環狀RNA在草食家畜肌肉中的研究進展

吳子賢，李蘊華，田 瑛，李秀男，趙艷紅，劉佳森

（1.內蒙古自治區農牧業科學院畜牧研究所，呼和浩特 010031；2.內蒙古農業大學動物科學學院，呼和浩特 010018）

家畜肌肉的生長發育是一個復雜的、多階段的過程，受多種因素尤其是肌肉發育相關基因的調控。近年來的研究發現，環狀RNA（circRNAs）廣泛參與細胞增殖、細胞分化和機體發育（包括肌肉發育）。有關circRNA 對家畜肌肉發育的影響目前已成為該領域的研究熱點。本文簡要介紹了circRNAs 的發現、功能以及在家畜肌肉發育中的影響，以期為豐富家畜育種和提高家畜經濟性狀提供參考。

1 circRNA的發現

circRNAs是一類由非規范剪接事件產生的非編碼RNA，被稱為反剪接。在反向剪接過程中，下游的剪接供體位點與上游的剪接受體位點共價連接。circRNA是一種閉合環狀RNA，可以穩定存在于生物體中，但它不具有5’端帽結構和3’端聚（a）尾結構［1］。早在20世紀七八十年代，研究者就在Nature 和PANs 中提出circRNA 是一種共價封閉的環狀RNA 分子。根據circRNA 的序列組成，可將其分為3 種類型：外顯子來源的circRNA，內含子來源的circRNA 和外顯子-內含子circRNA。Cao 等［2］在羊的骨骼肌環狀RNA 文庫中發現了886種內含子和外顯子形式的環狀RNA，其中大多數circRNA 和參與肌肉生長發育的肌肉特異性miRNA相互作用，尤其是circ776。但是，關于其他類型的circRNA 調節肌肉發育的報道很少。因此，需要進一步研究和突破。

2 circRNA的功能

circRNA 長期以來被認為是具有調節效力的非編碼RNA（ncRNAs）［3］，可以在其合成位點與宿主基因結合，并通過形成RNA-DNA 雜合體（R 環結構）導致轉錄暫停或終止，從而上調外顯子跳過或截短轉錄本。大量的研究證實，circRNA 通過充當ceRNA 或miR 海綿發揮生物學功能［4-5］。但鑒于circRNA 豐度普遍較低，結合位點數量有限，circRNA 如何檢測及怎樣充分發揮作用尚不清楚。Schuller 等［6］認為，circRNAs 也可以與蛋白質相互作用，其翻譯過程由核糖體完成，涉及起始、延伸、終止和核糖體循環。Zhao 等［7］研究發現，真核mRNAs 的起始包括從5'cap 近端連接點到起始密碼子的43s 預起始復合物的掃描，然后是核糖體亞單位連接和因子置換。由于缺乏5'帽和3'尾，circRNA只能采用不依賴帽的方式，由circRNA 編碼的肽通常被截斷，其功能大部分類似于全長蛋白質對應物（circFBXW7-185aa）［8］。然而，一些源自circRNA 的蛋白質發揮的功能獨立于宿主基因，甚至與宿主基因產物的功能相反（circFNDC3B-218aa）［9］。該結果拓寬了人類蛋白質組的范圍。然而，circRNA 翻譯的調控機制以及延伸和終止的過程仍不完全清楚。

3 circRNA對家畜肌肉發育的影響

肌肉發育是一個非常復雜的生物學過程，主要依賴于肌纖維細胞的增殖和肥大［10］。研究表明，肌纖維的數量只在出生前增加，出生后變化不大，而且肌纖維的生長依賴于肌纖維的肥大［11］。肌纖維的肥大包括兩個方面：一是肌原纖維增多，二是肌纖維中的細胞核數目增多［12］。成肌細胞分化的生理過程，受包括PUR 蛋白家族在內的復雜分子網絡調控。PUR蛋白家族由轉錄因子富含嘌呤元件結合蛋白α（Purine-rich element binding protein alpha，PURα）和富含嘌呤元件結合蛋白β（Purine-rich element binding protein alpha，PURβ）組成，兩者在形成肌管中起著重要作用。PURα 和PURβ可以結合到MHC 的啟動子區域，抑制MHC 的轉錄和MHC蛋白的產生，從而抑制肌源性分化。circSamd4直接與PURα 和PURβ 結合，阻止其進入細胞核，間接促進肌肉細胞分化。肌肉發育是一個由多個基因調控的多步驟過程，它不僅受多種肌源性調控因子的調控，包括肌細胞生成素（Myogenin，MyoG）、肌源性調控因子-4（Cleregulatoryfactors-4，MRF-4）、肌球蛋白重鏈（Myosin heavy chain，MyhC）、成肌細胞調節因子家族成肌因子-5（Myogenic factor 5，Myf-5）、肌生長抑制素（Myostatin，MSTN）、肌細胞增強因子2A-D（Myocyte enhancer factor 2A-D，MEF2A-2D）、成肌分化抗原（Myogenic differentiation Antigen，MyoD）和配對盒（Paired box gene，Pax）家族成員Pax 3 和Pax 7［13］，也受其他相關基因的調控，如胰島素樣生長因子-I（Insulin-like growth factors-I，IGF-I）、胰島素樣生長因子-II（Insulin-like growth factors-II，IGF-II）、叉頭盒轉錄因子01（Forkhead box O1，Fox01）和哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（Mechanistic target of rapamycin kinase，mTOR）［14］。此外，研究證實，影響肌肉發育的基因有兩種調節作用：一種是正向促進，另一種是反向抑制［13，15-16］。這些生長因子在調節肌肉發育中發揮著獨特的作用，可以調節肌肉中許多部位的細胞增殖、細胞凋亡、肌節激活和肌肉特異性基因譜系［17-18］。

據報道，動物肌肉和肌肉細胞中的circRNA 數量在2 000～37 000 之間［19-24］。在前人的研究中，許多circRNA 含有結合位點，如miR-1、miR-133、miR-206、miR-29、miR-378、miR-431［25］、miR-7［26］、miR-135a［27］、miR-1290［28］和miR-876-5p［29］，均在肌生成過程中參與細胞增殖、分化和信號轉導。大量的證據還表明，家畜的肌肉發育確實受到circRNA 和miRNA 的調控。Shen 等［30］的研究證明，極少數circRNA 可以在轉錄和翻譯水平調節家畜肌肉發育。然而，目前該領域幾乎沒有相關研究。因此，circRNA 以不同方式對肌肉發育的相關調控機制備受關注。

4 circRNA在家畜肌肉中的研究進展

4.1 在牛肌肉中的研究

Wei 等［22］的研究結果表明，circLMO7 可以通過競爭性結合miR-378a-3p，增強miR-378a-3p 靶基因HDAC4的表達，促進牛的肌細胞增殖，抑制成肌細胞的分化。Yan 等［31］通過建立RNA 序列文庫，共鑒定了哈薩克牛和新疆褐牛背最長肌樣本中的5 177 個circRNA，發現其中有46 個是差異表達的。差異表達基因的鑒定表明，肌肉發育過程與差異表達的circRNA有關。Wei等［22］首次檢測了牛骨骼肌在兩個發育時期（胚胎期和成年最長?。┑腸ircRNA 表達譜，指出當miR-378a-3p 被下調、靶基因hdac4 被激活，從而促進了肌細胞的增殖，抑制肌細胞分化。Li等［32］研究發現，circFGFR4 和miR-107 在秦川牛胚胎期（90 d）和成年期（24 個月）的背最長肌中高表達，并且circFGFR4 可以吸附miR-107。MiR-107 可通過與過表達的circFGFR4 結合來削弱Wnt3a 的表達。可見Wnt3a 作為miR-107 的靶點，在抑制肌管形成和促進成肌細胞凋亡方面發揮著重要作用。綜上所述，circFGFR4 可以作為miR-107 海綿消除miR-107 對Wnt3a 表達和牛原代成肌細胞分化的抑制作用。Wang 等［33］研究發現，circTTN 可通過與miR-432 競爭性結合激活IGF-II/磷脂酰肌醇3 激酶（PI3K）/AKT 信號通路，進而促進牛成肌細胞的增殖和分化。Li 等［32］研究發現，成年牛肌肉中的circFUT10可以通過競爭性結合miR-133a來降低其對靶基因的抑制作用，并且與肌肉發育相關的MyHC、MyoD和MyoG基因表達在mRNA 和蛋白質水平上與circFUT10 的表達同步變化。circ-FUT10 過表達可促進MyHC表達，誘導成肌細胞凋亡，促進成肌細胞分化。相反，circZfp609 與miR-194-5p 結合抑制bcl2相關轉錄因子1（BCLAF1）的表達，從而影響Myf5 和MyoG 的表達，抑制成肌細胞分化。circSNX29 廣泛存在于牛的原代成肌細胞中，但其在胚胎骨骼肌中的表達水平明顯高于在成年骨骼肌中的表達水平。Peng等［34］研究發現，circSNX29的過表達促進成肌細胞分化并抑制細胞增殖，而干擾circSNX29 會抑制成肌細胞分化并促進增殖。之后的生物信息學預測結果表明，circSNX29 可能吸附到miR-744 上，具有9 個潛在的結合位點。雙熒光素酶檢測結果表明，circSNX29可以直接競爭性結合miR-744，有效逆轉miR-744 對Wnt5a和CaMK II 的抑制作用。通過KEGG 通路富集分析、Western blot、鈣熒光探針和CamK II 活性檢測，發現Wnt5a 和circSNX29 的過表達激活了非經典通路Wnt/Ca2+，通過增加CamK II 激酶的活性和PKC 的磷酸化水平，進而調節牛成肌細胞的增殖和分化。以上研究進一步表明，胚胎期的肌肉發育比成年期更有效。

4.2 在羊肌肉中的研究

Li等［20］的研究結果表明，在胚胎期和成年期哈薩克羊的背最長肌中均有6 113個差異表達的circRNA，circRNA 的母源基因主要富集在肌肉生長發育相關的信號通路中。其中oar_circ_0000385、oar_circ_0000582和oar_circ_0001099 在與肌肉發育相關的miRNA（miR-143、miR-133 和miR-23）上有多個結合位點；在綿羊成年背最長肌（LDM-A）和胚胎背最長肌（LDME）的RNA序列中共發現5 086個差異表達的circRNA。實時熒光定量PCR 結果表明，circRNA 0000552、circRNA 00002456、circRNA 00004666、circRNA00004676和circRNA 00004690 在LDM-E 中的表達量相對高于LDM-A。circRNA 0003451、circRNA 0005243、circRNA 0005250 和circRNA 0005256 在LDM-A 中的表達相對高于LDM-E，證明circRNA 在綿羊肌肉差異表達。Cao等［2］從綿羊骨骼肌RNA 基因庫中提取了7 550 萬個序列，這些序列被映射到綿羊參考基因組中的729個基因，共包含886個circRNA；同時，該研究使用RNA-seq研究了分娩前后綿羊背長肌中的circRNA，共檢測到6 113個circRNA，其中部分circRNA（circRNA100、circRNA108、circRNA205、circRNA606、circRNA678、circRNA744 和circRNA776）含有至少兩個與肌肉發育相關的miRNA保守靶點（miR-29b、miR-133、miR-208和miR-499）。

5 結語

circRNAs 是肌肉發育的新調節劑。然而，目前有關circRNA 的功能注釋主要是預測和分析源編碼基因或可能的miRNA 結合位點。當前的大多數研究都集中在通過ceRNA 共表達調控網絡指導肌肉發育的circRNA 上。此外，一些研究證實circRNA 可以在轉錄和翻譯中調節家畜肌肉發育，只有少數研究表明circRNA 可以直接調節家畜肌肉發育。因此，深入研究circRNA 的形成和類型以及與靶基因的作用機制，探索其生物學功能，對于了解生物體的生長發育和疾病治療具有重要意義。由于circRNA 的多樣性、作用模式的多樣性以及研究方法的限制，尚需要一些時間來闡明這些基因及其調控機制。隨著現代分子生物學技術、新一代測序技術的飛速發展，circRNA 還有其他方法可以調節牲畜的肌肉發育。