抗菌肽在豬精液常溫保存中的應用研究進展

黃 杰,阮子豪,蔡 瑞

(西北農林科技大學動物科技學院 陜西省動物遺傳育種與繁殖重點實驗室,楊凌 712100)

精液保存技術極大推動了豬AI的應用范圍,促進了生豬產業的發展[1]。與自然交配相比,AI不僅能夠降低種公豬的飼養成本,還提高了良種利用率,打破了時空局限性。AI包括采精、稀釋、保存和輸精等多個環節,其中精液保存環節易受到細菌污染,對精子質量產生不良影響,從而降低受胎率,導致經濟損失。因此,在精液稀釋劑中添加抗菌劑來抑制細菌的繁衍是必要的選擇。在“限抗禁抗”的大環境下[2],開發精液保存劑中抗生素替代品勢在必行。抗菌肽作為生物體內的一種小分子肽,是免疫系統的重要組分,具有多種生物學功能[3]。相比于傳統抗生素,抗菌肽具有分子量小、抗菌范圍廣、殺菌速度快和活性強等優勢[2-4],因此被認為是新型抗菌藥物的重要候選分子。本文綜述了豬精液保存技術、豬精液細菌污染、抗菌肽的抑菌機制及其在豬精液常溫保存中應用的研究進展,以期為抗菌肽產品與豬精液常溫保存技術研發提供理論基礎。

1 豬精液保存技術

種公豬精液保存根據保存溫度可以分為常溫保存(15～25 ℃)、低溫保存(0～4 ℃)和冷凍保存(-79 ℃或-196 ℃)3種[5]。低溫和冷凍保存可以有效抑制精液中有害菌群繁殖,減弱細菌群對精子的毒害作用[6-7],但低溫和冷凍保存在生產實踐中仍面臨一些問題:1)公豬精液因富含不飽和磷脂,對低溫非常敏感,易遭受冷休克的影響[8];2)設備要求較高,價格昂貴,市場上與之配套的試劑和設備也較少;3)與常溫保存相比,低溫保存會降低母豬產仔率20%～30%[9];4)冷凍解凍后的精子存活率和受孕率均較低,不能達到生產應用的要求[10-11]。因此,我國大多數規模化豬場在進行人工授精時選擇常溫保存的精液。

常溫保存主要是利用弱酸環境抑制精子活動和代謝,減少能量的消耗,再恢復pH等環境條件又使精子復蘇的原理來達到保存精液的目的[12-13]。在常溫保存過程中,許多因素都會對精液品質造成影響,包括溫度、pH、滲透壓、微生物、稀釋倍數和活性氧含量等[10]。由于常溫保存精液受孕率高、投資少、人工操作方便,能帶來較高的經濟效益,因此在生產實踐中利用常溫保存的公豬精液進行人工授精已經得到了廣泛的應用。

2 豬精液細菌污染

在精液采集和保存的過程中,細菌污染是一個普遍存在的問題[14-15],根據污染來源分為內源性污染和外源性污染。內性源污染是公豬的生殖泌尿系統、前列腺、附睪受到感染,細菌可通過公豬睪丸、副性腺、包皮等途徑污染精液[16-17];而外源性污染由采精用具污染、添加劑污染、采精過程中的不當操作所引起,譬如公豬包皮清洗消毒不到位、糞便、皮毛、水源和空氣等都有可能造成精液細菌污染[18-19]。研究表明,豬精液中的細菌種類繁多,來源廣泛,如糞腸桿菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌、粘質沙雷氏菌和無乳鏈球菌等[20-21],其中大部分菌株都是由于衛生因素引起的[22-23]。因此,了解公豬精液中的細菌菌群及其抗生素耐藥性,嚴格控制精液收集和處理設備的衛生對降低細菌污染尤為重要。稀釋后的公豬精液本質上可以看作是一種細胞培養基,對細菌來說是一個理想的生長環境[16]。精子依靠精液中的營養成分進行正常的代謝活動,但在精液中存在的大量細菌會競爭環境中的營養物質,產生代謝廢物,甚至可能引發精子凝集現象,最終會影響精子的壽命、質量和活力,從而降低精液保存的效果[10],并且使用受污染的精液配種會降低受胎率,導致出現胚胎早期死亡等母豬繁殖障礙[24]。因此,在制備精液稀釋劑的過程中通過添加一定量的抗生素來防止細菌傳播和保持精液質量。但盲目地使用高劑量的抗生素會導致細菌產生耐藥性的問題[25],所以目前世界動物衛生組織(WOAH)和世界衛生組織(WHO)都在積極提倡規范、合理地使用抗生素,以降低對抗生素的依賴性。

近年來,為了避免過度使用抗生素,人們對抗生素替代物進行了大量研究,如以中草藥提取物為代表的天然提取物和納米顆粒等,發現這些替代物具有一定的抗菌效果[24,26-27]。作為豬精液抗菌劑應當滿足以下要求:1)廣泛的抗菌作用;2)對精子無毒性;3)不影響生育能力;4)高穩定性;5)在保存溫度下仍具有較高活性;6)不易引起細菌耐藥性;7)利于商業推廣和應用[28]。

3 抗菌肽

3.1 AMPs的發展

AMPs是一類廣泛存在于生物體內的小分子多肽,一般由10～100個氨基酸組成,是生物體先天免疫系統中重要的內源性防御分子之一,可有效抵御各種致病因子[29-31]。迄今為止,抗菌肽數據庫已經收錄了3 569種AMPs,根據其來源[32]可以分為(圖1):1)植物源抗菌肽,如硫素、植物防御素;2)動物源抗菌肽,如天蠶素、防御素;3)細菌源抗菌肽,如細菌素;4)原生動物源抗菌肽;5)真菌源抗菌肽;6)古細菌抗菌肽;7)人工來源抗菌肽[33]。

圖1 天然抗菌肽的來源Fig.1 The sources of natural AMPs

目前AMPs的生產方式主要有3種:天然提取、化學合成和生物工程發酵。天然提取的抗菌肽主要來源于植物,但提取過程復雜且耗時長,產量有限。化學合成方法成本高昂,不適合大規模生產和廣泛應用。相比之下,生物工程發酵利用發酵技術實現了規模化生產,且具備穩定的質量和較低的生產成本,被公認為是最佳的生產途徑[34]。

隨著氨基酸對AMPs活性影響的研究增多,發現通過更改或取代AMPs原有的非活性序列,可以獲得具有更高和更穩定抗菌活性的AMPs衍生物[35]。而AMPs涂層、AMPs水凝膠、AMPs石墨烯、AMPs納米粒等策略的出現,也為AMPs的應用奠定了堅實的技術基礎[3]。如今,AMPs已經廣泛應用于臨床治療、制藥工程、食品加工、畜牧業生產、水產養殖、疾病預防、植物保護及美容養顏等多個領域[36-38]。

3.2 AMPs的抑菌機制

AMPs與作用于細胞內特定通路或受體的傳統抗生素抑菌機制不同,大多數抗菌肽以細菌細胞膜為靶標,利用獨特的理化性質破壞細菌脂質雙層和誘導細胞內容物泄漏以產生抗菌作用,無需特定的受體,因此可以抑制細菌耐藥性的產生[39]。不同抗菌肽的抑菌機制不同,根據現有的研究報道,可以大致將其分為細胞膜損傷機制和非膜損傷機制[40-41]。

3.2.1 細胞膜損傷機制 帶正電荷的陽離子AMPs通過靜電作用與帶負電荷的細菌細胞壁相接觸,并優先與細菌細胞質膜中的負電荷磷脂基團如磷脂酰甘油和心磷脂相互作用,取代穩定這些磷脂基團的二價陽離子,造成膜擾動[31-33]。抗菌肽普遍具有疏水性和兩親性結構,可以增加細胞膜的通透性,導致膜結構改變,破壞穩態,溶解細胞膜,促進內容物釋放以實現抗菌功能[32]。細胞膜結構與成分的不同是AMPs選擇性殺傷原核生物的一個主要因素[42]。與原核生物細胞不同,哺乳動物細胞膜外層脂質則主要由卵磷脂和鞘磷脂等兩性離子磷脂組成,而且含有真核細胞所特有的固醇類物質,這類物質的存在可以提高膜的穩定性[43]。該機制也在一定程度上解釋了AMPs可能是通過利用腫瘤細胞病變等真核細胞的膜脂質成分的改變或排列的變化來產生抑癌效果[44]。研究表明,抗菌肽的物理化學性質,如氨基酸序列、分子量大小、陽離子性質和兩親性等[45],在肽-膜相互作用中起著至關重要的作用,并決定其作用方式[40],目前認可度較高的有3種模型(圖2):環形孔模型(toroidal-pore model)[46-47]、桶-板模型(barrel stave model)[48-49]、毯式模型(carpet model)[50-51]。因此,絕大多數抗菌肽可以與細胞膜相互作用,插入到膜中形成孔道或通道,破壞細菌膜的完整性,導致細菌溶解和死亡。

圖2 抗菌肽抑菌機制Fig.2 The antibacterial mechanism of AMPs

3.2.2 非膜損傷機制 盡管AMPs的抑菌作用最初是由膜活性機制描述的,但近年來,人們已經了解到許多AMPs不同于與細胞膜相互作用的抑菌方式,主要有以下幾種[52](圖2):1)抑制細胞壁生成;2)與核酸物質相結合;3)抑制核酸或蛋白質合成;4)抑制酶的活性;5)引起胞內物質的絮凝反應;6)抑制隔膜形成以改變細胞膜。Omardien等[53]研究發現,AMPs中的桿菌肽(Bacitracin)和萬古霉素(Vancomycin)可選擇性地與脂質Ⅱ結合,干擾細胞壁成分肽聚糖(PGN)的生物合成,從而破壞細胞壁的完整性。布福林Ⅱ(Buforin Ⅱ)可以穿透脂質囊泡而不影響膜通透性,并與DNA和RNA結合來抑制細胞功能,從而導致細胞快速死亡[54]。魚類抗菌肽pleurocidin的衍生物,在其有效抑菌濃度時可以抑制DNA和RNA的合成而不引起細胞膜的透化[55]。Upert等[56]研究表明,富含脯氨酸的抗菌肽(PrAMPs)通常具有高含量的脯氨酸和精氨酸殘基,其主要通過抑制細菌蛋白質合成來影響細胞內活性。豬小腸抗菌肽PR-39可以通過阻止蛋白質的生物合成,誘導在DNA復制過程中的關鍵蛋白質降解,從而抑制細菌的繁殖生長[57]。來自牛和寬吻海豚的PrAMPs、bactenecin 7(Bac7)和Tur1A通過與核糖體相互作用來抑制翻譯過程,阻斷從起始階段到伸長階段的過渡[58-59]。陽離子抗菌肽Mel4能通過激活細菌內部的自溶酶來誘導細菌死亡[60]。Otvos等[61]發現,許多AMPs靶向于DnaK蛋白,抑制金黃色葡萄球菌細胞內酶的活性,導致蛋白質錯誤折疊和聚集,最終導致細菌死亡。此外,AMPs還能與脂多糖結合,并作為免疫細胞的化學引誘劑結合細胞受體,調節細胞因子和趨化因子的表達[62]。可見,部分抗菌肽可以抑制核酸、蛋白質和一些合成細胞壁和細菌生長的必需酶的生物合成來抑制甚至殺死細菌。

上述AMPs的抑菌方式與細菌細胞膜的結構和性質以及抗菌肽所含的氨基酸組成有著密不可分的關系。一般來說,抗菌肽的疏水性越強,膜干擾越強,細胞選擇性越差;而電荷密度越高,肽與膜之間的靜電作用越顯著,對哺乳動物細胞毒性越弱[63]。

4 AMPs在豬精液常溫保存中的應用

AMPs因具有優越的理化性質和獨特的殺菌機制,一直以來備受學者的關注與青睞。在過去幾十年中,越來越多的研究人員投身于AMPs的產品開發與應用之中[2]。AMPs在各個領域中都展現出了巨大的潛力,尤其在畜牧業生產方面得到了迅猛的發展。Schulze等[64]研究表明,豬精液稀釋液中添加低濃度的環狀六肽(4 μmol·L-1c-WFW)可以代替抗生素,且母豬產仔存活率達到了88.9%(表1),這使其成為極具前景的精液保存候選藥物,具有重要的研究價值[65]。

表1 抗菌肽在豬精液常溫保存中的研究Table 1 Studies on the effects of antimicrobial peptides in preservation of porcine semen at room temperature

4.1 AMPs對常溫保存過程中細菌的影響

在種類繁多的AMPs中,有研究稱富含精氨酸(R)和色氨酸(W)的短環肽表現出高抗菌活性和對真核細胞的低毒性作用[66]。Speck等[67]通過體外試驗驗證了富含R和W的環狀六肽c-WWW、c-WFW和一種螺旋magainin II酰胺類似物(MK5E)對2種革蘭氏陽性菌和11種革蘭氏陰性菌的體外抗菌活性,結果表明合成陽離子抗菌肽在體外對不同的革蘭氏陰性和革蘭氏陽性細菌絕大多數具有活性,個別菌種可能因為能夠合成切割線性陽離子AMPs的蛋白酶而不受影響,如大腸桿菌、陰溝腸桿菌和金黃色葡萄球菌。Hensel等[68]研究發現,C16-KKK-NH2和C16-KKKK-NH2兩種短抗菌脂肽不會對精子質量產生不利影響,且均導致菌落形成單位(CFU)計數總體降低,和對照比,革蘭氏陽性桿菌減少40%,革蘭氏陰性桿菌減少60%。王健等[69]和Fang等[70]研究表明,蛋氨酸碘(IM)可以抑制變形桿菌門和葡萄球菌屬以及假單胞菌的增殖。魏寧等[71]發現,ε-聚賴氨酸(ε-PL)能夠改變細菌的增殖和組成,可以有效控制精液中細菌的生長,提高關中黑豬精液的保存效果。2023年Keeratikunakorn等[72]研究報道了益生菌衍生的無細胞上清液(CFS)對從公豬精液中分離出的攜帶抗菌抗性基因的致病菌具有抑制作用,認為CFS含有的抗菌肽或細菌素成分抑制了精液來源的致病菌,但仍需要進一步的研究來確定該CFS中抗菌化合物的組成,來構建和合成這些AMPs。因此,抗菌肽在豬精液常溫保存過程中可以通過細胞膜損傷機制和非膜損傷機制發揮抗菌作用,具有替代抗生素起到防止細菌污染的潛力。

4.2 AMPs對常溫保存過程中豬精子質量的影響

公豬的精液品質是其繁殖力的基礎,同時也是發揮公豬遺傳性能的重要保障[73]。精液質量的好壞直接影響到豬場的配種受胎率、產仔數、健仔數和經濟效益,豬精液保存期間所有工作的最終目標都是為了盡可能提高AI時使用精液的質量。AMPs對于豬精子的毒害作用,是豬精液保存過程中不可忽視的關鍵一環。Schulze等[64]發現,2 μmol·L-1的c-WWW和4 μmol·L-1的c-WFW能抑制精液制劑中的細菌生長,且4 μmol·L-1的c-WFW能夠增強精子的線性運動;而MK5E(20 μmol·L-1和40 μmol·L-1)卻對精子運動產生負面影響,這與Reddy等[74]研究報道的由蛙皮素(magainins)引起的精子活力降低的結論一致,說明肽的氨基酸組成在一定程度上決定了肽與精子的相容性。Bussalleu等[75]評估了富含脯氨酸和精氨酸的抗菌肽(PR-39)、豬髓系抗菌肽36(PMAP-36)和37(PMAP-37)3種AMPs對于精子的安全性,發現抑菌效果隨AMPs濃度增加而顯著增加,但精子活率隨著AMPs的濃度增加而顯著降低,這與Sancho等[76]對抗菌肽蛋白1(PG1)的研究結論一致,都表明了豬精子對肽的濃度和時間依賴性,因而需要選擇合理的AMPs濃度才能保證抑菌效果和精液品質。Puig-Timonet等[77]揭示了豬β防御素-1(PBD1)和豬β防御素-2(PBD2)添加量為3 μmol·L-1時具有顯著的抑菌作用,且不會對精子活力產生顯著影響,在5 μmol·L-1時觀察到兩種肽的輕微殺精作用;PBD1和PBD2分別在3 μmol·L-1和5 μmol·L-1時對細菌生長的抑制作用最高,有必要進一步研究評估PBD1和PBD2在3 μmol·L-1對體內生殖性能的影響。Shaoyong等[78]研究表明,0.16 g·L-1ε-PL可顯著改善精子活力、質膜完整性、線粒體膜電位和頂體完整性等精子質量參數。除此以外,Sancho等[76]發現適當的AMPs濃度能在發揮抑菌作用時,不會對滲透壓和pH產生影響。Fang等[70]提出了80 μmol·L-1IM是最適添加濃度,同時驗證了AI后30 d的不返情率和80 μmol·L-1IM組的窩產仔數分別為90%和11.3,但仍需要更多的研究來了解常溫保存豬精液中IM的抗菌機制。綜上所述,抗菌肽可以保護豬精子免受細菌污染和調節豬精子周圍環境的免疫響應,維持豬精子的穩定性和活力,提高精液品質。

4.3 AMPs與抗生素的協同作用

肽和螯合產物之間的協同作用或肽與常規抗生素之間的協同作用,是微生物學中普遍的現象[79]。Speck等[67]與Schulze等[64]發現,c-WWW和c-WFW能夠抑制精液制劑中的細菌生長,特別是與低濃度慶大霉素聯合使用時,母豬繁殖力并未受到不良影響。魏寧等[71]和Shaoyong等[78]驗證了將0.16 g·L-1ε-PL與0.125 g·L-1慶大霉素聯合使用的抗菌效果與單獨使用0.25 g·L-1慶大霉素的效果相似,0.16 g·L-1ε-PL能夠通過降低細菌濃度和破壞細菌群落組成來改善精子質量參數、精子活力和體外受精能力,有望替代慶大霉素。

綜上,AMPs已經在豬精液常溫保存過程中展現出強大的抑菌作用,c-WFW、PMAP-37、IM、ε-PL、C16-KKK-NH2和C16-KKKK-NH2等AMPs已成為豬精液常溫保存中減抗替抗的有力候選者。但由于膜成分和結構的特殊性,豬精子比一般的真核細胞更容易受到抗菌肽的影響,因此目前還需對有潛力的AMPs進行進一步的安全性評估[44,81-82],探究其與細菌和精子的互作機制,篩選、設計、合成出高抗菌活性和對精子的低毒性作用甚至無毒性的AMPs,才能進一步推動AMPs在精液保存領域的發展,早日實現AMPs作為豬精液稀釋液添加劑在生豬產業上的應用[83-85]。

5 總結與展望

在豬精液常溫保存過程中,細菌污染是不可避免的。隨著細菌耐藥性的增加以及禁抗政策的實施,我們亟需尋找精液抗菌替代品來抑制細菌的繁殖。抗菌肽具有分子量小、抗菌范圍廣、殺菌速度快和低耐藥性等優點,因此將其應用于豬精液保存稀釋劑中可為抗菌替代品研究提供新的思路。

隨著合成生物學等新型交叉學科的快速發展,給抗菌肽的篩選、設計、合成提供新的研究思路與技術平臺,使得抗菌肽應用于豬精液稀釋劑以提高常溫保存效果的研究具有廣闊的應用前景。其中主要的可行的發展策略包括:1)利用計算機對抗菌肽結構進行分析,預測抗菌肽的抗菌活性、空間構象、突變體等性能,實現抗菌肽的高通量篩選,設計出兼具廣譜抗性和低精子毒性的新型抗菌肽;2)基于合成生物學技術,利用CRISPR/Cas9等新型的基因編輯技術對天然抗菌肽基因進行定向編輯,例如增加、替換、刪除某些氨基酸殘基,減少抗菌肽對精子的毒性,增加抗菌肽的抗菌性能;3)篩選優化新型生物合成菌株系統,完善抗菌肽生物合成的工業化體系,簡化純化程序,降低生物合成成本;4)與現有抗生素聯合使用,增強抗菌效果,避免耐藥性,降低抗生素或抗菌肽的毒副作用;5)與納米、生物、材料結合,提高抗菌肽穩定性,降低對精子的毒性;6)隨著抗菌肽的發展,也應逐步完善抗菌肽的法律法規,從整體上改善我國的生豬養殖水平。