基于Hsp70基因的綿羊肺炎支原體TaqMan檢測方法的建立及其遺傳演化分析

江錦秀,張靖鵬,林裕勝,劉維巍,胡奇林,萬春和*

(1.福建省農業科學院畜牧獸醫研究所,福州 350013;2.福建農林大學動物科學學院(蜂學學院),福州 350002)

綿羊肺炎支原體(Mycoplasmaovipneumoniae, Movi)是引起山羊和綿羊發生羊支原體性肺炎(Mycoplasmal pneumonia of sheep and goats, MPSG)的主要病原之一,現被認為是一種分布在全球的家養綿羊和山羊的呼吸道病原體[1-3]。Movi宿主范圍異常廣泛,除山羊和綿羊外,在麝牛、馴鹿、大角羊等野生動物中均檢測到該病原[4-6]。2001年以來,一些進行定期監測的國家報告了該病例,包括瑞典、美國、法國和英國[7-10]。其中在美國453個家養羊場中,88.0%的羊被檢測出Movi[7];在法國,2007—2019年Movi占小反芻動物分離的所有支原體的16.4%[8],2005—2019年,在英格蘭和威爾士,Movi占小反芻動物分離的所有支原體中的50.0%以上[10]。2012—2014年,對中國新疆6個地區羊Movi感染情況調查顯示,血清樣品的平均陽性率為17.8%,鼻拭子和肺組織樣品的平均陽性率分別為10.2%和28.9%[11]。然而,在更多的國家建立全球監測系統進行大規模的流行病學調查之前,Movi感染的真正流行率還不得而知。

已有的研究報道顯示,分離自不同地域、不同宿主來源的Movi的基因存在高度多態性[12-13]。熱休克蛋白(heat shock protein,Hsp70)也稱DnaK,在古細菌和植物到人類的所有生物體中均有發現,是機體內高度保守的生物分子,是生物細胞中含量最高的一種熱休克蛋白,也是Movi重要的膜結構蛋白,具有免疫原性和免疫佐劑效應,其C-端抗原性優勢明顯,可誘導機體產生體液和細胞免疫反應[14-16],是疫苗開發的潛在候選蛋白。Hsp70基因在支原體種內保守,種間差異大[14-15],是分子生物學檢測的重要靶點。由于體內Hsp70的變化與健康和患病狀況相關,因此,它也可作為各種疾病的生理和病理狀況以及藥物靶標的生物標志物[17-19]。為了解Movi的流行情況及遺傳演化規律,本研究建立基于Hsp70基因的Movi TaqMan熒光定量PCR檢測方法,并對福建省Movi分離純化菌株的Hsp70基因進行分析,以期為Movi 臨床診斷提供技術支撐,也為更進一步了解Movi 遺傳演化規律提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株與臨床樣品

山羊支原體山羊肺炎亞種(Mycoplasmacapricolumsubsp.capripneumoniae,Mccp)F38株、山羊支原體山羊亞種(Mycoplasmacapricolumcapricolum,Mcc)、綿羊肺炎支原體(Movi)MO Y98標準株由中國農業科學院蘭州獸醫研究所儲岳峰研究員惠贈;絲狀支原體山羊亞種(Mycoplasmamycoidessubsp.capri, Mmc)、萊氏無膽甾原體(Acholeplasmalaidlawii, AL)、無乳支原體(Mycoplasmaagalactiae, Maga)、偽結核棒狀桿菌(Corynebacteriumpseudotuberculosis, CP)、羊口瘡病毒(orfvirus,ORFV)、牛支原體(Mycoplasmabovis, Mb)由福建省農業科學院畜牧獸醫研究所草食動物病研究中心分離純化并保存。

88份有呼吸道癥狀的山羊鼻拭子樣品及解剖可見肺肝病變或胸膜肺炎癥狀的43份疑似MPSG的肺組織病料均來自福建省部分山羊養殖場。

1.2 主要試劑

Probe qPCR Mix購自寶日醫生物技術(北京)有限公司(TaKaRa);DL2000購自艾科瑞生物技術有限公司;DNA提取試劑盒購自天根生化科技有限公司;病毒DNA/RNA提取試劑盒、2×TransStart?FastPfuFly PCR SuperMix (-dye)以及pEASY?-Blunt3 Cloning Kit試劑盒均購自北京全式金生物技術有限公司;Biospin Gel and PCR Purification Kit購自杭州博日科技股份有限公司。

1.3 TaqMan qPCR檢測方法的建立

1.3.1 引物設計 參考GenBank上登錄的Movi strain 274菌株(登錄號:CP079 199.1)的Hsp70基因保守序列,利用引物設計軟件Oligo 7(v7.37)設計TaqMan qPCR的引物,Hsp70-qF1/R1和探針Hsp70-FAM以及MoviHsp70全基因分段擴增引物Hsp70-F1/R1和Hsp70-F2/R2序列(表1),引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3.2 反應條件優化 將Hsp70基因中位于921～1 400 bp 的序列片段(由生工生物工程股份有限公司合成)插入PUC57載體的N和A酶切位點之間,經篩選后獲得含有Hsp70基因的質粒(命名為Movi-Hsp70)為試驗陽性標準品,利用微量核酸測定儀測定其濃度后,換算成拷貝數,即5.72×107copies·μL-1),用EASY Dilution將標準品進行10倍連續倍比稀釋。按照Probe qPCR Mix試劑盒說明書配制20 μL的TaqMan qPCR反應體系,并對反應體系和擴增條件進行優化,以最高熒光值、最小的樣本閾值循環數(Cq值)確定建立的TaqMan qPCR方法的最佳反應條件。

1.3.3 標準曲線的建立 以Movi-Hsp70不同標準品濃度(5.72×102～5.72×105copies·μL-1)為模板,利用優化后的TaqMan qPCR方法的最佳反應條件,進行TaqMan qPCR擴增反應,獲得擴增動力學曲線。以標準品起始拷貝數的常用對數(lgC)為橫坐標,以循環數閾值(Cq值)為縱坐標,繪制出建立的TaqMan qPCR方法的標準曲線。

1.3.4 靈敏性試驗 用優化后的TaqMan qPCR方法的最佳反應條件,以不同質粒濃度(5.72×102～5.72×10-1copies·μL-1)為模板,每個滴度進行3個平行試驗,同時設陰性對照,確定建立的TaqMan qPCR方法的最低檢測限。同時,利用表1 中的引物(Hsp70-qF1/Hsp70-qR1),經常規PCR擴增,比較二者的敏感性。

1.3.5 特異性試驗 利用細菌基因組提取試劑盒提取牛羊常見病原菌(Maga、AL、Mmc、Mccp、Mcc、Mb、CP)基因組DNA,利用病毒DNA/RNA提取試劑盒對羊口瘡病毒(ORFV)提取基因組DNA。以提取的核酸DNA為模板,用優化后的TaqMan qPCR方法的最佳反應條件,以質粒濃度(5.72×103copies· μL-1)為陽性對照,對這些牛羊常見病原進行TaqMan qPCR擴增反應,評價建立的TaqMan qPCR方法的特異性。

1.3.6 重復性試驗 用優化后的TaqMan qPCR方法的最佳反應條件,以不同質粒濃度(5.72×105、5.72×103、5.72×101copies·μL-1)為模板進行檢測。每種標準品含量設置3個重復,計算組內變異系數(CV)。分別將上述標準品分裝后置于-20 ℃保存,每隔7 d取出,用優化后的TaqMan qPCR方法進行檢測,共檢測3次,計算組間變異系數。

1.4 臨床樣品檢測

用本研究建立的Movi TaqMan qPCR方法及參考林裕勝等[20]建立的基于P113基因的TaqMan qPCR方法對福建省部分山羊場臨床送檢的88份羊鼻拭子樣品及43份疑似MPSG的肺組織病料進行平行檢測,抽取10份檢測結果不符合的樣品用Hsp70-F/R引物進行PCR擴增并測序分析;另外,將檢測結果為Movi陽性的肺組織樣品進行分離鑒定,將分離純化成功的菌株進行Hsp70基因的擴增、克隆和測序。

1.5 Hsp70基因擴增與序列分析

1.5.1Hsp70基因分段擴增及克隆測序 利用基因組DNA提取試劑盒提取Movi分離株DNA。使用設計的Hsp70基因分段擴增引物(表1)進行分段擴增。PCR擴增50 μL體系:2×TransStart FastPfu Fly PCR SuperMix 25 μL,模板5 μL,上、下游引物各1 μL(引物濃度均為10 μmol·L-1),ddH2O 18 μL。PCR擴增條件:94 ℃預變性5 min;94 ℃ 20 s,53 ℃ 20 s,72 ℃ 40 s,35個循環,最后72 ℃延伸10 min。PCR產物經1.0%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定。用PCR產物純化試劑盒回收PCR擴增產物,將其與pEASY?-Blunt3 CloningVector載體連接,轉化感受態Trans1-T1;在SOC培養基中37 ℃振蕩培養1 h,取適量菌液涂布含有X-Gal,IPTG和Amp的LB瓊脂平板,37 ℃過夜培養。挑選白色菌落擴大培養,經過PCR驗證為陽性的菌液送至福州鉑尚生物技術有限公司測序。利用DNAStar7.0軟件中的SeqMan軟件對2個片段的序列進行拼接得到完整的Hsp70基因序列。

1.5.2Hsp70序列及遺傳進化分析 用DNAStar7.0軟件中的MegAlign軟件對從臨床病料中分離到的Movi菌株及18個Movi參考菌株進行基因和氨基酸序列進行分析。利用MEGA 7.0 軟件構建Hsp70基因系統進化樹,分析Hsp70基因的遺傳進化關系。用NetNGlyc-1.0在線軟件預測N-糖基化位點。

2 結 果

2.1 引物和探針分析

從GenBank數據庫中共檢索到24個Hsp70基因序列(21個山羊源Movi菌株和3個綿羊源Movi菌株)。對于正向引物Hsp70-qF1(5′-GTTCTTCTTGTTGGTGGATC-3′)(位于943～962 bp),24個Hsp70基因序列中有23個(95.8%)與設計的正向引物相匹配,只有1個(菌株J1,GenBank登錄號KC693 973.1)有不匹配的序列。對于反向引物Hsp70-qR1(5′-GCCACAACTTCATCAGGATTTATT-3′)(位于1 026～1 049 bp),24個Hsp70基因序列中有20個(83.30%)與設計的反向引物相匹配,只有4個(菌株FJ-36/L16/L17/Y98,GenBank登錄號OP121622/KC693 980.1/KC693 981.1/CP118 522.1)且僅在5′端第3位不匹配。對于探針Hsp70-FAM(5′-ACACGTATGCCAGCTGTTCAGACA-3′)(位置964～987 bp),則與24個Hsp70基因序列均100%匹配。引物Hsp70-qF1和Hsp70-qR1以及TaqMan探針Hsp70-FAM的變化見表2。

表2 綿羊肺炎支原體引物和探針序列變異分析Table 2 Sequence variation analysis of primers and probes of Movi

2.2 優化后的TaqMan qPCR條件

優化后的TaqMan qPCR方法最佳反應體系(20 μL)如下:Probe qPCR Mix 10 μL,上、下游引物(濃度為10 μmol·L-1)各0.4 μL、探針(濃度為10 μmol·L-1)0.4 μL、模板2 μL、補充ddH2O至終體積20 μL。優化出的TaqMan qPCR方法最佳反應條件為:95 ℃預變性2 min;95 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s,40個循環。

2.3 TaqMan qPCR標準曲線的建立

以 Movi-Hsp70標準品作為模板,利用優化后的反應條件進行TaqMan qPCR擴增,獲得擴增曲線(圖1A)。以每個濃度標準品模板中拷貝數的常用對數(lgC)為橫坐標,以出現的循環數閾值(Cq值)結果為縱坐標,獲得基于檢測Movi TaqMan qPCR方法的標準曲線(圖1B)。結果顯示,建立的TaqMan qPCR方法在5.72×102～5.72×105copies·μL-1反應范圍內有很好的線性關系,相關系數為1.00,擴增效率為96.0%,斜率為-3.411,截距為37.29。結果表明建立的TaqMan qPCR方法線性關系良好、擴增效率高。

1～4. 不同稀釋度的質粒(5.72×102～5.72×105 copies·μL-1)1-4. Plasmids at different dilutions (5.72×102～5.72×105 copies·μL-1)圖1 TaqMan qPCR擴增曲線(A)及標準曲線(B)Fig.1 Amplification curve (A) and standard curve (B) of the TaqMan qPCR

2.4 TaqMan qPCR的特異性分析

采用所建方法對牛羊常見病原核酸樣品進行檢測。從擴增曲線可見,建立的TaqMan qPCR方法僅對Movi檢測出現陽性擴增,對其他牛羊常見病原(Maga、AL、Mmc、Mccp、Mcc、Mb、CP和ORFV)均未見熒光信號(圖2)。

1. 綿羊肺炎支原體;2～9. 分別為無乳支原體、萊氏無膽甾原體、絲狀支原體山羊亞種、山羊支原體山羊肺炎亞種、山羊支原體山羊亞種、牛支原體、偽結核棒狀桿菌、羊口瘡病毒1. Movi; 2-9. Maga, AL, Mmc, MCCP, Mcc, Mb, CP, ORFV, respectively圖2 TaqMan qPCR特異性試驗結果Fig.2 Specificity analysis of TaqMan qPCR

2.5 TaqMan qPCR的靈敏性試驗

用建立的TaqMan qPCR方法對不同濃度質粒進行檢測,結果顯示,5.72×102～5.72 copies·μL-1的質粒標準品均有特異性擴增曲線,因此確定該方法對重組質粒標準品最低檢測限為5.72 copies·μL-1(圖3),同時,用常規PCR對以上相同濃度質粒進行檢測,結果顯示常規PCR的最低檢測限為5.72×102copies·μL-1,即TaqMan qPCR的敏感性是常規PCR的100倍。

1～4. Movi-Hsp70質粒濃度 5.72×102 至5.72×10-1 copies.μL-1;5. 陰性對照1-4. Movi-Hsp70 plasmid concentrations from 5.72×102 to 5.72×10-1 copies·μL-1; 5. Negative control圖3 TaqMan qPCR靈敏性試驗結果Fig.3 Sensitivity analysis of TaqMan qPCR

2.6 TaqMan qPCR的重復性

將不同稀釋度的標準品分別進行組內和組間的重復性試驗,結果顯示(表3),組內變異系數為0.09%～0.84%,組間變異系數0.35%～0.45%,Cq值變異系數均在1.00%以內,表明本研究建立的TaqMan qPCR方法重復性好。

表3 TaqMan qPCR的重復性試驗結果Table 3 Repeatability analysis of the TaqMan qPCR

2.7 臨床樣品的檢測

臨床樣品的檢測結果見表4,基于Hsp70基因的TaqMan qPCR方法檢測的臨床樣品陽性率高于基于P113基因的TaqMan qPCR方法;基于P113基因的TaqMan qPCR方法檢測的陰性樣品用基于Hsp70基因的TaqMan qPCR方法檢測,結果也是陰性,符合率為100%。隨機抽取基于Hsp70基因的TaqMan qPCR方法檢測結果為陽性而基于P113基因的TaqMan qPCR方法檢測結果為陰性的10份樣品進行PCR擴增(用Hsp70基因分段擴增引物)后測序分析,測序結果顯示均為目的基因序列。將檢測結果為Movi陽性的40份肺組織樣品進行分離鑒定,結果分離到6株Movi,將分離純化成功的菌株進行Hsp70基因的擴增、克隆和測序。

表4 臨床樣品檢測結果Table 4 Test results of clinical samples

2.8 Hsp70基因的擴增與序列分析

2.8.1Hsp70基因的擴增 以提取的6個Movi菌株的DNA為模板,分別采用Hsp70基因引物分段擴增基因,PCR產物經瓊脂糖凝膠鑒定,結果顯示,出現與預期片段大小符合的條帶,隨后分別克隆后進行測序。利用DNAStar7.0軟件中的SeqMan軟件對Hsp70基因2個片段的序列進行拼接得到完整的Hsp70基因序列,結果顯示6個Movi菌株Hsp70基因大小均為1 818 bp。6個Movi分離菌株分別命名為FJ-28、FJ-29、FJ-32、FJ-36、FJ-38、FJ-41,將序列上傳至NCBI,獲得序列登錄號分別為OP121619～OP121624。

2.8.2Hsp70序列分析 利用DNAStar7.0軟件中的MegAlign軟件對Movi分離株FJ-28、FJ-29、FJ-32、FJ-36、FJ-38、FJ-41與各Movi參考菌株(均參考自NCBI)的Hsp70基因和氨基酸序列進行分析。基因序列結果顯示,本試驗獲取的6個Movi不同分離菌株之間核苷酸相似性在98.1%～100.0%,與山羊源菌株的親緣關系較近,核苷酸相似性在97.7%～99.4%,與綿羊源菌株的親緣關系較遠,核苷酸相似性在96.0%～96.7%;與綿羊源菌株相比,山羊源的Hsp70基因在1 777～1 779 bp處均插入3個核苷酸(TCA);FJ-28、FJ-29、FJ-32、FJ-36、FJ-38、FJ-41分離株與Movi Y98標準株相比分別有64、59、57、58、65個核苷酸變異位點,這些發生變異的位點無規則地分布在整個基因中。基于Hsp70基因構建的進化樹,結果顯示,不同Movi菌株可以分成兩個大分支,分別為ClusterⅠ(宿主均為山羊)和ClusterⅡ(宿主均為綿羊),ClusterⅠ下有ClusterⅠA和ClusterⅠB兩個分支。FJ-28、FJ-29、FJ-32、FJ-36、FJ-38、FJ-41分離株的進化樹分支均屬于ClusterⅠA(圖4),研究表明本試驗分離的菌株與同樣來源于中國的山羊源菌株親緣關系更近,而與綿羊源菌株的親緣關系較遠。

2.8.3 Hsp70氨基酸序列分析 氨基酸序列分析結果顯示,本試驗獲取的6個Movi不同分離株之間氨基酸相似性在99.5%～100.0%,與山羊源的氨基酸相似性在99.2%～100.0%,與綿羊源的氨基酸相似性在98.0%～98.5%;與綿羊源菌株相比,所有山羊源分離株在25位(A→S)、89位(Q→D)、148位(E→A)、363位(E→D)、554位(L→V)均發生變異,且在593位點均插入Gln(谷氨酰胺)。Y98標準株、strain 150株與strain NXNK2203(均為綿羊源)在191、250、340、393、410、436位存在N末端糖基化位點,其它山羊源菌株(除了J1株外)均在586位多了1個N末端糖基化位點(圖5)。

圖5 N末端糖基化位點分析Fig.5 Analysis of N-terminal glycosylation sites

3 討 論

目前檢測Movi最常用的方法為分子生物學檢測方法,包括常規PCR、qPCR、LAMP等方法。但是,LAMP方法假陽性較多;常規PCR敏感性不如qPCR,對于核酸含量低的樣品(如鼻拭子)可能存在漏檢。目前已有基于16S rRNA基因、EF-Tu基因建立的SYBR Green實時熒光定量PCR方法及基于P113基因建立的TaqMan qPCR檢測方法用于Movi流行病學調查[20-22]。Deshuillers等[23]報道稱,Movi分離株的基因組序列操縱子上存在2個重復的16S rRNA基因序列,這2個重復序列可能分別對應不同的支原體屬或為單一菌屬的重復序列,這提示16S rRNA 基因作為Movi系統鑒定靶標的特異性并不夠強[24-26]。Zhang等[27]研究也表明,Hsp70基因比16S rRNA 基因更適合用于評估Movi與其它支原體的遺傳關系,可作為潛在的分子標記。另有研究報道,基于Hsp70基因建立的常規PCR方法比基于16S rRNA 基因建立的常規PCR方法的靈敏度和特異性都有所提高[28-29]。

本研究基于Hsp70基因與基于P113基因的TaqMan qPCR檢測方法對樣品進行平行檢測比較兩者符合率,結果發現基于Hsp70基因的TaqMan qPCR檢測方法對臨床樣品(尤其是鼻拭子樣品)有更高的陽性率,可能的原因有兩個方面:一是Hsp70基因是高度保守的生物分子,本研究設計的引物及探針幾乎涵蓋了不同Movi 菌株Hsp70基因序列;二是Hsp70是在生物細胞中高效表達的一種熱休克蛋白。本研究中臨床鼻拭子樣品檢測結果的陽性率為52.27%,疑似MPSG的肺組織樣品檢測結果的陽性率為93.02%,如此高的陽性率主要是因為根據本團隊前期對福建省MPSG的流行病學調查結果顯示,福建省內該病的主要流行病原為Movi,其次為Mmc[30]。

蛋白質的 N-糖基化修飾是生物體調控蛋白質在組織和細胞中的定位、功能、活性、壽命和多樣性的一種普遍的翻譯后修飾,其有重要調節蛋白質功能的作用。郭鵬等[32]研究發現,突變N-糖基化位點使熱休克蛋白gp96 的ATPase 活性、抗原交叉呈遞能力和免疫佐劑功能減弱,提示糖基化水平對熱休克蛋白gp96免疫功能產生直接影響。乙型腦炎病毒(Japaneseencephalitisvirus,JEV)的PrME蛋白和NS1蛋白的N-糖基化在免疫過程中起著重要的作用,一個N-糖基化消除的prME基因可以誘導較高的ELISA抗體、中和抗體和免疫保護,但兩個N-糖基化都缺乏的基因則導致免疫力下降,在野生型和突變型NS1組中也觀察到類似的情況[33]。禽流感病毒(AvianInfluenzaVirus,AIV)HA蛋白上受體結合區域的糖基化修飾對受體結合特性有較大影響。H7N1病毒HA蛋白在150-loop的第158位新增一個糖基化修飾,形成空間干擾從而阻礙受體的結合,最終降低病毒對受體的親和力[34]。H5N6病毒HA蛋白第158位出現糖基化缺失后,不僅導致對人型受體的結合特異性增強,而且增強了其在豚鼠中的致病性[35]。以上研究表明,N-糖基化位點的增加、缺失可能對蛋白的生物學活性及免疫特性產生影響。本研究中發現Movi山羊源分離株(除了J1)比綿羊源分離株均在586位多了1個N末端糖基化位點,山羊源586位的糖基化位點對于Movi的感染、致病性及免疫應答有無影響及其作用機制還需更進一步深入研究。

4 結 論

本研究建立了特異性強、敏感性高、重復性優的基于Hsp70基因的Movi的qPCR檢測方法。序列分析發現,不同來源Movi的Hsp70基因核苷酸同源性較高,所有山羊源的菌株均比綿羊源菌株多了1個N-糖基化位點;遺傳進化分析證實,Movi福建株與山羊源分離株遺傳關系較近(均處于山羊源ClusterⅠA亞分支)。本研究不僅為Movi 臨床診斷提供了檢測技術支撐,更為后續進一步研究Movi 遺傳演化規律提供參考。