屬性層次模型-熵權法聯合正交試驗優化黃芩藥材高溫瞬時滅菌工藝*

喬曉芳，王迎舉，倫琦星，陶海濤

（1. 河南省藥品審評查驗中心·河南省疫苗檢查中心，河南 鄭州 450000； 2. 江蘇萬創滅菌設備科技有限公司，江蘇 鎮江 212200）

中藥制劑原料中藥材多帶有大量微生物，是中藥制劑被微生物污染的主要途徑之一［1］，微生物在適宜條件下會大量生長繁殖，從而導致藥品變質、腐敗、療效降低或失效，甚至可能對人體有害?；谠搭^控制、過程控制的風險管理理念，在藥品生產過程中，減少或殺滅微生物，是保證藥品質量的關鍵。常用的輻照滅菌法存在設備費用高，部分藥物滅菌后療效可能降低，影響液體藥劑的穩定性，使用需注意安全防護的缺點［2-4］；流通蒸汽滅菌法存在含揮發油類、芳香類中藥材不適用，滅菌后藥粉水分大易板結成塊，存在需二次干燥、二次粉碎的弊端；乙醇氣體滅菌法存在生產效率低、生產周期長、能源用量大、費工費時的問題［5］。藥材原粉經滅菌處理后常直接用于口服固體制劑生產，如何選用適宜的方法滅菌是藥廠生產的一大難題。屬性層次模型（AHM）現已在藥品工藝優化、藥物合理性評價等多個領域廣泛應用［6-7］，但其受人為主觀因素影響較大，存在主觀偏差或人為排斥某些指標的風險；熵權法（EWM）客觀性強、精準度高［8-9］，但其難以考慮到人的主觀感受和價值判斷，受數據誤差的影響較大。兩法結合綜合賦權，能確保多評價指標的相對權重更具科學性和準確性［10］，可用于中藥及其制劑、醫藥領域等優劣性評價。正交試驗法采用多指標作為評價對象，能最大限度地降低試驗誤差，提高評價結果的準確性和最優方案的可行性［11-12］。本研究中在充分調研高溫瞬時滅菌智能化滅菌在藥品食品等行業應用情況的基礎上［13-17］，對黃芩藥材高溫瞬時滅菌新方法進行滅菌工藝探索，對其滅菌效果進行多指標綜合評價，為中藥材選擇適宜的滅菌方法提供參考依據。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

QYGI-300C 型切藥機（濟南沃成設備有限公司）；SF - 130 型錘擊式中藥粉碎機（吉首市中誠制藥機械廠）；WC - FMD - 150 型高溫瞬時滅菌設備（江蘇萬創滅菌設備科技有限公司）；LC20AT 型高效液相色譜儀（日本Shimadzu公司）；BT25S型電子天平（德國Sartorius公司，精度為0.01 mg）。

1.2 試藥

黃芩（禹州市凱旋藥業有限公司，批號分別為221101，221102，221103）；黃芩苷對照品（批號為110715-202223，含量97.2%），黃芩素對照品（批號為111595-201808，含量97.9%），漢黃芩素對照品（批號為111514 - 202207，含量≥98%），均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇、磷酸、乙醇均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結果

2.1 高溫瞬時滅菌藥材制備

取藥材樣品適量，除去雜質，置沸水中煮10 min，取出，悶透，切薄片，干燥，粉碎成細粉，過50目篩，采用聚乙烯自封袋分裝，每袋100 g，即得高溫瞬時滅菌藥材。

2.2 微生物限度檢查及滅菌率計算

稱取滅菌前后藥材細粉樣品各10 g，加無菌氯化鈉- 蛋白胨緩沖液（pH 7.0）分別制成1∶10（m/V，下同）、1∶100、1∶1 000 和1∶10 000 的供試液。滅菌前樣品按2020年版《中國藥典（四部）》通則1108 中藥飲片微生物限度檢查法檢查，微生物限度應符合需氧菌總數<105cfu/g，霉菌和酵母菌總數<103cfu/g，大腸埃希菌和沙門菌不得檢出，耐膽鹽革蘭陰性菌<104cfu/g。滅菌后樣品按2020年版《中國藥典（四部）》通則1105，1106 非無菌產品微生物限度檢查法檢查，微生物限度應符合需氧菌總數< 104cfu / g，霉菌和酵母菌總數<102cfu/g，大腸埃希菌和沙門菌不得檢出，耐膽鹽革蘭陰性菌<102cfu/g。滅菌率（%）=（樣品滅菌前需氧菌總數+滅菌前霉菌及酵母菌總數-樣品滅菌后需氧菌總數-滅菌后霉菌及酵母菌總數）/（樣品滅菌前需氧菌總數+滅菌前霉菌及酵母菌總數）×100%。

2.3 黃芩苷含量測定

2.3.1 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱：Kromasil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-0.2%磷酸水溶液（47∶53，V/V）；流速：1.0 mL/ min；檢測波長：280 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μL。理論板數按黃芩苷峰計不低于4 000，分離度>1.5，基線分離良好。

2.3.2 溶液制備

取黃芩苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成質量濃度為0.60 mg/mL 的對照品貯備液；取適量，用甲醇稀釋10 倍，搖勻，即得對照品溶液。取樣品0.6 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加70%乙醇75 mL，加熱回流提取3 h，濾液轉移至100 mL 容量瓶中，冷卻至室溫，加70%乙醇定容，取適量，用70%乙醇稀釋20 倍，即得供試品溶液。

2.3.3 方法學考察

線性關系考察、定量限與檢測限試驗：精密吸取對照品貯備液適量，用甲醇分別稀釋至4，10，20，40，100，200 倍，得系列對照品溶液。取適量，按2.3.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并以黃芩苷質量濃度（X，μg/mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程Y= 4.133 9 × 106X+ 829.3（r= 0.999 8，n=6）。結果表明，黃芩苷質量濃度在3.00～150.00 μg/mL范圍內與峰面積線性關系良好。以信噪比（S/N）為3和10 時待測成分的質量濃度分別為檢測限和定量限，結果依次為0.039 μg/mL和0.131 μg/mL。

精密度試驗：取2.3.2 項下供試品溶液（批號為221101）適量，按擬訂色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積，結果的RSD為1.41%（n=6），表明方法日內精密度良好。取同一供試品溶液（批號為221101）適量，1 d進樣1 次，連續6 d，記錄峰面積。結果的RSD為1.86%（n=6），表明方法日間精密度良好。

穩定性試驗：取同一供試品溶液（批號為221101）適量，分別于室溫下放置0，2，4，7，12，18，24 h 時按擬訂色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果的RSD為1.95%（n= 7），表明供試品溶液室溫放置24 h 內基本穩定。

重復性試驗：取同一批（批號為221101）樣品適量，精密稱定，共6 份，按2.3.2 項下方法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算樣品含量。結果黃芩苷含量的RSD為1.51%（n=6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取已知含量的黃芩樣品（批號為221101）細粉9 份，每份約0.3 g，精密稱定，分別加入3.327 mg/mL黃芩苷對照品溶液8，10，12 mL，按2.3.2項下方法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算加樣回收率。結果平均加樣回收率為99.54%，RSD為1.21%（n=9）。

2.3.4 黃芩苷轉移率

取滅菌前后樣品各適量，按2.3.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算黃芩苷的含量及其轉移率。黃芩苷轉移率（%）= 滅菌后黃芩苷含量/滅菌前黃芩苷含量×100%。

2.4 浸出物含量及浸出率

取樣品約3 g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入稀乙醇100 mL，按2020年版《中國藥典（四部）》通則2201醇溶性浸出物測定法項下的熱浸法測定，計算供試品中浸出物含量，并計算浸出率。浸出率（%）=滅菌后浸出物含量/滅菌前浸出物含量×100%。

2.5 高溫瞬時滅菌工藝優化

2.5.1 因素與水平

在前期單因素預試驗的基礎上，以進料速率（A）、滅菌溫度（B）、滅菌時間（C）為影響因素，以浸出率、滅菌率、黃芩苷轉移率的綜合評分為考察指標，采用L9（34）正交試驗法進行工藝優選。因素與水平見表1。

表1 因素與水平Tab.1 Factors and their levels

2.5.2 指標權重考察

AHM：本研究中邀請5名副高級職稱及以上藥學專家，按AHM 法對3 個考察指標（滅菌率、黃芩苷轉移率和浸出率）分別比較指標Pa相對于Pb（a ≠b）的相對重要性ia-b和ib-a，根據數學屬性要求ia-b和ib-a滿足ia-b≥0，ib-a≥0，ia-b+ib-a=1，ia-a=0 和ib-b=0，構建相對屬性判斷矩陣（表2）。一致性檢驗計算公式如下。

表2 考察指標相對屬性判斷矩陣Tab.2 Relative attribute judgment matrix of investigation indicators

參考上述公式對相對屬性判斷矩陣進行一致性檢驗，同時按公式分別計算3個考察指標的相對權重。結果見表2?？梢姡鶚嫿ǖ南鄬傩耘袛嗑仃嚪弦恢滦詸z驗要求，表明判斷矩陣合理，滅菌率、黃芩苷轉移率和浸出率AHM相對權重依次為0.523 3，0.320 0，0.156 7。

EWM：首先對考察指標檢測結果的原始數據進行歸一化處理，按公式（式中，Zab=；若Zab= 0，則lnZab= 0）計算3 個考察指標（滅菌率、黃芩苷轉移率和浸出率）的信息熵，再按公式計算3 個考察指標的相對權重，結果顯示滅菌率、黃芩苷轉移率、浸出率EWM 相對權重依次為0.727 4，0.189 2，0.083 4。

2.5.3 正交試驗設計與結果

取2.1項下高溫瞬時滅菌樣品，并固定出料溫度為35 ℃，L9（34）正交試驗設計方案與結果見表3（其中綜合評分= 滅菌率× 0.837 9 + 黃芩苷轉移率× 0.133 3 +浸出率×0.028 8），方差分析結果見表4。

表3 L9（34）正交試驗設計及結果Tab.3 Design and results of the L9（34）orthogonal test

由表3 可知，3 個因素作用強度依次為B > A > C。由表4可知，因素B（滅菌溫度）對結果有顯著影響（P<0.05）。綜合表3、表4結果及實際情況，確定黃芩高溫瞬時滅菌最佳工藝為A2B2C1，即進料速率為120 kg/h，滅菌溫度為170 ℃，滅菌時間為6 s（出料溫度為35 ℃）。

2.6 中試驗證試驗

取3 批黃芩藥材樣品適量，按2.1 項下方法制備高溫瞬時滅菌樣品，按優選工藝參數，依法對樣品進行高溫瞬時滅菌。按2.2項下方法對滅菌前后樣品進行微生物限度檢查并計算滅菌率，結果見表5（其中- 為未檢出）；按2.3 項下方法進行黃芩苷含量測定并計算轉移率，結果見表6；按2.4項下方法進行浸出物檢測并計算浸出率，結果見表7。結果顯示，滅菌后樣品含菌量明顯減少，3 批樣品滅菌率均大于99.0%（批號221101，221102，221103樣品分別為99.90%，99.43%，99.79%）；滅菌前后黃芩苷及浸出物含量無明顯變化，黃芩苷轉移率及浸出率均大于95.0%。表明工藝重現性好，多指標綜合評價黃芩高溫瞬時滅菌對有效成分均無影響，優選出的工藝參數可用于樣品的高溫瞬時滅菌。

表6 滅菌前后樣品中黃芩苷含量及轉移率Tab.6 Content and transfer rate of baicalin in samples before and after sterilization

表7 滅菌前后樣品浸出物含量及浸出率（%）Tab.7 Extract content and extraction rate of samples before and after sterilization（%）

3 討論

3.1 高溫瞬時滅菌因素水平選擇

中藥細粉按試驗設定的進料速率進入高溫瞬時滅菌設備，攪拌槳帶動物料旋轉，使物料懸浮于高速流動過熱蒸汽中，實現對中藥細粉的高溫瞬時滅菌，滅菌后細粉經汽料分離冷卻系統進行快速物料分離并急驟冷卻，降低了中藥細粉中有效成分的流失。進料速率、攪拌旋轉速率、滅菌溫度、蒸汽壓力、滅菌時間、物料出口溫度等工藝參數均會直接影響滅菌效果和中藥細粉質量，優化高溫瞬時滅菌工藝參數對于確保產品質量具有重要意義。本研究中選取進料速率、滅菌溫度和滅菌時間等關鍵因素，采用L9（34）正交試驗法對黃芩高溫瞬時滅菌工藝進行優化。通過單因素預試驗摸索，最終確定正交試驗中3個指標的水平。

3.2 正交試驗評價指標選擇

滅菌設備及工藝能否有效實施不僅要考慮滅菌效果，同時還需確保所滅菌物料的產品質量。2020年版《中國藥典（四部）》分別對中藥飲片和非無菌產品需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數、大腸埃希菌、沙門菌及耐膽鹽革蘭陰性菌進行了具體規定，大腸埃希菌和沙門菌均為不得檢出，同時中藥飲片中耐膽鹽革蘭陰性菌含菌量通常較低，遂考慮將需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數作為黃芩高溫瞬時滅菌工藝滅菌效果評價指標，同時規定中藥飲片需氧菌總數< 105cfu/ g，霉菌和酵母菌總數< 103cfu/ g，非無菌含藥材原粉產品需氧菌總數<104cfu/g，霉菌和酵母菌總數<102cfu/g，故最終將滅菌率作為滅菌效果評價指標。黃芩苷為黃芩特征成分和主要活性成分，浸出物含量也直接影響著黃芩的產品質量，為確保試驗結果的準確性和可靠性，對滅菌前后黃芩苷轉移率和浸出率進行分析，并將其作為黃芩藥材高溫瞬時滅菌工藝產品質量保障評價指標，對黃芩藥材高溫瞬時滅菌工藝進行優化。同時將微生物限度檢查、黃芩苷含量、浸出物含量等指標作為中試驗證產品的檢測指標，確保優化后的最優工藝能滿足黃芩藥材高溫瞬時滅菌的要求。

3.3 方法評價

本研究中優化后的黃芩藥材高溫瞬時滅菌工藝重復性好，滅菌效果良好，滅菌后樣品符合2020年版《中國藥典（四部）》非無菌含藥材原粉的固體口服給藥制劑項下的相關規定，滅菌率達99.0%，能滿足產品生產需要；同時滅菌前后黃芩苷及浸出物含量無明顯變化。本研究中為推進高溫瞬時滅菌新方法在中藥滅菌生產中的應用提供了數據支持。然而，中藥材種類繁多，高溫瞬時滅菌是否適用于花類、葉類、果實類、含揮發油類、芳香類等中藥材的滅菌，還有待進一步論證。