復(fù)方參及合劑對(duì)小鼠抗缺氧及疲勞的作用研究

李 萌，阿麗古麗·買買提依明，李建瑛，李 葉，李 倩，王 瑞，尹東鋒△

（1. 中國(guó)人民解放軍新疆軍區(qū)總醫(yī)院，新疆 烏魯木齊 830000； 2. 新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830000）

缺氧是組織細(xì)胞供氧不足或氧化過程障礙導(dǎo)致其代謝功能和形態(tài)結(jié)構(gòu)異常引起的氧化應(yīng)激損傷、穩(wěn)態(tài)失衡等一系列問題［1］。疲勞是在特殊環(huán)境下，因長(zhǎng)時(shí)間的體力、腦力勞動(dòng)，乳酸（LA）及其代謝物堆積引起的能量消耗、運(yùn)動(dòng)耐力下降、工作效率降低的生理學(xué)現(xiàn)象［2］。研究顯示，復(fù)方中藥制劑療效穩(wěn)定、副作用少、在機(jī)體抗缺氧及疲勞方面具有顯著優(yōu)勢(shì)。人參皂苷能改善氧化應(yīng)激、炎癥、缺氧損傷、能量代謝等［3］，丹參提取物具有抑制細(xì)胞增殖、保護(hù)臟器組織等作用［4］，本課題組前期將兩者組合制成復(fù)方雙參合劑，研究證明其具有顯著的抗缺氧及疲勞作用［5］。肉蓯蓉始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有抗衰老、抗疲勞、抗缺血、免疫調(diào)節(jié)、肝臟保護(hù)等藥理作用［6-7］，其主要成分苯乙醇苷具有抗氧化應(yīng)激、維持細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)定［8］、保護(hù)肝臟和免疫調(diào)節(jié)等作用［9］。《中華本草-維吾爾藥卷》中記載，歐白及具有滋補(bǔ)心、肝、腦組織，強(qiáng)筋健肌、補(bǔ)血養(yǎng)發(fā)等作用。本研究中以丹參、人參為君藥，肉蓯蓉為臣藥，歐白及為佐藥，選擇含量高于80%的提取物按2∶1∶1∶1（m/m/m/m）制成復(fù)方參及合劑，利用復(fù)方中藥制劑之間相輔相成或相反相成，以及可通過多靶點(diǎn)、多途徑、多系統(tǒng)綜合調(diào)節(jié)的特點(diǎn)［10］，探討其對(duì)小鼠抗缺氧及疲勞的作用。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與動(dòng)物

儀器：DNM-9602型酶標(biāo)分析儀（北京普朗新技術(shù)有限公司）；TGL-20M 型高速冷凍離心機(jī)（上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；S10 型手持式高速勻漿機(jī)（寧波新藝超聲設(shè)備有限公司）；AE-240型電子分析天平（梅特勒-托利多<上海>儀器有限公司，精度為0.1 mg）；ACS - 1.5 A 型電子計(jì)重秤（上海友聲衡器有限公司）；LSY 型電熱恒溫水浴鍋（北京市醫(yī)療設(shè)備廠）；RM 2135型回旋式切片機(jī)（德國(guó)Leica 公司）；CX 43 型光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）。

試藥：鈉石灰（CAS：8006-28-8，含量98%），亞硝酸鈉（CAS：7632-00-0，含量99.99%）；超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（批號(hào)為ml001998），丙二醛（MDA）試劑盒（批號(hào)為ml022446），谷胱甘肽過氧化物酶（GSH -Px）試劑盒（批號(hào)為ml058194），三磷酸腺苷（ATP）試劑盒（批號(hào)為ml038391），尿素氮（BUN）試劑盒（批號(hào)為ml076479），肌糖原（MG）試劑盒（批號(hào)為ml058103），肝糖原（Gly）試劑盒（批號(hào)為ml037785），乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒（批號(hào)為ml002267），均購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；LA試劑盒（上海優(yōu)選生物科技有限公司，批號(hào)為YX - 120100M）；人參皂苷提取物（批號(hào)為20210420），肉蓯蓉苯乙醇苷提取物（批號(hào)為20210420），含量均為80%，均購自西安賽奧生物技術(shù)有限公司；丹參提取物［10∶1（10 g原材料提取出1 g），上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)為R18J11Y116119］；歐白及（原料藥，新疆維吾爾藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號(hào)為20220823）；紅景天膠囊（中國(guó)人民解放軍西藏軍區(qū)總醫(yī)院，軍藥準(zhǔn)字Z2006001，批號(hào)為200806）；復(fù)方參及合劑（醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室自制）。

動(dòng)物：健康成年SPF級(jí)雄性KM 小鼠150只，體質(zhì)量18～22 g，購自新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（新）2018 - 0002。在溫度18～25 ℃，相對(duì)濕度50%～70%環(huán)境下，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，自由攝食和飲水，12 h 明暗交替。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)中國(guó)人民解放軍新疆軍區(qū)總醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過（批準(zhǔn)文號(hào)：DWLL20230120），且嚴(yán)格遵守動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理要求。

1.2 方法

1.2.1 抗缺氧能力檢測(cè)

常壓密閉缺氧實(shí)驗(yàn)［5］：取小鼠50 只，隨機(jī)分為空白對(duì)照組（等體積生理鹽水），陽性對(duì)照組（紅景天膠囊0.3 g/kg），復(fù)方參及合劑低、中、高劑量組（簡(jiǎn)稱低、中、高劑量組，1.0，2.0，3.0 g/kg），各10 只，各組小鼠灌胃等體積生理鹽水或相應(yīng)藥物（10 mL/kg），每日1 次，連續(xù)14 d（以下實(shí)驗(yàn)同）。每天觀察小鼠的精神狀況及體質(zhì)量，并于末次給藥1 h 后，將小鼠分別置盛有5 g 鈉石灰的250 mL 磨口廣口瓶中（每瓶1 只），以凡士林封口，蓋嚴(yán)，立即開始計(jì)時(shí)，以呼吸停止為終點(diǎn)，記錄小鼠的存活時(shí)間。結(jié)束后立即解剖，取小鼠心臟及腦組織，檢測(cè)SOD，MDA，GSH - Px 水平，嚴(yán)格按相應(yīng)試劑盒說明書操作。

亞硝酸鈉中毒實(shí)驗(yàn)［11］：分組及給藥同上。末次給藥1 h后，各組小鼠腹腔注射200 mg/kg亞硝酸鈉，記錄小鼠的存活時(shí)間（注射完畢至呼吸停止）。結(jié)束后同上一實(shí)驗(yàn)操作，測(cè)定SOD，MDA，GSH-Px水平。

1.2.2 耐疲勞檢測(cè)

負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)［12］：分組及給藥同上。末次給藥1 h后，在尾巴根部纏繞體質(zhì)量10%的負(fù)重，將小鼠置水溫（25±2）℃，水深30 cm 的水缸中，觀察小鼠力竭游泳時(shí)間（從游泳開始到頭部不能露出水面10 s）。結(jié)束后立即摘眼球取血獲得血液樣本，檢測(cè)BUN，LA，LDH，ATP 水平，取肝臟及腿部肌肉組織分別檢測(cè)Gly和MG水平，嚴(yán)格按相應(yīng)試劑盒說明書操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 常壓密閉缺氧實(shí)驗(yàn)

與空白對(duì)照組比較，陽性對(duì)照組，低、中、高劑量組小鼠存活時(shí)間均顯著延長(zhǎng)（P<0.05）。詳見表1。與空白對(duì)照組比較，腦組織中，高劑量組小鼠SOD水平，低、中、高劑量組小鼠GSH-Px水平均顯著升高（P<0.05），陽性對(duì)照組及低、中、高劑量組MDA 水平均顯著降低；心肌組織中，高劑量組小鼠SOD 水平，陽性對(duì)照組及低、中、高劑量組小鼠GSH-Px 水平均顯著升高，低、高劑量組小鼠MDA水平均顯著降低（P<0.05）。詳見表2。

表1 各組小鼠常壓密閉缺氧、亞硝酸鈉中毒存活時(shí)間及游泳力竭時(shí)間比較（±s，n=10）Tab.1 Comparison of survival time in the closed normobaric hypoxia test，sodium nitrite poisoning test and exhaustive swimming time in each group（±s，n = 10）

表1 各組小鼠常壓密閉缺氧、亞硝酸鈉中毒存活時(shí)間及游泳力竭時(shí)間比較（±s，n=10）Tab.1 Comparison of survival time in the closed normobaric hypoxia test，sodium nitrite poisoning test and exhaustive swimming time in each group（±s，n = 10）

注：與空白對(duì)照組比較，*P < 0.05。表2至表4同。Note：Compared with those in the blank control group，*P < 0.05（for Tab.1 - 4）.

組別空白對(duì)照組陽性對(duì)照組低劑量組中劑量組高劑量組劑量0.3 g/kg 1.0 g/kg 2.0 g/kg 3.0 g/kg常壓密閉缺氧存活時(shí)間（images/BZ_99_1919_2727_1942_2761.png±s，min）41.47±1.73 52.22±4.20*53.55±2.69*61.94±3.13*68.09±2.49*延長(zhǎng)率（%）25.92 29.13 49.37 64.20亞硝酸鈉中毒存活時(shí)間（images/BZ_99_1919_2727_1942_2761.png±s，min）43.59±1.64 57.24±3.54*58.31±2.46*67.32±3.47*66.60±3.35*延長(zhǎng)率（%）31.31 33.77 54.44 52.79力竭時(shí)間（images/BZ_99_1919_2727_1942_2761.png±s，min）5.68±0.42 5.93±0.83 8.02±0.51*8.52±0.75*9.55±1.04*

表2 常壓密閉缺氧條件下各組小鼠腦組織及心肌組織相關(guān)指標(biāo)水平比較Tab.2 Comparison of brain and myocardial tissue - related indicator levels in the closed normobaric hypoxia test in each group

2.2 亞硝酸鈉中毒實(shí)驗(yàn)

與空白對(duì)照組比較，陽性對(duì)照組，低、中、高劑量組小鼠存活時(shí)間均顯著延長(zhǎng)（P<0.05）。詳見表1。與空白對(duì)照組比較，腦組織中，低、中劑量組小鼠SOD 水平，中、高劑量組小鼠GSH-Px 水平均顯著升高，陽性對(duì)照組小鼠MDA 水平顯著降低（P<0.05）；心肌組織中，與空白對(duì)照組比較，陽性對(duì)照組及中劑量組小鼠SOD 水平，中劑量組小鼠GSH - Px 水平均顯著升高，陽性對(duì)照組及低、中、高劑量組小鼠MDA 水平均顯著降低（P<0.05）。詳見表3。

表3 亞硝酸鈉中毒條件下各組小鼠腦組織及心肌組織相關(guān)指標(biāo)水平比較Tab.3 Comparison of brain and myocardial tissue - related indicator levels in the sodium nitrite poisoning test in each group

2.3 負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)

與空白對(duì)照組比較，低、中、高劑量組小鼠力竭時(shí)間均顯著延長(zhǎng)（P< 0.05），詳見表1。與空白對(duì)照組比較，高劑量組小鼠血清ATP 水平，低、中、高劑量組小鼠LDH水平，中劑量組小鼠Gly水平均顯著升高（P<0.05）；陽性對(duì)照組及低、中、高劑量組小鼠BUN 和LA 水平均顯著降低（P<0.05）。詳見表4。

表4 負(fù)重游泳條件下各組小鼠相關(guān)指標(biāo)水平比較Tab.4 Comparison of relevant indicator levels in the weight - loaded swimming test in each group

3 討論

缺氧是高原等特殊環(huán)境下普遍存在的應(yīng)激因素，長(zhǎng)期暴露會(huì)使機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，影響氧化供能［13］。人參皂苷、丹參提取物、肉蓯蓉苯乙醇苷、歐白及多糖［14］已被證實(shí)具有抗缺氧及疲勞作用。本研究中以非特異性缺氧損傷和急性缺氧性損傷［15］考察小鼠的存活時(shí)間；用負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)考察小鼠的運(yùn)動(dòng)耐力，在能量消耗大、氧供應(yīng)不足的條件下會(huì)導(dǎo)致LA 大量堆積［16］、能量耗竭、代謝產(chǎn)物蓄積，產(chǎn)生氧化應(yīng)激等問題［17］，導(dǎo)致機(jī)體疲勞［18］。SOD能清除氧自由基；MDA可反映細(xì)胞功能；GSH-Px保護(hù)細(xì)胞蛋白質(zhì)免受氧化應(yīng)激影響［19］。抗缺氧實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與空白對(duì)照組比較，各給藥組小鼠存活時(shí)間均顯著延長(zhǎng)，部分組小鼠心肌和腦組織中SOD和GSH-Px 水平顯著升高，心肌組織中MDA 水平顯著降低，表明復(fù)方參及合劑可減輕缺氧時(shí)對(duì)機(jī)體脂質(zhì)過氧化的損傷，加速自由基的清除，抑制組織細(xì)胞凋亡，減少組織器官的消耗［20］，保護(hù)心臟和腦組織中過氧化物酶的活性，具有顯著的抗氧化作用。改善機(jī)體短暫性缺氧，延長(zhǎng)力竭時(shí)間，血清中LA和BUN水平顯著下調(diào)，LDH水平上調(diào)，減少LA堆積，增強(qiáng)LDH的活性，保護(hù)臟器組織。

LDH 可加速清除代謝過多的LA，延緩機(jī)體疲勞的發(fā)生；BUN 能反映機(jī)體整體蛋白的代謝情況，同時(shí)，機(jī)體的運(yùn)動(dòng)耐力還與糖原含量有關(guān)，主要存在于肌肉組織和肝臟組織中，是機(jī)體重要的儲(chǔ)能物質(zhì)，一方面不斷分解Gly 進(jìn)行供能，為機(jī)體儲(chǔ)備能量［21］，另一方面MG直接為其運(yùn)動(dòng)提供能量，保護(hù)骨骼肌免受氧化損傷［22］。耐疲勞實(shí)驗(yàn)結(jié)果，中劑量組小鼠Gly水平，高劑量組小鼠ATP水平，以及低、中、高劑量組小鼠LDH水平均顯著升高，及時(shí)為各組織器官供氧，增加糖原儲(chǔ)備，延緩糖酵解速度，維持機(jī)體血糖平衡，具有顯著的耐疲勞能力。

綜上所述，復(fù)方參及合劑可顯著提高小鼠抗缺氧、耐疲勞能力，其機(jī)制可能與清除體內(nèi)氧自由基、抑制脂質(zhì)過氧化損傷、增加糖原儲(chǔ)備、維持機(jī)體血糖平衡、增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)等有關(guān)，進(jìn)一步為高原抗缺氧及疲勞藥物治療提供了新的選擇。課題組前期僅從藥效學(xué)水平對(duì)復(fù)方參及合劑進(jìn)行了研究，在后續(xù)研究中將通過分子機(jī)制對(duì)心肌細(xì)胞抗缺氧耐疲勞機(jī)制進(jìn)行研究，探究線粒體凋亡情況及調(diào)控機(jī)制，為后期高原抗缺氧及疲勞預(yù)防用藥提供理論依據(jù)。