引導編輯技術的研究進展及應用

邱梅玉,張雪梅,張 寧,劉明軍

(新疆畜牧科學院生物技術研究所 農業農村部草食家畜遺傳育種與繁殖重點實驗室新疆動物生物技術重點實驗室,烏魯木齊 830026)

在過去的十年中,CRISPR/Cas9技術允許精確靶向基因組位點的修飾是具有變革性的。在真核生物中,當不存在修復模板時雙鏈斷裂(double strand break, DSB)可能引入錯配堿基對的非同源末端連接修復(non homologous end joining, NHEJ)途徑對斷裂位點進行修復,這種修復會造成堿基插入或缺失,從而導致該基因編碼蛋白的移碼突變引起基因敲除;而當存在修復模板時,精確的同源重組修復(homologous recombination repair,HDR)途徑對斷裂位點進行修復實現基因敲入或點突變[1]。細胞傾向于利用 NHEJ 來修復 DSB,造成 HDR 的效率偏低,因此 CRISPR/Cas9 系統無法高效地誘導點突變等編輯類型[2]。此外,通常情況下 NHEJ 和 HDR 兩種修復途徑同時存在且相互競爭,而且 NHEJ 效率比 HDR 高。因此,大多數編輯結果通常會同時發生插入或刪除(insertions and deletions, Indels)編輯[3]。

隨著CRISPR/Cas9 技術的不斷發展衍生出堿基編輯技術 (base editing) ,通過將失去切割能力的核酸酶與不同堿基脫氨基酶融合,構建胞嘧啶堿基編輯器 (cytosine base editor,CBE) 和腺嘌呤堿基編輯器 (adenine base editor,ABE)。這兩類編輯器能夠在不產生 DNA 雙鏈斷裂的前提下在基因靶位點完成 C>T (G>A) 或 A>G (T>C) 的替換,最終實現精準的堿基編輯。目前堿基編輯技術已經廣泛應用于基因治療、動物模型構建、精準動物育種和基因功能分析等領域[4]。然而,單堿基編輯器會在高效編輯單堿基的同時產生嚴重的脫靶突變,并且不能實現堿基之間的顛換(A-T 或 C-G)[5-6]。

引導編輯系統(prime editing,PE)通過對靶位點的“搜索”和“替換”,可以實現 12種堿基之間的任意顛換及小片段的精準插入和刪除,克服CRISPR/Cas9 系統介導的 HDR 效率低和堿基編輯系統不能實現堿基顛換的弊端,具有明顯的優勢[7-8]。

1 引導編輯系統的原理及特點

引導編輯系統包括 Cas9 切割酶(Cas9 nickase,nCas9)、逆轉錄酶 (reverse transcriptase,RT)和 引導 RNA(prime editing guide RNA,pegRNA),其中 nCas9 與 RT 融合在一起。pegRNA 的 3′端又延伸出了一段 RNA 序列,包括引物結合位點(prime binding site,PBS)序列和含有目標編輯序列的RT 模板 (reverse transcriptase template,RT template)[9]。利用 nSpCas9 (H840A)和逆轉錄酶(moloney murine leukemia virus reverse transcriptase,M-MLV RT)融合構建引導編輯器(prime editor),由 pegRNA 中 guide RNA 部分引導在人細胞基因組靶位點附近形成編輯鏈上的單鏈切口,進而通過pegRNA中的PBS序列引導以含有目標編輯序列的逆轉錄模板將突變精確導入基因組中(圖1)[10-11]。

圖1 引導編輯系統模式圖(引自[11])Fig.1 Schematic Illustration of Prime Editing, as Proposed by [11]

相較于 CRISPR/Cas9 系統通過 HDR 途徑引入點突變、插入或刪除,引導編輯系統不依賴 DSB 避免產生過多的 indels 。堿基編輯系統作用過程中會引起鄰近非靶點堿基編輯,而引導編輯系統通過逆轉錄模板產生目標突變避免indels的產生。對PE3 來說,雖然另一條 sgRNA 的引入造成indels 的增加,但 indels 的水平大多數在10%以下[7]。另外,CRISPR/Cas9 和堿基編輯系統均存在sgRNA 依賴性脫靶,堿基編輯系統還存在sgRNA 非依賴性脫靶和RNA 脫靶,而引導編輯系統在基因組靶位點上引入目標編輯過程中,需要發生 3 種核酸雜交:靶向區域 DNA 與 pegRNA 的 spacer 的雜交、靶向區域 DNA 與 pegRNA 的 PBS 序列的雜交、靶向區域 DNA 與逆轉錄產物的雜交,3 種雜交的存在決定引導編輯系統在理論上很難脫靶[12]。

2 引導編輯的編輯效率優化及衍生技術

引導編輯系統雖然優勢明顯,但其早期版本的編輯效率均較低,極大限制了其應用(表1)。目前,Liu 等[13]在 SpCas9 與 M-MLV 序列的 N 端和 C 端添加 c-Myc NLS 和 SV40 NLS,構成PE2*;用 SaCas9 和 SaCas9KKH 變體替換 SpCas9,構成 SaPE2*和 SaKKHPE2*編輯效率分別為5.6%～11.3%和1.3%～4.2%。Xu等[14]構建 PE-P2,利用自切割多肽 2A 串聯表達引導編輯系統和篩選標記,強化sgRNA使水稻基因組中靶位點突變效率從 1.2%提高到 26%。同時發現在 RT 模板中引入同義錯配堿基和 nCas9 的 C 端融合 M-MLV 均可提高引導編輯系統的編輯效率,結合使用時水稻、玉米原生質和人細胞中的平均編輯效率分別達到 24.3%、6.2%和 12.5%[15]。Lu 等[16]通過密碼子優化和 CaM35 S 啟動子優化提高PE在番茄中的編輯效率。

表1 引導編輯的衍生技術Table 1 Technologies derived from prime editing

對 nCas9-MMLV 融合蛋白多個方面進行優化(MMLV 的優化密碼子、 Cas9n 突變體、Cas9n 與 MMLV 添加連接序列和增加 NLS 序列),構建出具有更高編輯效率的 PEmax[17]。

為了進一步提高引導編輯系統的編輯效率,Chen等[17]、Zhang等[18]、 Liu等[19]進行CRISPR 干擾(CRISPR interference,CRISPRi) 篩選,發現 DNA 錯配修復(DNA mismatch repair,MMR)相關基因抑制引導編輯的效率,并增加 indels比例。Ferreira Da Silva 等[20]研究表明,通過消除 MMR,引導編輯系統的編輯效率可提高2～17 倍。Jiang 等[21]在引導編輯系統基礎上研發 PE-Cas9-based deletion and repair (PEDAR),精確進行1～10 kb片段的刪除和60bp的插入編輯效率為12.5%～22.5%,Choi等[22]設計PRIME-Del 編輯系統精確進行大于10 kb片段刪除和30bp插入編輯效率為1%～30%。Anzalone 等[23]開發 twin prime editing (twinPE) 編輯系統使用成對的pegRNA 進行780 bp 的刪除、20 bp～1 kb 的插入、整合基因DNA質粒>5 kb和 40 kb的目標序列倒置,相比PEDAR 和 PRIME-Del 會產生更少的indels。Wang 等[24]開發 GRANDE diting 系統,利用一對特殊設計的 pegRNA 在不同細胞中編輯實現長達 1 kb DNA 片段的靶向插入編輯效率分別為6.5%～35.2%、11.5%～57.0% 和3.3%～6.5%。

引導編輯系統發揮作用時pegRNA 的 3′端延伸未被融合蛋白包裹,容易被核酸酶降解。為解決這一問題,通過對 pegRNA 的 3′端添加 RNA 結構基序(G-quadruplex[25]、xrRNA[26]G-四鏈體[25]和 tevopreQ1(trimmed evopreQ1)[25]等)來增加 pegRNA 的穩定性,進一步提高引導編輯系統的編輯效率。添加 tevopreQ1 的epegRNA 與 MLH1dn 和 PEmax 協同作用可顯著提高編輯效率,其中 PE4max 和 epegRNAs 在 Hela 細胞和 HEK293 T 細胞中的編輯效率分別提高72 倍和3.5 倍;PE5max 和 epegRNAs 在 Hela 和 HEK293 T 細胞中的編輯效率分別提高12 倍和 1.6 倍。Zhang 等[18]在pegRNA的3′端添加病毒抗核糖核酸酶外基序(xrRNA)提高其對降解的抗性,發現xrPE在給定的細胞類型中堿基替換、小缺失和插入的編輯效率分別提高3.1、4.5和2.5倍。Liu等[19]將20 bp Csy4識別位點與經典pegRNA的3′端融合,該位點自然存在于I-F型CRISPR/Cas9系統中形成發夾可抑制pegRNA 環化。Li 等[27]通過在pegRNA的逆轉錄模板的適當位置引入同義突變來開發spegRNA,將PE的平均編輯效率提高353倍。通過改變pegRNA的二級結構來開發apegRNA,使PE的平均編輯效率提高2.77倍。當spegRNA和apegRNA用于PE3和PE5系統時,sPE3、aPE3、sPE5和aPE5系統的編輯效率都顯著提高。盡管在單個pegRNA中連接間隔區和模板序列可以確保它們在引導編輯過程中的相近性,但分離這些成分也可進行PE編輯。Liu 等[28]設計了一個分離的pegRNA系統,該系統由靶向PE的正常sgRNA、含有PBS、RT模板的線性或環狀引物編輯模板RNA(petRNA)組成。petRNA還包含MS2發夾,通過結合融合的MS2外殼蛋白,促進其募集到RT。Feng 等[29]建立了一種類似的編輯系統稱為Split pegRNA引導編輯(SnPE)。這兩項研究都表明,用單獨的sgRNA和模板RNA進行PE編輯是可行的。另外,PBS 和 RT 模板的長度與編輯效率沒有絕對的對應關系,通常需要設計不同長度的 PBS 和RT 模板進行編輯嘗試,前期相關研究中建議 PBS 和RT 模板的起始長度為 13 nt和 10～16 nt,但是當編輯位點的 G/C 含量超出 40%～60%時可適當延長或縮短 PBS 長度,并且 RT 模板與 sgRNA 骨架 3′端連接的第一個堿基不能是 C[7]。Lin 等[30]發現引導編輯系統在植物中 PBS 的Tm 值為 30 ℃時編輯效率最高,Tm 值過低或過高都會影響編輯效率,用雙 pegRNA 將編輯效率提高 1.8～4.2 倍,并且沒有產生額外的插入或缺失突變。

另外,通過piggyBac 載體[31-32]、腺病毒載體[33]遞送引導編輯系統或將引導編輯系統構成一元載體[34]、 引導編輯系統分離成多個載體進行基因編輯[30]。引導編輯系統中加入HPT 抗性基因構建 pPE2、pPE3/3b,發現水稻中pPE2系統可以在不同的基因組位點誘導編輯,在轉基因T0植物中pPE2產生的突變體發生頻率為0～31.3%,這表明pPE2的效率在不同的基因組位點和不同結構下差異很大,并將HPT-ATG 回復突變加入到篩選過程中構建 surrogate PE2 系統,該系統能夠富集編輯細胞提高編輯效率[35-37]。Oh 等[38]利用 SpCas9 的同系物 FnCas9 構建新的引導編輯系統,SpCas9 是在 PAM 上游 3～4 bp 之間對非靶向鏈進行切割,而 FnCas9 的切割位置在 PAM 上游 6～8 bp 之間,且FnCas9 和 SpCas9 識別同樣的 NGG PAM,因此 FnCas9 的引導編輯系統具有更大的編輯窗口,擴大PE 的編輯范圍。

3 引導編輯系統的脫靶效應

目前針對全基因組的特異性分析發現不會產生顯著的單核苷酸水平脫靶及indels,由于逆轉錄酶介導的在引物序列之外的延伸,引導編輯可能會在目標位點引入小的插入,但其脫靶率遠低于 CRISPR/Cas9 和 BE 編輯系統[39]。Zong 等[40]測試engineered plant prime editor (ePPE)對pegRNA中錯配的耐受性,包括在水稻原生質體中的間隔區或引物結合位點和間隔區中的錯配,ePPE在內源性位點的脫靶效應包括11個pegRNA的間隔區中的1～3個錯配,共導致29個脫靶位點。深度測序顯示除了OsCDC48-T1(OT-22)外ePPE和PPE在所有檢測位點都表現出非常低的引導編輯脫靶效率,與PPE相比ePPE表現出更高的誘導編輯效率。Nelson等[41]測試每個靶向位點的前4個位置的indel產生和核苷酸變化,并比較PE3處理后epegRNAs和未修飾的pegRNAs之間的脫靶編輯,發現在檢測位點epegRNAs和pegRNAs均表現出≤0.1%的引導編輯脫靶和indels產生,表明epegRNAs和pegRNAs表現出相似的脫靶編輯水平。Gao等[42]進行基因組和轉錄組測序分析,發現在人類細胞中引導編輯不會產生 gRNA 非依賴性 DNA 和 RNA 脫靶。Geurts等[43]利用全基因組測序檢測引導編輯修復類器官的脫靶效應,發現在靶位點產生不同的編輯效率和突變,并強調引導編輯系統在建模致癌突變方面的廣泛適用性。Habib等[44]比較引導編輯和堿基編輯以糾正來自α1-抗胰蛋白酶(A1AT)缺乏癥患者誘導多能干細胞中的疾病相關突變,發現引導編輯的逆轉錄酶結構域不會導致基因組中gRNA非依賴性脫靶突變。總之,引導編輯系統相比 CRIPSR/Cas9 和堿基編輯系統具有更高的特異性,也更加安全,但仍需進一步降低其脫靶風險。

4 引導編輯系統的應用

由于引導編輯系統強大的編輯功能及普遍性,已迅速應用在各物種及各個研究領域中,本文將概述其中的一些進展(表2)。

表2 引導編輯系統的應用Table 2 The applications of prime editing system

4.1 引導編輯系統在動物中的應用

Park等[45]利用引導編輯系統完成編輯頻率高達47%的Igf2突變小鼠,并觀察到該性狀可在種系傳遞、無脫靶效應。Gao等[46]比較HDR和PE2在小鼠中對CArG box轉錄因子結合位點的編輯作用,對創制小鼠的分析發現成功編輯HDR(20/37)的動物數量大約是PE2(12/47)的兩倍,但HDR創制的小鼠存在不同位置上的indels產生。研究表明使用PE腺病毒修復苯丙酮尿癥小鼠模型中的Pah F263 S突變[47]。Qian等[48]利用引導編輯系統建立TSD兔模型,并對HEXA中的TATC兔模型中肌無力、共濟失調和精神障礙的典型表型進行了表征,發現PE2和PE3編輯效率分別為4.1%～15.4%和8%～37.5%。Kim等[49]確定引導編輯在犬中的可行性并利用其生產犬髖關節發育不良相關基因矯正犬。Liu等[50]通過顯微注射將PE3 mRNA和靶向Hoxd13(G/C和G/T)位點的pegRNA注射到小鼠胚胎中,編輯效率分別在27%和10.5%,indel效率在0%～0.3%。Petri等[51]在斑馬魚胚胎中使用純化核糖核蛋白復合物(RNP)PE編輯技術引入所需的突變,編輯后發現精準刪除和插入編輯效率分別為4.13%～33.61%和0.10%～18%并且形成較少的副產物。Bosch等[52]通過雜交在生殖細胞中表達gRNA和PE2蛋白的轉基因果蠅產生引導編輯的黑腹果蠅。Atsuta 等[53]通過PE與轉座子介導的基因組整合、藥物篩選和單細胞培養方法相結合,產生引導編輯的雞成纖維細胞和原始生殖細胞(PGCs)。Aida等[54]利用引導編輯技術在小鼠胚胎中引入10種靶向修飾包括替換、刪除和插入,表明在哺乳動物受精卵中引導編輯具有高效性。

4.2 引導編輯系統在植物中的應用

在單子葉植物引導編輯系統中,研究表明PEs可以精確編輯水稻原生質體和小麥的基因組,其效率通常低于10%[38,55]。Hua等[56]在水稻中構建包含CaMV 35 S啟動子驅動的非活性EGFP序列的Sp-PE2和Sp-PE3,通過后期篩選發現Sp-PE2和Sp-PE3水稻的編輯效率分別為15.6%和17.1%。Lin 等[57]通過密碼子、啟動子和編輯條件優化,使引導編輯系統能夠在水稻和小麥原生質體中進行點突變、插入和缺失,獲得再生的引導編輯水稻植株編輯效率高達21.8%。Xu等[58]利用引導編輯系統對水稻植株中的OsACC1進行突變,并在篩選鑒定出抗除草劑變異植株。引導編輯系統在雙子葉植物中也表現出了活性,這些植物比單子葉植物更難轉化。Lu等[16]通過優化引導編輯系統發現可介導二倍體番茄中0.025%～1.66%的基因編輯。Biswas等[59]在水稻、花生、鷹嘴豆和豇豆原生質體中利用引導編輯系統編輯了一個突變的GFP,在水稻中,雙pegRNA的編輯效率是含單pegRNA的16倍。在用雙pegRNA轉化后,花生、鷹嘴豆和豇豆也獲得經過編輯的突變GFP原生質體,盡管編輯效率比水稻低得多從0.2%～0.5%不等。Jiang等[60]利用引導編輯系統編輯玉米發現在ZmALS1和ZmALS2中分別有53.2%(33/62)和6.5%(4/62)的轉基因系攜帶S621I和W542 L突變;在兩個ALS基因中分別有4.8%(3/62)和4.8%(4/62)的品系攜帶純合S621I突變和S621I/W542 L雙突變。

4.3 引導編輯系統在基因治療中的應用

基因治療是基因編輯工具的一項重要應用,使用基因編輯工具直接修復致病突變有望治愈人類遺疾病[61]。基因治療方法通常不能恢復自然條件下的基因調控,不能隨著時間的推移而一直表達且遞送大片段的基因,而治療遺傳疾病的理想方法是永久糾正基因組原位置的致病突變。引導編輯作為糾正人類基因組致病突變的治療工具具有明顯的優勢,原則上可以糾正高達89%的與人類疾病相關的已知遺傳變異。

在培養的細胞系中,引導編輯已被證明可以直接糾正HEXA中導致Tay-Sachs的4 bp插入,導致鐮狀細胞病的HBB E6V突變及CDKL5缺乏障礙的單堿基缺失[17]。在人類類器官模型中,引導編輯能夠修復與DGAT1缺乏、威爾遜病和囊性纖維化相關的突變[46,62]。PEs可以通過精確刪除SMN中的內含子剪接沉默來拯救脊髓性肌萎縮的人iPSC模型中全長SMN的表達[63]。Chemello 等[64]利用引導編輯技術插入2 bp,在Duchenne肌營養不良的人iPSC模型中恢復DMD閱讀框。Geurts等[43]對囊性纖維化CFTR-F508del突變進行了功能修復,并將引導編輯與CRISPR/Cas9介導的CFTR-R785*突變的同源性定向修復和腺嘌呤堿基編輯進行比較,發現引導編輯修復類器官的全基因組測序結果中未檢測到脫靶效應。Jang等[65]通過玻璃體內或視網膜下注射DNMT1和ATP78,發現引導編輯效率可達約1.8%的點突變。當來自隱性營養不良大皰性表皮松解癥(RDEB)患者的COL7A1突變成纖維細胞時,利用引導編輯矯正成纖維細胞移植到免疫缺陷小鼠中獲得RDEB模型[66]。Li 等[67]開發的一種矢量化引導編輯系統可在體內S鐮狀細胞病(SCD)小鼠模型(CD46/Townes小鼠)中直接修復造血干細胞(HSC)中的SCD突變,43%的HbS被HbA取代從而大大減輕SCD表型。

5 引導編輯系統設計工具

與長度只有20 nt的傳統gRNA的基因敲除和堿基編輯相比,PE存在更復雜的pegRNA結構。雖然手工設計pegRNA是可行的,但也需要仔細考慮pegRNA的設計規則(包括原間隔子位置、有利的PBS和RT模板以及鏈方向)。然而,這使得過程復雜容易出錯并且對大規模的設計存在限制。

目前已經開發一些在線軟件,幫助設計合適的pegRNA和nick sgRNAs(ngRNA)(表3)。Hsu等[68]開發PrimeDesign用于 pegRNA 的設計(SpCas9)并利用此工具構建全面和可搜索的數據庫—PrimeVar,該數據庫包含超過68 500 種人類致病性遺傳變異的模擬和糾正的 pegRNA 和ngRNA組合。Chow 等[69]開發pegFinder進行PE2和 PE3 pegRNA設計(支持SpCas9,SpCas9-NG,Cas9-SpRY),還給出不同長度的PBS 序列和RT 模板供科研人員選擇。Anderson等[70]設計pegIT同時設計用于靶基因PCR擴增的引物,并且在軟件中也報告pegRNA和ngRNA(SpCas9,SpCas9-NG,CjCas9,SaCas9,SaCas9-KKH)間隔區的潛在脫靶位點。Hwang等[71]向引導編輯系統應用者提供兩個免費的網站 PE-Designer和 PE-Analyzer。PE-Analyzer是PE結果分析的專用工具接受高通量測序數據,在表中總結突變相關信息并提供交互式圖表。PE-Designer主要是用JavaScript編寫可進行 pegRNA(SpCas9,SpCas9-NG,SpCas9-VRER,SpCas9-VQR,Cas9-SpRY ) 的設計,包括目標序列潛在的靶位點、pegRNA 延伸序列及ngRNA的序列。Lin 等[30]基于PBS 序列設計和雙pegRNA (NGG-pegRNA 和 CCN-pegRNA)的策略開發了植物 pegRNA ,為使用者提供包括PAM 序列、spacer 的 GC 含量、 引導編輯窗口、PBS 長度、推薦的 PBS的Tm 值和RT 模板同源臂長度等一系列參數選擇。Standage-Beier等[72]開發PINE-CONE用于pegRNA的高通量設計。Siegner等[73]開發PnB Designer用于PE的pegRNA和BE(SpCas9)的gRNA的設計。Li等[74]開發基于機器學習的程序Easy-Prime,用于PE的pegRNA(SpCas9)的設計提高編輯效率。

表3 pegRNA 設計軟件Table 3 Software for pegRNA designing

6 問題與展望

PE技術的快速發展,極大地提高對真核細胞基因組進行精確修飾的能力。與CBE和ABE產生的編輯效率分別為50%和40.87%～64.22%相比,引導編輯系統的編輯效率相對較低,目前研究均基于改造PE蛋白及pegRNA結構[75-76]。與其他基因編輯技術相比,引導編輯技術具有多能性、產物純度和目標序列的特異性,推動了許多創新性研究,對于動植物精準育種和微突變引起的疾病治療等方面有很大的應用潛力。

引導編輯系統已在多個物種中進行成功編輯,有廣泛的普適性,但仍存在的問題限制了其在農業、畜牧業、基礎生物醫學研究和臨床轉化中的廣泛應用。與Cas9相比PE可誘導較低的脫靶編輯,但當使用ngRNA時雖然提升了編輯效率同時也造成了更多的indels。PE編輯通常很難在沒有重組酶的幫助下有效地插入或替換超過100 bp的DNA[77]。PE編輯器M-MLV RT部分中的RNase H結構域可以與蛋白質翻譯終止因子eRF相互作用,促進終止密碼子的通讀,當完整的PE2被轉染到細胞中時,可能會造成整體蛋白的翻譯效率降低[78]。此外,通過消除MMR提升PE4和PE5編輯效率,但額外添加的MLH1dn使其尺寸達到約8.7 kb,限制了AAV包裝和體內傳遞[17]。目前,有許多pegRNA設計工具可用,但沒有一個提供排名評分來告知用戶哪些是強烈推薦的pegRNA。因此,需要建立一個更全面、更準確的計算模型,以減少密集的pegRNA的構建和篩選過程。總之,引導編輯系統在動植物基因功能研究和育種方面有非常廣闊的前景,并且該技術有可能成為一種新的基因治療形式,以安全、高靶向的方式插入治療基因替代突變或缺失的基因。