奶牛同期發情-定時輸精技術研究進展

向 輝,桂林森,楊 迪,魏士昊,宮艷斌,史遠剛,馬 云,淡新剛*

(1.寧夏大學動物科技學院,銀川 750021;2.青銅峽市恒源林牧有限公司,青銅峽 751600)

繁殖效率是確保奶牛場盈利的關鍵因素[1]。近幾十年奶牛的選育一直側重于產奶量,然而奶牛的產奶量與繁殖效率呈負相關[2]。同時,泌乳期奶牛的發情表現差且發情檢出率較低[3],這些因素都會直接降低奶牛繁殖效率。

人工授精(artificial insemination,AI)是牛群加速擴繁和遺傳改良的重要方法[4]。然而,由于奶牛的發情鑒定需要花大量的人力和時間,并且部分奶牛存在隱性發情、夜間發情[5]或乏情等情況而導致發情鑒定效果不佳,故在牛群中大規模單獨使用AI并不能切實提高奶牛繁殖力[6]。為進一步提高奶牛繁殖效率,降低奶牛空懷天數,研究者開發了效果更好的奶牛同期發情-定時輸精技術(estrous synchronization-fixed-timed artificial insemination,ES-TAI) ,以提高奶牛的繁殖效率和遺傳價值,這是一種通過外源激素控制奶牛發情并定時輸精(fixed-timed artificial insemination,TAI)的技術[7]。

奶牛同期發情-定時輸精技術基于Pursley等[8]發明的GnRH+PG+GnRH技術(GPG),經過20多年的不斷探索,其使用范圍逐漸擴大且效果也得到顯著提高[9]。該技術利用外源激素控制牛的發情,其核心是利用外源激素人為控制卵泡更替和黃體消退[10]。這既能減少牛隱性發情造成的漏配[11]和病理條件下產生的負面影響[12],也能在省去發情監測的同時確保妊娠率不降[13],還能提高對優良奶牛遺傳資源的利用[14]。

同期發情-定時輸精技術作為奶牛繁殖技術的重大突破和革新,將同期發情和AI的優勢相結合,既提高了奶牛參配率和繁殖效率也降低了經濟成本和勞動時間。本文就同期發情-定時輸精技術的研究進展進行歸納總結,重點闡述同期發情-定時輸精技術原理、處理流程、臨床應用效果,并分析比較各種技術的優缺點以及綜合效益,以期為進一步研發更為高效的同期發情-定時輸精技術和牧場繁殖管理提供一定參考。

1 同期發情-定時輸精技術原理和優點

1.1 同期發情-定時輸精技術原理

同期發情-定時輸精是通過外源激素控制奶牛發情并定時輸精的繁殖技術。最初Pursley等[8]發明了GPG(GnRH-PG-GnRH),也稱Ovsynch56(ovulation synchronization,Ovsynch,圖1)。該技術共使用3次外源激素處理以達到人為控制奶牛卵巢功能的目的[8],通常在奶牛產后50～55 d實施。第一劑促性腺激素釋放激素(gonadotropin-releasing hormone,GnRH)通過肌肉注射,誘導黃體生成素(luteinizing hormone,LH)激增,從而促使發育成熟的卵泡排卵以及啟動新一輪卵泡波發育[15],排卵也會誘發附屬黃體,進而增加排卵期卵泡波發育過程中的循環孕酮(progesterone,P4)濃度;隨后前列腺素F2α(prostaglandin F2α,PGF2α)在GnRH給藥7 d后誘導黃體(corpus luteum,CL)溶解,進而降低P4濃度,為發情的同步做準備;第二劑GnRH(下文簡稱為GnRH2)于注射PGF2α后56 h給藥以同步排卵,并在GnRH 注射后16～18 h后進行TAI,以便在排出卵泡的最佳時間進行人工授精,從而提高妊娠率。

圖1 奶牛同期發情-定時輸精技術(Ovsynch56)原理Fig.1 Diagram of primary ES-TAI technology (Ovsynch56) in dairy cows

1.2 同期發情-定時輸精技術的優點

受發情檢測的制約,發情檢測不良或不足是導致牛群參配率和繁殖效率低下的主要原因[16]。同期發情-定時輸精技術可省去發情鑒定,提高奶牛的參配率和受胎率。再者,使用ES-TAI可提高奶牛優良基因的遺傳利用率[14]。此外,ES-TAI程序中前期所使用的激素為后期授精提供了更好的條件,如PG即對囊性卵巢疾病有良好的治療效果[17],又有助于奶牛產后子宮復舊[18]。

2 奶牛同期發情-定時輸精技術

2.1 同期發情-定時輸精技術(ES-TAI)

奶牛ES-TAI最初只是基于GnRH的技術,并與PG配合使用。若PG處理時奶牛的黃體(corpus luteum,CL)仍處于早期,則不能溶解黃體[19]。而經PG處理后約有12%～21% 的奶牛存在黃體不完全消退現象[20],黃體的不完全消退會引發第2劑GnRH注射后P4濃度升高[21],而高濃度P4導致子宮內膜變薄,最終降低奶牛的繁殖力[22]。

為了確保第2劑GnRH注射之前黃體完全消退,研究者采用調整Ovsynch方案中PG使用劑量和PG與第2劑GnRH注射之間時長兩種方法(圖2)。Tippenhauer等[21]通過改變PG劑量,發現兩次注射PG(即GPPG技術,也稱二次PG法)的方法進一步提高奶牛黃體完全消退的占比,而單次加倍注射PG(即GDPG技術)卻不能提高人工受精后妊娠率(Pregnancy per artificial insemination,P/AI),并經Lauber等[23]驗證二次PG法的G2-16效果更佳(G2-16∶G2-24=50%∶44%)。隨后,Heidari等[24]發現延長 PGF2α至 第2劑GnRH注射之間的時間間隔可降低黃體不完全消退奶牛的比例。Ovsynch48相較于Ovsynch56操作更加簡單且節省時間,但P/AI卻稍低(Ovsynch48∶Ovsynch56=25.2%∶39%)。另外,Hill等[25]發現改變第2劑GnRH注射到TAI的時長也能影響奶牛P/AI,并通過延遲發情不明顯奶牛的授精時間成功提高了奶牛的P/AI。這是因為卵泡大小與卵母細胞成熟和母牛的生育能力有關[26]。Perry 等[27]發現,排卵卵泡直徑大小可以顯著影響隨后奶牛的P/AI。排卵前卵泡直徑小的奶牛有較低的P/AI,盡管推遲排卵前較小卵泡(<11 mm)奶牛的TAI時間可以提高其P/AI,但仍低于排卵前具有較大卵泡直徑的奶牛[28]。

(1)Ovsynch48、(2)Ovsynch56、(3)GPPG、(4)G2-16和(5)GDPG的激素劑量:GnRH 100 μg,PG 500 μg;(6)Heatsynch的激素劑量:GnRH 100 μg,PG 500 μg,環戊丙酸雌二醇(estradiol cypionate,ECP) 1 mgHormone doses for (1) Ovsynch48, (2) Ovsynch56, (3) GPPG, (4) G2-16, and (5) GDPG: GnRH 100 μg, PG 500 μg; Hormone doses for (6) Heatsynch: GnRH 100 μg, PG 500 μg, ECP 1 mg圖2 不同類型的Ovsynch技術處理流程圖Fig.2 Flowchart of different Ovsynch technologies

隨后,在Ovsynch的基礎上又出現激素替換的新技術。Thatcher等[29]提出將第2次GnRH注射替換成雌激素的Heatsynch技術(圖2),并經Bartolome等[30]研究證明該技術更適合發情后期的經產牛(Ovsynch48的27 d受胎率∶間情期∶發情后期∶發情前期∶卵巢囊腫=30.2%∶15.4%∶19.2%∶30.0%;Heatsynch的27 d受胎率∶間情期∶發情后期∶發情前期∶卵巢囊腫=24.1%∶52.2%∶24.1%∶5.0%),但其整體效果與Ovsynch無顯著差異(Ovsynch48∶Hestsynch的27 d受胎率=25.2%∶25.8%)。

另外,高產奶牛自身孕激素(P4)分泌稍低[31],而排卵卵泡在低P4濃度(<2 ng·mL-1)環境下生長會導致后續奶牛的胚胎質量受損并降低P/AI[32]。Pereira等[33]研究表明在實施Ovsynch時,PG處理時高濃度P4可以提高泌乳奶牛的繁殖力。為提高PG處理時奶牛P4濃度,由此衍生出使用孕酮陰道栓 (CIDR/PRID)的同期發情-定時輸精技術[34](圖3),它依賴含有P4的CIDR/PRID以抑制GnRH和LH分泌[35]。另外,在該技術開始實施時注射一定劑量雌激素,并在撤除CIDR/PRID時注射PG,可以加速黃體溶解,縮短黃體期,進而在給藥后約4 d誘導新的卵泡波募集,最終能夠提高孕激素處理后卵泡發育的同期率[36]。隨后,Stevenson等[37]在Ovsynch56方案中添加CIDR,以提高PG處理時低P4奶牛的P/AI。

(1)7D2PGF的激素劑量:GnRH用量100 μg,PG用量25 mg,PRID插入物含1.55 g孕酮;(2)2PGG的激素劑量:GnRH用量100 μg,CIDR插入物含1.38 g孕酮,PG用量25 mg;(3)5-day Cosynch的激素劑量:GnRH用量100 μg,CIDR插入物含1.38 g孕酮,PG用量25 mg;(4)CIDR5的激素劑量:CIDR插入物含1.38 g孕酮,PG 25 mg,GnRH 100 μg;(5)CIDR-7的激素劑量:GnRH 100 μg,CIDR插入物含1.38 g孕酮,PG用量25 mg (1) Hormone dosage for 7D2PGF: GnRH dosage 100 μg, PG dosage 25 mg, PRID containing 1.55 g progesterone; (2) Hormonal dose for 2PGG: GnRH 100 μg, CIDR containing 1.38 g progesterone, PG 25 mg; (3) Hormonal dosage for 5-day Cosynch: GnRH 100 μg, CIDR containning 1.38 g progesterone, PG dosage 25 mg; (4) Hormone dosage for CIDR5: CIDR containing 1.38 g progesterone, PG 25 mg, GnRH 100 μg; (5) Hormone dose for CIDR-7: GnRH 100 μg, CIDR containing 1.38 g progesterone, PG dosage 25 mg圖3 添加孕酮的不同類型ES-AI流程圖Fig.3 Flowchart of different types of ES-AI with progesterone

此外,從節省成本的角度出發,研究者在進行AI時注射GnRH,即Cosynch技術[38],這種技術通過改善卵母細胞成熟或黃體功能,對奶牛的排卵和P/AI產生積極作用[39]。然而,Pancarci等[40]發現,在5 d CIDR-Cosynch實施時給予GnRH并沒有影響奶牛的P/AI。另外,置入5 d CIDR奶牛的P/AI要好于置入7 d的P/AI[41],并且CIDR5方案和CIDR7方案的成本相近[42]。盡管CIDR的放置時長最好是5 d,且方案開始時使用的GnRH可以省去,但其P/AI低于其他Ovsynch技術。目前,不同的ES-TAI技術在牧場實際應用中的效果已經證實,不同的同期發情-定時輸精后P/AI相差較大,以Ovsynch+CIDR的方案效果最好(表1)。

表1 不同ES-TAI技術的應用效果Table 1 Application effects of different ES-TAI technologies

另外,馬絨毛膜促性腺激素(equine chorionic gonadotropin,eCG)是一種具有促性腺激素樣活性的糖蛋白,可促進卵泡發育,但對閉鎖卵泡無效[46]。因為它具有改善排卵的同步性并有益于胚胎發育和存活,目前已被用于同期發情-定時人工授精[47]。研究表明,在CIDR移除當天注射eCG,可以促進無發情的初產或低BCS奶牛的卵泡生長,并提高排卵率[48]。另外,有研究發現將eCG注射劑量從400 IU降低至300 IU時不會改變P/AI[49]。此外,在AI后注射其他激素也能提高P/AI。Shabankareh等[50]證明,AI后5 d注射人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotrophin,hCG)可以顯著提高Heatsynch方案實施后奶牛的妊娠率。此外,Zheng等[51]證實,AI后使用促黃體激素釋放激素(luteinizing hormone-releasing hormone A3,LRH-A3)和 hCG 均能提高奶牛妊娠率。

2.2 預同期發情-定時輸精技術(presynchronization estrous synchronization-fixed-timed artificial insemination,PES-TAI)

預同期發情-定時輸精技術的核心是預處理(presynchronization),可確保后續實施繁育方案時奶牛具備發情的3個必備事件(卵泡波出現、黃體消退和排卵)[52]。在對奶牛實施繁育方案之前進行預處理,可以將奶牛提前同步到最佳的發情階段,從而增加同步排卵奶牛的比例[53]。GnRH和PG在預處理過程中發揮重要作用。GnRH能夠誘導促黃體素(LH)的釋放,進而促使不排卵或不發情的經產奶牛排卵[54],而PG能夠促進功能性黃體溶解,促進奶牛發情。

對產后不發情奶牛不能僅靠PG進行預處理,還需配合使用GnRH。在預處理過程中給予GnRH能夠增加后續ES-TAI實施時具有功能性黃體奶牛的比率,進而提高奶牛情期受胎率[24]。PO(presynch ovsynch)技術的預處理是先通過GnRH促進卵泡發育,并利用PG消除卵巢囊腫等疾病的負面影響,以同步繁育技術處理時奶牛的生理狀態[55]。PES-TAI相較于ES-TAI可以改善卵泡生長波的同步性,增加同步發情率,從而提高奶牛的繁殖力。因此,為提高ES-TAI處理的P/AI,可在 ES-TAI技術實施前進行預處理[56]。近些年,研究者已經開發了不同的PES-TAI技術(圖4),并且實施后獲得了不同的奶牛情期受胎率(表2)。

表2 不同的PES-TAI技術的應用效果Table 2 Application effects of different PES-TAI technologies

(1)PSOv的激素劑量:GnRH用量100 μg;PG用量25 mg。(2)PG7G的激素劑量:GnRH用量100 μg;PG用量25 mg。(3)PO的激素劑量:GnRH用量100 μg;PG用量25 mg。(4)G6G的激素劑量:GnRH用量100 μg;PG用量25 mg。(5)PRE54的激素劑量:GnRH用量100 μg;CIDR含1.38 g孕酮;PG用量25 mg;(6)DO的激素劑量:GnRH 100 μg;PG 25 mg(1) Hormone dose for PSOv: GnRH dosage 100 μg; PG dosage 25 mg.(2) Hormone dosage for PG7G: GnRH dosage 100 μg; PG dosage 25 mg.(3) Hormone dosage for PO(presynch ovsynch): GnRH dosage 100 μg; PG dosage 25 mg.(4) Hormone dosage for G6G: GnRH dosage 100 μg; PG dosage 25 mg.(5) Hormone dosage for PRE54: GnRH dosage 100 μg; CIDR containing 1.38 g progesterone; PG dosage 25 mg.(6) Hormone dosage for DO (double ovsynch): GnRH 100 μg; PG 25 mg圖4 不同的PES-TAI技術流程圖Fig.4 Flowchart of different PES-TAI technologies

預處理即能增加有CL奶牛的占比,也能提高奶牛的排卵率[57]。PSOv技術是通過兩次PGF2α預處理,并在12 d后再實施Ovsynch56[58]。Giordano等[59]通過將預處理與同期技術之間的時間由12 d延長至14 d來簡化管理,但該方案依舊對無排卵奶牛沒有效果,并不能提高奶牛的繁殖性能。這是因為該技術僅使用PG進行預處理,而PG并不具備類似GnRH促進黃體和優勢卵泡發育的作用,對無CL的奶牛無效。為此,針對沒有CL的奶牛,研究者又開發了Presynch-GnRH-Ovsynch(PGO)技術,該技術利用了PGF2α只對功能性黃體有效,將GnRH整合到非周期奶牛卵泡發育中,促使黃體發育成功能性黃體,進而提高奶牛受胎率[60]。隨后,Martins等[61]也驗證了PGO相較于PSOv更有效(PGO∶PSOv=40.2%∶33.6%)。然而,預處理時間較長會降低規模化牧場奶牛繁殖管理效率。

為進一步縮短預處理時間,Bello等[62]通過開發一系列的同期技術,最終確定G6G效果最好(G4G∶G5G∶G6G的P/AI=24%∶39%∶50%,對照組Ovsynch的P/AI=27%)。另外,Dirandeh等[3]證明在開始G6G 或G7G前 14 d使用 PG,能夠明顯提高經產荷斯坦奶牛的晚期胚胎/早期胎兒存活率。

此外,Souza等[64]提出將兩個Ovsynch56(間隔7 d)結合起來形成一種新的PES-TAI技術,也稱為雙同期(double ovsynch,DO)技術。DO比PSOv處理的效果更好,這可能是因為在第二個同期GnRH注射時具有功能性黃體奶牛的比例更高[68]。隨后,Astiz和Fargas[69]證明DO方案是最適合初產奶牛的同期方法,DO 處理顯著降低了無排卵和無發情奶牛的比例。同時,Dirandeh等[56]也證實了DO相較于PO和PGO技術,可以更有效地誘導無CL奶牛的同期發情排卵。

另外,Cabrera等[65]采用人絨毛膜促性腺激素(2 500 UI hCG)代替DO方案中首次注射用的GnRH,盡管提高了奶牛的排卵率,但卻降低了奶牛的情期受胎率。同時,Allahyari等[70]通過將DO技術中首次GnRH注射替換成雌激素成功提高了奶牛的P/AI。夏季奶牛常有的熱應激會損害卵巢卵泡發育,降低奶牛繁殖效率[71],但DO技術對熱應激具有較好的抗性,Dirandeh等[56]證實在夏季高濕熱的熱應激環境下,DO方案的P/AI最高(DO∶PGO∶PO=23.2%∶16.7%∶12.4%)。此外,為了降低成本,提高牧場經濟效益,可根據奶牛的胎次和自愿等待期(voluntary waiting period,VWP)[72],對初產奶牛選用VWP較短的DO60技術[66],而對經產牛選用VWP較長的DO88技術[67]。此外,PES-TAI方案中以DO技術和G6G應用較多,并且DO技術不僅能夠使奶牛產生高的繁殖效率和好的熱應激抗性,更適合初產牛(初產P/AI∶經產P/AI=44.3%±11.4%∶31.4%±8.2%),而在經產牛中實施G6G技術后的奶牛P/AI高于實施DO技術的奶牛[69]。

3 小結與展望

不同的ES-TAI技術被廣泛應用到奶牛產后繁殖管理當中,相較于ES-TAI技術,PES-TAI不僅適用范圍廣泛,還能提高奶牛的P/AI。然而,預處理過程耗時約7～26 d,倘若預先知曉奶牛的生理狀況,并針對性的選取更適合的PES-TAI,這將會更好的提高奶牛的繁殖效率[73]。因此,牧場管理者需要結合牧場自身條件并及時評估產后奶牛生理狀況,選擇適合自己牧場的奶牛同期發情-定時輸精方案,這樣既能提高奶牛繁殖率,還能增加牧場的綜合經濟效益。

另外,在追求提高奶牛繁殖效率的同時,還應保護消費者的健康免受激素殘留物的侵害[74]。國際上已經有部分地區限制使用特定的激素,如:歐盟限制雌二醇及其衍生物的使用[60],美國不允許使用eCG[75]。因此,開發更加綠色且能夠代替傳統激素的新型可用于奶牛同期發情-定時輸精的蛋白化合物是將來研究的新方向。此外,傳統的給藥方式有其弊端,如肌肉注射會影響注射部位肉的品質,陰道栓可能會增加母畜生殖道炎癥的發病率[76]。如何更好的解決上述問題也是科學家將來需要研究的方向。

此外,目前不同激素、不同同期發情-定時輸精技術的效果還不穩定,同一種技術的處理效果也會因地、因時、因牛而異。因此,研發更加高效、穩定的同期發情-定時輸精技術也是將來亟待解決的問題。