from L.garvieae,yeast and mold species

圖6 格氏乳球菌與霉菌、酵母菌的酯酶蛋白序列系統發育樹Fig.6 Phylogenetic tree based on esterase protein sequences from L.garvieae,molds,and yeasts

使用KAAS注釋基因組信息構建L.garvieaeS5-4的代謝路徑，主要包括碳水化合物代謝（140）、氨基酸代謝（48）、核苷酸代謝（47）和輔酶和維生素代謝（38），這些不同途徑的聚類被展示在圖7中。通過KEGG重建該菌利用半乳糖和淀粉作為碳源合成乙酸乙酯和乳酸乙酯的途徑（圖8）。L.garvieaeS5-4能夠利用異淀粉酶（胞外酶）、α-淀粉酶（胞內酶）和糊精轉糖基化酶（胞內酶）水解淀粉生產葡萄糖。葡萄糖通過糖酵解代謝途徑，在糖酵解過程中被分解成丙酮酸。丙酮酸可以通過不同的途徑轉化為乳酸、乙酸以及乙醇，其中乳酸是在乳酸脫氫酶（EC：1.1.1.27）的作用下合成，乙酸則需要經過丙酮酸氧化酶（EC：1.1.3.3）和乙酸激酶（EC：2.7.2.1）合成，而乙醇則需要經過磷酸乙酰轉移酶（EC：2.3.1.8）、乙醛脫氫酶（EC：1.2.1.10）和乙醇脫氫酶（EC：1.1.2.8）合成。乳酸、乙酸和乙醇分別通過乳酸轉運蛋白（TC：1.A.14.2.2）、乙酸轉運蛋白（TC：3.B.1.1.1）和乙醇轉運蛋白（TC：3.A.1.103.5）轉運蛋白運輸到細胞外，在羧酸酯酶（胞外酶）的作用下生成乳酸乙酯和乙酸乙酯。格氏乳球菌乳酸乙酯和乙酸乙酯的代謝合成路徑的解析對于進一步開發該菌在白酒中的應用提供了依據。

圖7 L.garvieae S5-4各類功能KEGG富集圖Fig.7 KEGG enrichment map for various functional categories of L.garvieae S5-4

圖8 格氏乳球菌的代謝路徑Fig.8 Metabolic pathways of L.garvieae

2.5 菌株S5-4厭氧發酵產酯

將L.garvieaeS5-4制備成種子液，厭氧發酵15 d后，對發酵液進行GC-MS分析，結果表明，乙酸乙酯產量為（0.345 0±0.160 0）g/L，乳酸乙酯產量為（0.298 3±0.230 0）g/L。程偉等[38]從白酒釀造過程中篩選的酵母菌產乙酸乙酯量為0.248 9 g/L，與之相比較，L.garvieaeS5-4通過厭氧發酵產酯量提高了38.6%。根據菌株純培養結果也驗證了對L.garvieaeS5-4代謝路徑酯合成產物的分析，它能夠利用自身的合成乙酸、乙醇和乳酸生成乙酸乙酯和乳酸乙酯。

3 討論

以往的研究多集中于產酯酶微生物的發酵條件和酶學性質[39]，但很少從全基因組層面和代謝途徑上解析它們的機理。本實驗從基因組信息注釋和代謝路徑上分析了L.garvieaeS5-4生產酯類化合物的機理，進一步了解酯酶的代謝特性。通過對該菌株代謝路徑的重建及驗證分析，發現它能夠以半乳糖和淀粉為碳源在細胞內生產乙酸、乙醇和乳酸和在細胞外合成乙酸乙酯和乳酸乙酯。目前已有研究表明，在窖泥和大曲中初篩細菌酯酶活力最高分別能達到10.43 U/mL[22]和12.52 U/mL[40]，本實驗初步篩選出的L.garvieaeS5-4菌株，其酯酶活力可達15.74 U/mL。在后續的研究中，還可以利用正向突變技術，對發酵條件進行優化（如溫度、pH值、接種量、培養時間等），提高酯酶活性，并對其代謝途徑進行調節，從而提高酯類化合物的產量。

酯類化合物的含量是白酒風味物質評價的重要指標，主要包括己酸乙酯、乙酸乙酯、乳酸乙酯和丁酸乙酯[41]。前期研究中，霉菌、酵母菌和一些細菌被作為篩選酯酶的對象，通過增加產酯酶的效率來提升大曲的質量和白酒的香味[42]。本實驗將產酯酶L.garvieaeS5-4菌株作為篩選對象，用于發酵過程中，以提高發酵液的酯含量。與霉菌、酵母菌相比，它的生產周期較短，與其他細菌相比，它的酯酶活力較高，在提高白酒中酯類物質含量方面有較大應用價值。此外，還可以將其接種于白酒發酵過程產生的副產物（酒糟和黃水）中進行二次發酵[43]，生產酯類化合物，從而提升白酒的口感和質量[20]。因此，篩選具有較高酯酶活性的細菌并利用這些副產物資源生產酯類化合物對白酒生產具有一定的科學研究意義和經濟效益。

從濃香型白酒大曲中篩選出了1 株具有較強酯酶活性的菌株S5-4，產酯酶活力達到15.74 U/mL，經鑒定為格氏乳球菌（L.garvieae）。基因組注釋顯示，該菌株能夠合成磷酸酯酶、酰基輔酶A脫酰酶、丙酸三酯酶、羧酸酯酶和木聚糖酯酶，根據酯酶編碼基因設計和構建基因工程策略或調控酯酶活性相關的代謝通路中關鍵酶提高該菌株的酯酶活性。代謝途徑構建顯示，S5-4菌株具有利用淀粉和乳糖合成乳酸、乙酸和乙醇的能力，并能在酯酶作用下合成乳酸乙酯和乙酸乙酯。發酵實驗證實該菌乙酸乙酯產量為（0.345 0±0.160 0）g/L，乳酸乙酯產量為（0.298 3±0.230 0）g/L。本研究為L.garvieaeS5-4的生理特性研究和進一步開發應用提供了參考。