固原黃牛不同部位肌肉組織代謝組學分析

王中波,劉 爽,賀麗霞,馮 雪,楊夢麗,汪書哲,劉 源,馮 蘭,丁曉玲,冀國尚,楊潤軍,張路培,馬 云*

(1.寧夏大學動物科技學院 寧夏回族自治區(qū)反芻動物分子細胞育種重點實驗室,銀川 750021;2.吉林大學動物科學學院,長春 130000;3.中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所,北京 100193)

牛肉營養(yǎng)豐富,是肉類消費的一個重要組成部分。風味作為牛肉品質(zhì)關(guān)鍵特性,決定肉品的價值和消費者的購買意愿,肉品中代謝物類別以及含量是評估肉類風味和整體適口性的重要指標[1-2]。基于核磁共振(NMR)和質(zhì)譜(MS)的代謝組學技術(shù)可以解析生物樣本間代謝物的差異和篩選潛在的相關(guān)生物標志物[3]。代謝組學技術(shù)具有操作簡單、通量高等特點,已成為了解肉品化學組成及動態(tài)變化的主要方法之一,常用于肉品品質(zhì)研究和分子育種研究[4-7]。

固原黃牛是分布于寧夏回族自治區(qū)六盤山周邊地區(qū)特有的地方黃牛類群,主要含有本地黃牛、秦川牛和蒙古牛血液[8]。固原黃牛肉具有蛋白質(zhì)含量高、谷氨酸含量豐富、膽固醇含量低、肉質(zhì)細嫩多汁等特點,分別于2016年和2019年入選國家地理標志保護產(chǎn)品和中國農(nóng)業(yè)品牌目錄,但目前對固原黃牛肉品質(zhì)研究未見報道[9]。其他肉牛品種不同部位肉品質(zhì)已有不少研究和報道,牛蕾等[10]對中國西門塔爾公牛的研究發(fā)現(xiàn)不同肌肉部位品質(zhì)存在較大差異。保善科等[11]在對高原牦牛肉品質(zhì)研究中發(fā)現(xiàn)部位因素對肉品質(zhì)有顯著影響。基于此,為了研究固原黃牛不同部位肌肉組織的肉品質(zhì)差異和風味形成相關(guān)的關(guān)鍵代謝物,本研究利用非靶向代謝組學技術(shù)對6頭24月齡雄性固原黃牛眼肉、臀肉和肩肉3個部位的肌肉組織進行代謝物分析,篩選與牛肉品質(zhì)和風味形成相關(guān)的關(guān)鍵代謝物,以期為固原黃牛肉品質(zhì)性狀進一步研究及分子育種提供一些參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物和樣品采集

本試驗選用的黃牛為固原富民農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司同一生長條件下的固原黃牛群體。隨機挑選6頭24月齡及體重相近的健康雄性固原黃牛,根據(jù)屠宰場肉牛屠宰標準操作流程進行屠宰,肉牛按1～6進行編號,對眼肉(背最長肌)、臀肉(臀二頭肌)、肩肉(岡上、岡下肌)的3個部位進行平均多點取樣,將采集的樣品置于2 mL凍存管中。眼肉標記為YR,即6頭牛分別對應YR1、YR2、YR3、YR4、YR5、YR6;臀肉標記為TR,即6頭牛分別對應TR1、TR2、TR3、TR4、TR5、TR6;肩肉標記為JR,即6頭牛分別對應JR1、JR2、JR3、JR4、JR5、JR6。將取好的樣品立即置于液氮中進行速凍,再統(tǒng)一轉(zhuǎn)移至-80 ℃超低溫冰箱中保存,后續(xù)干冰運輸至北京諾禾致源科技股份有限公司進行代謝物提取和檢測分析。

1.2 代謝物提取

取冷凍狀態(tài)下的牛肉組織樣本切成小薄片狀,再用小剪刀剪碎,置于盛有少量液氮的研缽中,用研杵對組織樣本進行碾壓研磨,并及時補充液氮讓樣品始終保持冷凍狀態(tài),直至組織被研磨成粉末狀。精確稱量100 mg(±2%)研磨好的組織樣品于1.5 mL 離心管中,加入1 mL保存于-20 ℃條件下的組織提取液(900 mL·L-1甲醇氯仿、水體積比為3∶1),渦旋混勻30 s,冰上超聲30 min后靜置30 min;4 ℃,15 000 g離心20 min,移取850 μL上清液至1.5 mL 樣品管中,進行冷凍干燥后加入200 μL 530 mL·L-1甲醇溶液進行復溶,復溶后的提取物溶液經(jīng)0.22 μm膜過濾后置于檢測瓶中。取等體積試驗樣本進行混合得到QC(質(zhì)控)樣本,Blank(空白)樣品為530 mL·L-1甲醇溶液。

1.3 色譜和質(zhì)譜條件

1.3.1 色譜條件 賽默飛Vanquish UHPLC色譜儀;賽默飛Hypesil Gold Column色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.9 μm);正模式流動相A為1 mL·L-1甲酸,流動相B為甲醇;負模式流動相A為5 mmol·L-1醋酸銨(pH 9.0),流動相B為甲醇;進樣量6 μL,柱溫40 ℃,流速0.2 mL·min-1。

1.3.2 質(zhì)譜條件 賽默飛Q ExactiveTMHF質(zhì)譜儀,掃描范圍選擇m/z 100～1 500;噴霧電壓(spray voltage):3.5 kV;鞘氣流速(sheath gas flow rate):35 psi;輔助氣流速(aux gas flow rate):10 L·min-1;離子傳輸管溫度(capillary temp):320 ℃;離子導入射頻電平(s-lens rf level):60;輔助氣加熱器溫度(aux gas heater temp):350 ℃;正離子與負離子模式下采集質(zhì)譜信號;MS/MS二級掃描為數(shù)據(jù)依賴性掃描(data-dependent scans)。

1.4 數(shù)據(jù)預處理和代謝物鑒定

將下機數(shù)據(jù)(.raw)文件導入Compound Discover 3.1軟件中進行處理,首先對每個代謝物進行保留時間、質(zhì)荷比等參數(shù)的簡單篩選,然后設(shè)置保留時間偏差0.2 min和質(zhì)量偏差5 ppm的指標對不同樣品進行峰對齊,使鑒定更準確。隨后設(shè)置質(zhì)量偏差5 ppm、信號強度偏差30%、信噪比3、最小信號強度、加合離子等信息進行峰提取,同時對峰面積進行定量,再整合目標離子,然后通過分子離子峰和碎片離子進行分子式的預測并與mzCloud、mzVault和Masslist數(shù)據(jù)庫進行比對,用blank樣本去除背景離子,同時根據(jù)樣本代謝物定量值總和與QC樣本代謝物定量值總和對樣品測定值進行標準化處理,得到相對峰面積,并將QC樣本中相對峰面積的CV大于30%的化合物剔除,得到代謝物相對定量結(jié)果,最后使用KEGG數(shù)據(jù)庫和LIPID MAPS數(shù)據(jù)庫對鑒定到的代謝物進行注釋。

1.5 差異代謝物篩選

使用數(shù)據(jù)處理軟件metaX對數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換后進行主成分分析(PCA)和偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)[12-13],進而獲得每個代謝物的VIP值。單變量分析部分,基于t檢驗計算各代謝物在兩組間的統(tǒng)計學顯著性(P值),并計算代謝物在兩組間的差異倍數(shù)FC(fold change)值。差異代謝物篩選的標準為VIP>1,P<0.05且FC>1.5或FC<0.667。

1.6 差異代謝物KEGG富集分析和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析

為了進一步了解差異代謝物在機體內(nèi)的生物學功能,使用BioDeep云平臺(https://www.biodeep.cn/)對篩選到的差異代謝物進行KEGG富集分析,并以P<0.05作為條件判斷KEGG通路富集的顯著性,確定差異代謝物參與的主要生化代謝途徑和信號轉(zhuǎn)導途徑。基于篩選得到的差異代謝物,利用FELLA(R包)[14]進行通路、功能模塊、關(guān)鍵酶及代謝物網(wǎng)絡(luò)分析。

1.7 肩肉、眼肉和臀肉代謝物WGCNA分析

利用WGCNA R包對肩肉、眼肉和臀肉3個組的代謝物進行共表達網(wǎng)絡(luò)分析,將肩肉、眼肉和臀肉的表型性狀作為加權(quán),代謝物依據(jù)表達水平不同聚類為不同顏色的模塊。將各不同顏色模塊與表型性狀進行關(guān)聯(lián)分析,篩選與牛肉品質(zhì)顯著相關(guān)的模塊。

2 結(jié) 果

2.1 固原黃牛眼肉、肩肉和臀肉代謝物鑒定

基于代謝物的相對定量值計算QC樣本之間的Pearson相關(guān)系數(shù),QC樣本R2均大于0.99,說明整個試驗過程中儀器誤差引起的變異較小(圖1A)。將QC樣本提取得到的峰進行PCA分析(圖1B),QC樣本聚集在一起,再次表明固原黃牛眼肉、肩肉和臀肉代謝物鑒定數(shù)據(jù)質(zhì)量較高。

A.QC樣本相關(guān)性分析;B.總樣本PCA分析;C.代謝物分類餅狀圖;D.LIPID MAPS分類注釋A.Correlation analysis of QC samples; B.PCA analysis of total samples; C.Pie chart of metabolite classification; D.Classification annotation using LIPID MAPS圖1 固原黃牛眼肉、肩肉和臀肉代謝物鑒定Fig.1 Identification of metabolites of eye meat, shoulder meat and hip meat of Guyuan cattle

將所有試驗樣本提取到的峰進行PCA分析(圖1B):PCA分析顯示肩肉、眼肉和臀肉3組樣品間有分離,表明PCA分析對兩組樣品間有區(qū)分效果,肩肉、眼肉和臀肉3組樣品的代謝物組成類別和含量上存在差異。第一主成分(PC1)占總變量的25.05%,第二主成分(PC2)占總變量的13.32%,二者累計貢獻率可達38.37%。

對眼肉、肩肉和臀肉的代謝物進行分析,共鑒定到代謝物689個,包括脂質(zhì)和類脂分子、有機酸及其衍生物、核苷、核苷酸和類似物、有機雜環(huán)化合物、含氧有機化合物、苯環(huán)型化合物、有機氮化合物、苯丙類和聚酮類、生物堿及其衍生物(圖1C),其中脂質(zhì)和類脂分子占比最高為32.08%(221個代謝物)。進一步使用LIPID MAPS脂質(zhì)數(shù)據(jù)庫對脂質(zhì)和類脂分子分類(圖1D),主要類別為脂肪酸類(fatty acids,FA)、甘油脂類(glycerolipids,GL)、甘油磷脂類(glycerophospholipids,GP)、聚酮化合物(polyketides,PK)和固醇脂類(sterol lipids,ST),其中脂肪酸類占比最高為50%(49個代謝物)。

2.2 固原黃牛眼肉、肩肉和臀肉差異代謝物篩選

對不同肌肉組織的差異代謝物進行篩選,首先用偏最小二乘法判別分析方法(partial least squares discriminant analysis,PLS-DA)進行代謝物輪廓分析。結(jié)果顯示(圖2),眼肉、肩肉和臀肉各樣品組間代謝物明顯分開,表明固原黃牛不同部位肌肉組織間代謝物存在差異;眼肉組與肩肉組(YRvs. JR):R2Y=0.99,Q2Y=0.53,R2Y>Q2Y,Q2與Y軸截距小于0;眼肉組與臀肉組(YRvs. TR):R2Y=0.98,Q2Y=0.48,R2Y>Q2Y,Q2與Y軸截距小于0;肩肉組與臀肉組(JRvs. TR):R2Y=0.99,Q2Y=0.50,R2Y>Q2Y,Q2與Y軸截距小于0。以上信息表明模型質(zhì)量高、差異代謝物篩選可靠性強。

設(shè)置VIP>1.0,FC>1.5或FC<0.667且P-value<0.05,對固原黃牛不同部位肌肉組織間差異代謝物進行篩選。眼肉組與肩肉組相比,113個差異代謝物顯著上調(diào)和33個差異代謝物顯著下調(diào)(P<0.05);眼肉組與臀肉組相比,131個差異代謝物顯著上調(diào)和31個差異代謝物顯著下調(diào)(P<0.05);肩肉與臀肉相比,44個差異代謝物顯著上調(diào)和28個差異代謝物顯著下調(diào)(P<0.05)。對3個樣品組的代謝物進行聚類分析,從聚類熱圖可以看出(圖3A),肩肉組和臀肉組樣本聚為一類,眼肉組樣本為一類,這說明不同組間樣本具有明顯的表達差異。眼肉與肩肉、臀肉相比較,篩選得到73種顯著差異代謝物(圖3B),其中(R)-3-羥基肉豆蔻酸、油酸、前列腺素E2、(9Z)-12,13-二羥基-9-十八烷基酸、12-氧植物二烯酸、15-OxoEDE、10-Nitrolinoleate、5-OxoETE、9-Oxo-ODE和13(S)-HOTrE共10種脂肪酸類代謝物在眼肉中顯著高表達(P<0.05);ACar 22∶3(脂肪酸類代謝物)在眼肉中顯著低表達(P<0.05);N6,N6,N6-三甲基-L-賴氨酸(N6,N6,N6-trimethyl-L-lysine,有機酸及其衍生物)和麥芽三糖(maltotriose,含氧有機化合物)是眼肉、肩肉和臀肉之間共同的差異代謝物,二者表達量均在眼肉最高、肩肉次之、臀肉最低(P<0.05)(圖3C)。

2.3 固原黃牛KEGG富集分析

眼肉與肩肉的組間差異代謝物主要富集在脂肪細胞的脂肪分解調(diào)節(jié)(regulation of lipolysis in adipocytes)、嘌呤代謝(purine metabolism)和丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝(alanine, aspartate and glutamate metabolism)等通路(P<0.05);眼肉與臀肉的組間差異代謝物主要富集在丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝(alanine, aspartate and glutamate metabolism)等通路(P<0.05);肩肉與臀肉的組間差異代謝物主要富集在氮代謝(nitrogen metabolism)等通路(P<0.05)。其中有17條代謝通路是眼肉與肩肉(YRvs. JR)、眼肉與臀肉(YRvs. TR)和肩肉與臀肉(JRvs. TR)差異代謝物共同富集的主要通路,即嘌呤代謝,嘧啶代謝,脂肪細胞中脂肪分解調(diào)節(jié),花生四烯酸代謝,醛固酮合成和分泌,味覺傳導,丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝,炎癥介質(zhì)對TRP通道的調(diào)節(jié),催產(chǎn)素信號通路,丙酸酯代謝,丁酸酯代謝,乙醛酸及二羧酸代謝,不飽和脂肪酸生物合成,糖的消化和吸收,氮代謝,長壽調(diào)節(jié)途徑和氧化磷酸化(圖4)。固原黃牛眼肉、肩肉和臀肉的差異代謝物共同富集通路和差異代謝物見表1。

A.眼肉與肩肉差異代謝物富集通路;B.眼肉與臀肉差異代謝物富集通路;C.肩肉與臀肉差異代謝物富集通路A.Significantly differential metabolites enrichment pathways between eye meat and shoulder meat; B.Significantly differential metabolites enrichment pathways between eye meat and hip meat; C.Significantly differential metabolites enrichment pathways between shoulder meat and hip meat圖4 固原黃牛眼肉、肩肉和臀肉差異代謝物共同富集通路Fig.4 Common enrichment pathways of significantly differential metabolites in eye meat, shoulder meat and hip meat of Guyuan cattle

2.4 固原黃牛眼肉、肩肉和臀肉差異代謝物調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析

使用FELLA(R包)進行調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析,了解密切相關(guān)途徑、代謝模塊以及潛在的關(guān)鍵酶和代謝物,以便更好地理解整體的代謝反應(圖5)。重點關(guān)注固原黃牛眼肉、肩肉和臀肉的差異代謝物以及代謝物在不飽和脂肪酸生物合成通路中所起的作用。結(jié)果顯示,乙酰輔酶A(CoA)、油酰輔酶A(oleoyl-CoA)、油酰(oleoyl)、二十二碳五烯酸輔酶A(docosapentaenoyl-CoA)和二十二六烯酸輔酶A(docosahexaenoyl-CoA)這5種代謝物在不飽和脂肪酸生物合成中扮演關(guān)鍵角色。除了不飽和脂肪酸生物合成通路,上述代謝物還參與了脂肪酸延伸、脂肪酸降解、花生四烯酸代謝、不飽和脂肪酸的生物合成、脂肪酸代謝、PPAR信號通路和PI3K-Akt信號通路等多個代謝通路。此外,涉及不飽和脂肪酸生物合成的17種酶也對這一過程進行了調(diào)控。這些結(jié)果有助于更全面地了解固原黃牛不同部位肌肉的代謝特征,尤其是在不飽和脂肪酸合成方面的關(guān)鍵作用。

紅色.通路;紫色.功能模塊;黃色.酶;天青色.相互作用;綠色.代謝物Red. Pathway; Purple. Modules; Yellow. Enzyme; Azure. Interaction; Green. Metabolites圖5 固原黃牛眼肉、肩肉和臀肉差異代謝物富集不飽和脂肪酸生物合成通路的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析Fig.5 Regulatory network analysis of significantly differential metabolites enriched in biosynthesis of unsaturated fatty acids pathway in eye meat, shoulder meat and hip meat of Guyuan cattle

2.5 固原黃牛眼肉、肩肉和臀肉WGCNA分析

本研究旨在了解與固原黃牛肉風味相關(guān)的代謝物和探究代謝物與肉品質(zhì)的關(guān)系,利用WGCNA分析再次對眼肉、肩肉和臀肉品質(zhì)相關(guān)差異代謝物進行探索。聚類分析顯示,除了YR2個體,眼肉組(YR)代謝物與肩肉組(JR)和臀肉(TR)組代謝物分布存在差異,肩肉組(JR)和臀肉(TR)組代謝物相近(圖6A)。說明眼肉與肩肉、眼肉和臀肉品質(zhì)上存在差異,肩肉和臀肉品質(zhì)上相近。當R2為0.8,軟閾值為 3時(圖6B),平均連接度急劇下降(圖6C)。將代謝物用顏色模塊進行注釋分類,共14個顏色模塊,其中藍色模塊(blue)、棕色模塊(brown)、綠松石模塊(turquoise)占有較大比例(圖6D)。相關(guān)性分析顯示,眼肉(YR)與藍色模塊(blue)具有強相關(guān),肩肉(JR)與棕色模塊(brown)強相關(guān),臀肉(TR)與綠松石模塊(turquoise)強相關(guān)(圖6E)。當模塊中GS(gene significance)與MM(module membership)大于0.8時,3個模塊共有1個關(guān)鍵代謝物,為11(Z),14(Z)-二十碳二烯酸[11(Z),14(Z)-Eicosadienoic Acid],當GS與MM大于0.6時YR有35個關(guān)鍵代謝物(圖6G),如(±)18-HEPE、(+/-)12(13)-DiHOME、LPE 20∶3、LPE 22∶4、15-OxoEDE;TR有11個關(guān)鍵代謝物(圖6H);JR有17個關(guān)鍵代謝物(圖6I)。

A. 樣本聚類;B-C.為了獲得更佳拓撲關(guān)系,進行軟閾值β的計算,本研究中β=6,此時R2為0.8,平均連接度區(qū)域恒定;D.顏色模塊聚類;E.顏色模塊相關(guān)性分析;F.代謝物與組織部位關(guān)聯(lián)性分析;G-I.模塊中基因顯著性(GS)與模塊成員(MM)的散點圖A. Clustering of samples; B-C. Calculation of soft threshold β was carried out in order to obtain better topological relationships, β=6 in this study, at which time R2 was 0.8 and the average connectivity region was constant; D. Color module clustering; E. Color module correlation analysis; F. Correlation analysis between metabolites and tissue location; G-I. Scatter plot of gene significance (GS) versus module membership (MM) in the module圖6 固原黃牛眼肉、肩肉和臀肉WGCNA分析Fig.6 WGCNA analysis of eye, shoulder and hip meat of Guyuan cattle

3 討 論

不同肉牛品種和胴體部位的肌肉因肌纖維、結(jié)締組織組成差異呈現(xiàn)不同特點,一般腿部、頸部肌肉日常活動量大肌肉韌性相對較強,對應部位肉品嫩度也相對差些,肉品等級低,距腿部和頸部遠一些部位的肉品相對細嫩,肉品等級高[15-17]。在對分割肉的食用品質(zhì)評定過程中背腰部分割肉肉品等級明顯優(yōu)于臀部和前后腿分割肉肉品等級[18]。分割肉中的眼肉,為牛背前部兩側(cè)背最長肌,肌內(nèi)脂肪易沉積形成大理石花斑紋狀,食用口感細嫩,是高檔牛肉來源的主要部位;臀肉為后腿近臀部位肉品,肌肉外形呈圓滑狀,肌內(nèi)脂肪含量相對其它部位肌肉低,食用口感明顯不及眼肉,肉品檔次等級低;肩肉為前肩胛部和前腿的上部肌肉,肌纖維比較粗,嫩度差,肉品檔次等級較低[19-21]。臀肉和肩肉在肉品品質(zhì)上相近,眼肉與臀肉和肩肉存在明顯的差異。對固原黃牛不同部位肌肉組織進行代謝物分析發(fā)現(xiàn)臀肉和肩肉聚為一類,眼肉聚為一類,說明臀肉和肩肉代謝物組成相近,眼肉與臀肉和肩肉之間存在差異,與肉品檔次分級一致。以上也說明代謝物組成與牛肉品質(zhì)存在一定的相關(guān)性,代謝物分析可以作為一種研究固原黃牛肉品質(zhì)的有效方法。

肌內(nèi)脂肪(intramuscular fat,IMF)含量是決定牛肉品質(zhì)的重要因素之一,大量研究表明肌內(nèi)脂肪含量與牛肉的多汁性、嫩度和適口性呈正相關(guān)[22-24]。牛肉肌內(nèi)脂肪中較高百分比的單不飽和脂肪酸(MUFA)可以導致較低的脂肪熔點,可提升肉質(zhì)的柔軟度和改善牛肉的風味[25-29]。關(guān)注度較高的肉牛品種中,日本和牛背長肌脂肪含量高達36.5%,并且有較高的PUFA/SFA(多不飽和脂肪酸/飽和脂肪酸)比例[30]。美國2014年一份關(guān)于產(chǎn)品質(zhì)量的白皮書顯示和牛和安格斯牛背最長肌中肌間脂肪含量與MUFA(單不飽和脂肪酸)含量呈正相關(guān),提示高品質(zhì)牛肉除了有出色的食用口感,還有更高的營養(yǎng)價值[31]。固原黃牛眼肉、肩肉和臀肉代謝分析研究鑒定到的代謝物中脂質(zhì)和類脂分子占比高達32.08%,LIPID MAPS分類中脂肪酸類占重要組成部分,表明脂類是牛肉重要組成分和影響固原黃牛肉品質(zhì)的重要因素,在固原黃牛牛肉風味形成過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在肉品大理石花紋感官上,固原黃牛的眼肉與臀肉和肩肉存在明顯的差異,眼肉大理石花紋評分優(yōu)于臀肉和肩肉,屬于3個部位肉品品質(zhì)最高的。眼肉與肩肉和臀肉相比,油酸、花生四烯酸、二十二碳五烯酸、二十二碳六烯酸等不飽和脂肪酸顯著高表達,其中油酸是一種單不飽和Omega-9脂肪酸,也是牛肉中最豐富的脂肪酸。油酸不僅參與牛肉風味形成,對人體健康方面也有積極的作用,可以通過影響機體血脂水平和降低膽固醇水平減少心血管疾病的發(fā)生率[31-33]。花生四烯酸、二十二碳五烯酸、二十二碳六烯酸均為多不飽和脂肪酸,具有調(diào)節(jié)血脂改善血液循環(huán)作用,對機體健康有著重要影響,本研究分析結(jié)果與前人研究中表明的高品質(zhì)牛肉PUFA/SFA比例相對較高基本相符[34]。

差異代謝物中花生四烯酸-12-脂加氧酶、花生四烯酸15-脂加氧酶、花生四烯酸5-脂加氧酶、sn-1特異性二酰基甘油脂肪酶、前列腺素內(nèi)過氧化物合酶等都是參與花生四烯酸代謝相關(guān)酶,花生四烯酸是一種ω-6多不飽和脂肪酸,廣泛地參與機體的脂代謝和炎癥反應[35]。二十二碳五烯酸、二十二碳六烯酸含量受花生四烯酸調(diào)節(jié)呈正相關(guān)[36]。硬脂酰輔酶A-9-去飽和酶也是多不飽和脂肪酸轉(zhuǎn)化為更長多不飽和脂肪酸的關(guān)調(diào)控酶[37]。生物體內(nèi)脂類物質(zhì)的合成、分解和轉(zhuǎn)化過程十分復雜,受多種酶及不同通路的調(diào)控,如前列腺素是二十碳不飽和脂肪酸花生四烯酸經(jīng)酶促代謝產(chǎn)生的一類脂質(zhì)介質(zhì),前列腺素內(nèi)過氧化物合酶是前列腺素生物合成過程中的關(guān)鍵酶,此外乙酰輔酶A-酰基轉(zhuǎn)移酶、氨基酸-N-酰基轉(zhuǎn)移酶、長鏈脂肪酸輔酶A連接酶等在脂質(zhì)代謝都起重要的作用。不同部位肌肉組織代謝物差異分析結(jié)果也表明固原黃牛肉獨特風味以及整體的品質(zhì)特性與不飽和脂肪酸生物合成過程中的相關(guān)酶和代謝物相關(guān)。

N6,N6,N6-三甲基-L-賴氨酸和麥芽三糖是眼肉、肩肉和臀肉共同差異代謝物,二者均在眼肉中含量最高(P<0.05)。N6,N6,N6-三甲基-L-賴氨酸作為負責脂肪酸跨線粒體膜轉(zhuǎn)運載體分子肉堿的前體,在脂肪酸代謝中起著至關(guān)重要的作用[38]。肉堿除了將長鏈脂肪酸轉(zhuǎn)運到線粒體中,還在調(diào)節(jié)線粒體內(nèi)酰基輔酶A與游離輔酶A的比例中起重要作用,同時調(diào)節(jié)參與三羧酸循環(huán)(TCA)、脂肪酸氧化、尿素循環(huán)和糖異生的幾種線粒體酶的活性,對心臟能量代謝至關(guān)重要[39]。麥芽三糖作為肝臟中的主要可溶性糖,參與碳水化合物代謝、脂質(zhì)代謝與肝脂肪沉積以及肌內(nèi)脂肪含量密切相關(guān)[40]。固原黃牛眼肉、肩肉、臀肉中的N6,N6,N6-三甲基-L-賴氨酸、麥芽三糖含量呈遞減趨勢,可能與肌內(nèi)脂肪沉積程度有關(guān),也是影響牛肉風味的關(guān)鍵因素。

眼肉與肩肉、眼肉與臀肉以及肩肉與臀肉差異代謝物共同富集到核酸、脂類、氨基酸合成與代謝以及能量代謝等通路,其中不飽和脂肪酸生物合成、味覺傳導、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝、花生四烯酸代謝、乙醛酸及二羧酸代謝與牦牛脂肪沉積特征研究中差異代謝物富集通路一致[41]。乙醛酸代謝和二羧酸代謝與延邊黃牛風味研究中眼肉和臀肉差異代謝物富集通路一致[42]。氮代謝、氧化磷酸化通路與牦牛品質(zhì)特性研究中脊肉與肩肉品質(zhì)差異基因富集到相關(guān)通路一致[18]。綜上說明,不飽和脂肪酸生物合成、花生四烯酸代謝、氧化磷酸化通路、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝等通路是影響固原黃牛肉品質(zhì)的關(guān)鍵代謝通路。

4 結(jié) 論

本研究采用非靶向代謝組學對固原黃牛眼肉、臀肉和肩肉3個部位肌肉組織進行分析研究,發(fā)現(xiàn)脂肪酸類代謝物在鑒定到的代謝物中占比最高,可能在固原黃牛風味形成過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。脂肪細胞中脂肪分解調(diào)節(jié)、花生四烯酸代謝、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝、丙酸酯代謝、不飽和脂肪酸生物合成、糖的消化和吸收等通路參與固原黃牛風味形成的調(diào)控,這些結(jié)果可能是固原黃牛不同部位肌肉組織肉品質(zhì)差異的重要原因。此外,本研究鑒定到的10種關(guān)鍵代謝物和17種關(guān)鍵酶可作為固原黃牛風味形成及品質(zhì)研究的候選生物標志物。同時,本研究結(jié)果有助于解析不同個體不同組織部位風味品質(zhì)差異,為進一步固原黃牛品質(zhì)性狀分子育種的研究提供理論依據(jù)。