宿州產(chǎn)香茶菜無機元素指紋圖譜研究及安全性評價*

余秀萍，汪正宇，李變變，崔 燦

（安徽省宿州市食品藥品檢驗檢測中心，安徽 宿州 234000）

香茶菜為唇形科植物香茶菜Rabdosia amethystoides（Benth.）Hara 的干燥地上部分［1］，有清熱解毒、抗菌消炎、調(diào)節(jié)免疫等功效，主產(chǎn)于安徽、貴州、廣西、江西、浙江、臺灣、湖北等［2-4］。香茶菜在安徽省宿州市已有20 多年人工種植歷史和6 000 余畝藥材示范種植基地。目前，以香茶菜入藥的制劑主要有胃復春片、人參香茶片、抗癌平丸等［5］。中藥材中的所有元素（包括無機元素及微量元素）均與其藥效有緊密關系［6-7］。香茶菜中含有多種無機元素，有人體必需的微量元素［如銅（Cu）］，還有如鉛（Pb）、鎘（Cd）、汞（Hg）、砷（As）等對人體有害的元素，過量攝入有害元素會對腎臟、肝臟、肺臟等造成危害，引發(fā)各種身體病變甚至癌癥［8-10］。建立中藥材元素指紋圖譜可反映藥材中元素的特異性和差異性［11］。綜合多種元素的分析，對中藥材藥用效能的進一步開發(fā)具有重要意義。基于此，本研究中采用電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS）法測定香茶菜中19 種無機元素的含量，考察其特征，繪制相應指紋圖譜，并評價各批次樣品間的相似度；采用主成分分析法評估樣品的批間差異，并對As，Cd，Hg，Pb，Cu 5 種元素進行安全性評價，從元素層面為香茶菜的質(zhì)量評價提供依據(jù)。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

ICAP - MS 型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；MARS 6 型微波消解儀（美國CEM 公司）；Sartorius BSA124S 型電子天平（德國Sartorius公司，精度為0.1 mg）。

1.2 試藥

混合元素標準溶液［含硼（B）、鈉（Na）、鋁（Al）、鈦（Ti）、鉻（Cr）、錳（Mn）、鐵（Fe）、鎳（Ni）、Cu、鋅（Zn）、砷（As）、鉬（Mo）、Cd、鋇（Ba）、Hg、Pb、鎂（Mg）、鉀（K）、鈣（Ca）各100 μg/mL］，混合內(nèi)標溶液［含鉍（Bi）、銦（In）、鈧（Sc）各100 μg/mL］，K、Ca、金（Au）單元素標準溶液（1 000，1 000，100 μg/mL），均購自國家有色金屬及電子材料分析測試中心；硝酸、過氧化氫均為優(yōu)級純，水為去離子水。香茶菜樣品13 批（均采自安徽省宿州市，樣品信息見表1），經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學劉守金教授和楊青山教授鑒定為正品。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2 方法與結果

2.1 試驗條件

測量模式：KED碰撞池模式；氣體流速：載氣（氬氣）0.8 L/min；碰撞氣（氦氣）4.0 mL/ min，輔助氣（氬氣）0.4 L/min，等離子體氣15 L/min；泵速：40 r/min。

2.2 溶液制備

混合標準系列溶液：精密移取混合元素標準溶液適量，加入混合內(nèi)標溶液，用2%硝酸稀釋并定容，得17種待測元素（除K 和Ca 外）質(zhì)量濃度分別為0.5，1.0，5.0，10，50，100，500 ng/ mL 和1.0，5.0，10.0，50.0 μg/ mL，內(nèi)標元素質(zhì)量濃度為1 μg/mL 的混合標準系列溶液。由于樣品中K 和Ca 含量較大，又在標準系列溶液中加入兩者的單元素標準溶液，最終K和Ca的質(zhì)量濃度為25，50，250，500 ng/mL和2，5，10，20，50，100，200 μg/mL。11B，23Na，24Mg，27Al，39K，44Ca，48Ti，52Cr，55Mn，57Fe 的檢測以45Sc 為內(nèi)標，60Ni，63Cu，66Zn，75As，95Mo，111Cd，137Ba以115In為內(nèi)標，202Hg和208Pb以209Bi為內(nèi)標。

供試品溶液與空白溶液：取樣品粉末（過3號篩）約0.3 g，精密稱定，置微波消解罐中，加濃硝酸10.0 mL，充分混勻，靜置過夜。預消解完成后，放入微波消解儀消解（程序見表2）。冷卻，取出，緩慢擰松罐蓋，將消解罐放入趕酸器中，緩慢加熱至紅棕色蒸氣揮盡，關閉趕酸器，取出，冷卻至室溫，置50 mL 容量瓶中，加入0.5 mL混合內(nèi)標溶液（100 μg/mL），再加入Au單元素標準溶液（1 μg/mL）200 μL，用2%硝酸定容，混勻，作為供試品溶液。不取樣品，同供試品溶液制備方法制備空白溶液。

表2 微波消解儀工作參數(shù)Tab.2 Operating parameter of microwave digestion instrument

2.3 方法學考察

線性關系考察：取2.2 項下混合標準系列溶液適量，按2.1 項下試驗條件進樣測定，以待測元素的質(zhì)量濃度（X，ng/ mL 或μg/ mL）為橫坐標、儀器響應值（Y）為縱坐標進行線性回歸。取空白溶液測定1 次，記錄儀器響應值并計算檢測限。結果見表3。可見，19種元素在相應質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與各自儀器響應值線性關系良好，r均大于0.998。

表3 方法學考察結果Tab.3 Results of methodological investigation

精密度試驗：取同一混合標準系列溶液（100 ng/mL）適量，按2.1 項下試驗條件連續(xù)進樣測定6 次，記錄儀器響應值并計算各元素含量。結果的RSD為1.37%～3.18%（n= 6），均小于5%，表明儀器精密度良好。詳見表3。

重復性試驗：取樣品（編號Q6）約0.3 g，精密稱定，共6份，按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下試驗條件進樣測定，記錄儀器響應值，并計算各元素含量。結果的RSD為1.25%～3.49%（n=6），均小于5%，表明方法重復性良好。詳見表3。

加樣回收試驗：取已知含量的香茶菜樣品（編號Q6）適量，各6 份，每份約0.15 g，精密稱定，分別加入As，Cd，Hg各0.1 μg；Cr，Ni，Mo，Pb各1.0 μg；B，Ti，Mn，Cu，Zn，Ba各10.0 μg；Na，Al，F(xiàn)e各50.0 μg；Mg 300 μg；K，Ca 各3 000 μg。按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下試驗條件進樣測定，記錄儀器響應值，并計算加樣回收率。結果19 種元素的平均加樣回收率為92.46%～102.26%，RSD為1.06%～3.19%（n= 6），均小于5%。詳見表3。

2.4 含量測定

取13 批樣品，各2 份，分別按2.2 項下方法制備供試品溶液和空白溶液，按2.1 項下試驗條件進樣測定，記錄儀器響應值，并計算含量。結果見表4。可見，19 種無機元素整體含量差異較大，Ni，As，Mo，Cd，Hg，Pb等有害元素含量較低，K，Ca，Mg，F(xiàn)e，Na，Al 等人體必需元素含量較高；尤其人體常量元素K 和Ca 含量均大于10 000 mg/kg。

表4 樣品中無機元素含量（mg/kg，n=2）Tab.4 Content of inorganic elements in samples（mg / kg，n = 2）

2.5 指紋圖譜建立及相似度評價

采用Origin Pro 2021 軟件繪制無機元素指紋圖譜。由于不同批次樣品中所含的無機元素含量差異較大，因此采用相對含量生成指紋圖譜，將含量較大的元素縮小相同倍數(shù)，將含量較小的元素擴大相同倍數(shù)，使所有元素相對含量在同一數(shù)量級。以元素種類為橫坐標、相對含量為縱坐標繪制指紋圖譜（見圖1）。分別以含量的X和M值為對照數(shù)據(jù)，生成香茶菜無機元素對照指紋圖譜，采用夾角余弦法計算13 批樣品與對照指紋圖譜的相似度（分別記為A，B），結果見表5。可見，13 批樣品無機元素指紋圖譜與對照圖譜的相似度均大于0.920（余弦值越接近1，相似度就越高），表明相似度較好。13 批香茶菜樣品中，有10 批的X值指紋圖譜相似度優(yōu)于其M值指紋圖譜，故最終決定用X指紋圖譜作為香茶菜無機元素對照指紋圖譜（見圖2）。

圖1 13批樣品中19種無機元素指紋圖譜Fig.1 Fingerprint of 19 inorganic elements in 13 batches of samples

圖2 樣品中19種無機元素對照指紋圖譜Fig.2 Reference fingerprint of 19 inorganic elements in samples

表5 相似度分析結果Tab.5 Results of similarity analysis

2.6 主成分分析

采用SPSS 27.0 統(tǒng)計學軟件對13 批樣品進行主成分分析，特征值及方差貢獻率見表6，以特征值大于1為提取條件，提取了7 個主成分，累積方差貢獻率達92.871%。主成分1-7 的主要影響因子分別為Fe、Mn、Zn，Ni，Na，Al、K，Mo，As，B。

表6 主成分分析特征值及方差貢獻率Tab.6 Eigenvalues and variance contribution rates of principal component analysis

2.7 安全性評價

單因子污染指數(shù)法：以公式Pi=Ci/Si計算i 元素（As，Cd，Hg，Pb，Cu）的污染指數(shù)（Pi），式中，Ci為元素i的測量值，Si為元素i 的限量標準值。Pi≤0.7 為優(yōu)良，> 0.7～1.0 為安全，< 1.0～2.0 為輕污染，> 2.0～3.0 為中污染，> 3.0 為重污染。限量標準值根據(jù)2020年版《中國藥典（四部）》重金屬及有害元素一致性限量指導值［12］：As，Cd，Hg，Pb，Cu 分別不得過2，1，0.2，5，20 mg/ kg。結果見表7。可見，13 批樣品單項污染指數(shù)（除Q4樣品的Pb外）均小于0.7。

表7 13批樣品中5種元素污染評價結果Tab.7 Results of pollution evaluation of five elements in 13 batches of samples

內(nèi)梅羅綜合指數(shù)法：計算公式為P綜=，其中，P綜為樣品有害元素污染綜合指數(shù)（≤0.7 為安全級，> 0.7～1.0 為警戒線，> 1.0～2.0 為輕度污染，>2.0～3.0 為中度污染，>3.0 為重度污染），Pmax和Pave分別為樣品中有害元素污染物單因子指數(shù)的最大值和平均值。結果見表7。結果顯示，13批樣品中有12批的評價結果為安全級。

3 討論

3.1 前處理方法選擇

預試驗中考察了濕法消解、干灰化法消解及微波消解3種前處理方法對元素含量結果的影響，發(fā)現(xiàn)濕法消解溫度不易控制，實驗人員因素對結果影響較大；干灰化法消解由于馬弗爐溫度高，易造成易揮發(fā)元素的損失，且灰化不完全或溶解不完全均會導致測定結果偏低。因此，本研究中選取微波消解法作為樣品的消解方式。

3.2 趕酸溫度選擇

本研究所測香茶菜19 種無機元素中As 和Hg 為易揮發(fā)元素［13-14］，為避免趕酸溫度過高導致其損失，預試驗中考察了不同趕酸溫度對結果的影響。發(fā)現(xiàn)溫度較低時，趕酸時間較長；而趕酸溫度較高時，某些易揮發(fā)元素含量明顯偏低。綜合考慮元素損失和節(jié)省趕酸時間，趕酸溫度宜控制在120～130 ℃。

3.3 進樣酸度條件優(yōu)化

儀器進樣時的酸度環(huán)境對測定結果也有一定影響，故預試驗中分別考察了體積分數(shù)為0（純水），1%，2%，3%，5%的硝酸溶液為稀釋劑制備混合標準溶液（質(zhì)量濃度為50.0 ng/mL）的效果。結果表明，硝酸溶液體積分數(shù)大于2%時，標準溶液回收率趨于最大且穩(wěn)定，為滿足試驗要求并節(jié)約成本，同時為避免酸度過大對儀器造成損壞和浪費，選擇在2%的硝酸體系中測定。

3.4 儀器干擾消除

ICP - MS 分析法測定過程中會存在基體、記憶效應、物理、質(zhì)譜等方面干擾［15-17］。基體干擾主要為儀器的空間電荷效應和在采樣錐與截取錐之間的物理變化導致，可通過內(nèi)標校正、控制樣品鹽分、延長樣品沖洗時間、清洗錐體和稀釋樣品消除。記憶效應是由于上一個樣品在進樣系統(tǒng)內(nèi)壁上過量分析物揮發(fā)引起的，可采用2%硝酸溶液沖洗加以消除。物理干擾可通過多次清洗霧化室、進樣錐及進樣管路消除，同時可增加測樣時管路沖洗時間。質(zhì)譜干擾可通過選擇合適的同位素離子及儀器校正消除，同時加入內(nèi)標校正儀器漂移及KED碰撞池模式消除干擾［18-20］。

3.5 指紋圖譜無機元素選擇

全元素半定量測定中發(fā)現(xiàn)，香茶菜藥材中含有60多種無機元素，部分元素含量較低，結合該藥材功效及無機元素在人體內(nèi)的生理作用，除去含量特別低的元素，本研究中選擇了19種元素生成香茶菜無機元素指紋圖譜。其中Na，Mg，K，Ca是人體必需常量元素，F(xiàn)e，Mo，Ni，Cr，Cu，Sn為人體必需微量元素，香茶菜所含無機元素是其藥用功效不可或缺的物質(zhì)基礎，若要探明香茶菜中無機元素與藥效成分的關系，還需后續(xù)進一步研究。

3.6 方法評價

本研究中建立了對19種無機元素進行定量分析的ICP-MS 法，并建立了其指紋圖譜，可用于從無機元素層面評價香茶菜藥材的質(zhì)量和均一性，也為其在元素層面的質(zhì)量控制提供了參考。