益生菌發酵番茄汁對小鼠抗疲勞和腸道菌群的調節作用

韓紫薇，趙斗，馬自強，仇燕*

（1.河北科技大學食品與生物學院,河北石家莊 050018；2.新疆冠農股份有限公司技術中心,新疆庫爾勒 841000）

疲勞一般可分為精神疲勞和身體疲勞,肌肉疲勞是由劇烈運動產生,會導致大量自由基的產生和積累進而產生氧化損傷。當機體進行超負荷的體力勞動未得到及時緩解時,會產生一系列的生理變化,大量的代謝產物如乳酸和尿素氮在體內不能代謝出去,就會造成機體運動耐力下降,嚴重時能損傷機體器官從而引起抑郁癥、癌癥和帕金森等疾病的產生[1]。有研究表明,腸屏障的損傷和腸道菌群的變化可能導致慢性疲勞綜合征患者疲勞后的嚴重不適[2],疲勞綜合征往往伴隨著腸道菌群紊亂[3]。因此腸道菌群在疲勞產生的過程中起到非常重要的作用。膳食補充石菖蒲[4]、紅景天[5]、黃芪多糖[6]、番茄紅素[7]等中草藥或食物來源的天然物質能有效延緩運動性疲勞,其抗疲勞作用主要通過抑制神經遞質的累積、增加機體能量物質儲備、促進脂肪供能、維持氧化還原穩態、減少代謝物堆積、增強線粒體生物合成以及修復線粒體損傷來實現[8]。近年來,抗疲勞功能性飲料成為促進疲勞消除和提高機體機能的理想產品[9],受到廣泛青睞。

番茄（LycopersiconesculentumMill.）含有豐富的維生素C、番茄紅素和多酚等活性物質,這些物質具有抗氧化、降血脂和抗癌活性,對人類健康具有積極影響[10]。番茄及其衍生產品是促進健康的營養食品和微量營養素的良好來源。利用釀酒酵母發酵番茄汁,可改善果汁的物理性質和番茄紅素的體外生物可及性[11]。番茄汁經乳酸菌發酵后其中的礦質營養元素、B族維生素含量均有較大提高,且菌體分泌的蛋白酶能夠分解多余的多肽和蛋白質從而提高氨基酸種類和含量[12]。利用益生菌（植物乳桿菌和嗜熱鏈球菌）發酵的番茄原汁,融合了益生菌和番茄汁的營養價值與保健功能,且其口感得到改善[13]。

目前關于益生菌發酵番茄汁（probiotic fermented tomato juice,PFTJ）抗疲勞作用的研究未見報道。因此,本研究通過小鼠負重力竭游泳實驗,結合小鼠生化指標、骨骼肌中5′-腺嘌呤核苷酸蛋白激酶（adenosine 5′-monophosphate-activated protein kinase,AMPK）和過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔助活化因子1α（peroxisome proliferator activated receptor gamma coactivator-1alpha,PGC-1α）基因的表達水平評估PFTJ 的抗疲勞效果,并通過腸道菌群群落結構探究其調節腸道菌群的功能,以期為功能型番茄發酵制品的開發與應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

發酵番茄汁（經植物乳桿菌和嗜熱鏈球菌充分發酵后超高溫瞬時殺菌）:新疆冠農股份有限公司。無特定病原體（specific pathogen free,SPF）級雄性ICR 小鼠:（20±2）g,北京華阜康生物科技股份有限公司,合格證號SCXK（京）2019-0008,飼養環境溫度（25±1）℃,自由飲水進食,將小鼠進行1 周的適應性飼養后分組實驗。

紅景天膠囊:江蘇康緣藥業股份有限公司（國藥準字Z20040023）；尿素氮（blood urea nitrogen,BUN）測定試劑盒、乳酸（lactic acid,LA）測定試劑盒、糖原測定試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）測定試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase,GSH-Px）測定試劑盒、丙二醛（malondialdehyde,MDA）測定試劑盒:南京建成生物工程研究所；快速去基因組cDNA 第一鏈合成試劑盒:康維世紀生物科技股份有限公司；化學染料法定量聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction,PCR）預混液（無ROX）:莫納生物科技有限公司。

1.2 主要儀器與設備

高速冷凍離心機（RE-52）:賽默飛世爾科技有限公司；數顯恒溫水浴鍋（DK-98-Ⅱ）:天津市泰斯特儀器有限公司；酶標儀（SpectraMAX i3x）:美國美谷分子儀器有限公司；電子天平（AR124CN）:美國奧豪斯儀器有限公司；熒光定量PCR 儀（CFX connectTM）:美國BIO-RAD 公司。

1.3 方法

1.3.1 動物分組

將雄性ICR 小鼠隨機分成4 組:空白對照組（生理鹽水）、陽性對照組（紅景天膠囊0.06 g/kg）、PFTJ 低劑量組（5 mg/kg）和高劑量組（15 mg/kg）,每組10 只,實驗前進行小鼠適應性喂養1 周。空白對照組每天灌胃10 mL/kg 的生理鹽水,PFTJ 低劑量組和高劑量組分別灌胃5 mg/kg 和15 mg/kg 的PFTJ,連續灌胃4 周,每7 d 量取一次體質量,按體質量變化量調整灌胃量。動物實驗的倫理審批單位為河北科技大學動物實驗倫理審查委員會（批準號:2022017）。

1.3.2 小鼠負重力竭游泳實驗

末次灌胃PFTJ 40 min 后進行小鼠負重力竭游泳實驗,將小鼠置于溫度（25±5）℃、水面高25 cm 左右的塑料容器中,并在小鼠尾部負荷體質量10%的鐵塊進行游泳實驗,以小鼠沉入水面10 s 不能浮出水面的時間作為負重力竭游泳時間[14]。

1.3.3 血清和肌肉組織中生化指標的測定

負重力竭游泳小鼠休息10 min 后于眼眶靜脈取血,將血液收集到1.5 mL 離心管中,4 ℃、3 000 r/min離心15 min,分離后取血清,置于1.5 mL 離心管,于-20 ℃中保存待測。按照試劑盒方法測定BUN 含量和LA 含量。

頸椎脫臼法處死小鼠,取0.25 g 的骨骼肌組織加入2.25 mL 的生理鹽水,冰水浴條件下研磨勻漿,制成質量體積比為10%的組織勻漿液,4 ℃、2 500 r/min 下離心10 min,取上清液,按照試劑盒方法測定糖原和MDA 含量以及SOD 和GSH-Px 活性。

1.3.4 小鼠骨骼肌中AMPK和PGC-1α的實時熒光定量聚合酶鏈式反應（real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR）分析

采用RT-qPCR 分析小鼠骨骼肌中AMPK和PGC-1αmRNA 基因的表達。苯酚-胍鹽法（Trizol）法從骨骼肌中提取總RNA,使用逆轉錄試劑盒合成互補DNA（cDNA）。PGC-1α正向引物序列為（5′CGATGACCCTCCTCACACCAAAC3′）,反向引物序列為（5′TTGCGACTGCGGTTGTGTATGG3′）；AMPK正向引物序列為（5′CGAGTGTTCGGAGGAGGAGGTC3′）,反向引物序列為（5′GTGGGCTGGTTGCTAGGTAGAAATC3′）。之后進行RT-qPCR,qPCR 條件為95 ℃15 min,之后95 ℃10 s、56 ℃30 s 和72 ℃30 s,40 個循環。數據分析采用2（-ΔΔCT）方法進行。

1.3.5 腸道菌群的測定

小鼠飼養4 周后每只小鼠收集3～5 粒糞便（每組3 個平行）,提取糞便DNA、16S RNA V3～V4 可變區擴增,引物為338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和806R（5′-GGACATCHVGGGTWTCTAAT-3′）,之后進行高通量測序。利用UPARSE 軟件對操作分類單元（operational taxonomic units,OTU）進行聚類設置相似度為97%,通過比對數據庫（比對閾值為70%）,對每條序列進行物種分類注釋。其余數據處理均在上海美吉生物公司生信云（https://cloud.majorbio.com/）中進行。

1.4 數據處理

實驗數據結果用平均值±標準差表示,利用SPSS Statistics 26.0 統計軟件進行單因素方差分析,Duncan法進行多重差異顯著比較,Origin 2019 作圖,P<0.05表示數據有顯著差異。

2 結果與分析

2.1 PFTJ 對小鼠體質量的影響

小鼠體質量變化反映了PFTJ 對小鼠食欲和健康情況的影響[15]。灌胃4 周各組小鼠的體質量變化情況如表1 所示。

表1 各組小鼠體質量變化（n=10）Table 1 Change in body weight of mice in each group（n=10）g

由表1 可知,隨著灌胃時間的延長,小鼠的體質量呈增加趨勢。在同一時間,PFTJ 組與空白對照組和陽性對照組相比均無明顯差異。同時,灌胃期間小鼠未發現異常或死亡情況,結果表明PFTJ 不會影響小鼠的健康生長。

2.2 PFTJ 對小鼠負重力竭游泳時間的影響

負重力竭游泳實驗是評估抗疲勞能力的動物模型之一[16]。游泳時間的長短可以反映疲勞程度,運動耐力的提升是抗疲勞功效的表現。PFTJ 灌胃ICR 小鼠28 d 后,各組小鼠的負重力竭游泳時間見表2。

表2 各組小鼠負重力竭游泳時間（n=10）Table 2 Exhausted swimming time of mice in each group（n=10）min

由表2 可知,與空白對照組相比,陽性對照組、PFTJ 低劑量組和PFTJ 高劑量組的負重力竭游泳時間均有所延長,PFTJ 低劑量組和PFTJ 高劑量組的力竭游泳時間分別為34.60 min 和38.81 min,較空白對照組分別提高了22.65%和37.58%,以上結果表明,PFTJ能延長小鼠的負重力竭游泳時間,提高運動耐力,且小鼠負重力竭游泳時間隨PFTJ 灌胃劑量的升高而延長,PFTJ 具有一定的抗疲勞作用。

2.3 PFTJ 對小鼠血清中尿素氮和乳酸含量的影響

疲勞的產生與代謝產物的積累有關,過多的代謝物會對機體產生毒害作用[17]。高強度的運動會造成機體中尿素氮（BUN）和乳酸（LA）的過量積累。當運動將機體貯存的能量消耗殆盡時就會分解肌肉蛋白而產生氨,高濃度的氨會影響腦組織內能量代謝和神經遞質的傳遞,導致運動性疲勞[18]。血液中的氨以BUN 形式存在,是蛋白質和氨基酸的代謝產物,在肝臟中合成后被血液運輸到腎臟隨尿液排出。在長時間高強度運動狀態下,肌肉內的氧氣不斷地消耗,會出現缺氧的現象,這時會促進糖酵解過程中丙酮酸在乳酸脫氫酶的催化作用下產生大量的LA,使肌肉和血液中的pH 值降低進而影響糖原分解,能量供應受阻而造成運動性疲勞[19]。PFTJ 對小鼠血清中BUN 含量的影響見圖1。

圖1 PFTJ 對小鼠血清中尿素氮含量的影響Fig.1 Effect of PFTJ on blood urea nitrogen（BUN）concentration in the serum of mice

由圖1 可知,負重力竭游泳后空白對照組小鼠血清中的BUN 含量為9.40 mmol/L,陽性對照組、PFTJ 低劑量組和PFTJ 高劑量組的BUN 含量均低于空白對照組。隨著PFTJ 劑量升高BUN 含量呈下降趨勢。與空白對照組相比,PFTJ 高劑量組的BUN 含量顯著下降了27.34%（P<0.05）。

PFTJ 對小鼠血清中LA 含量的影響如圖2 所示。

圖2 PFTJ 對小鼠血清中乳酸含量的影響Fig.2 Effect of PFTJ on lactic acid（LA）concentration in the serum of mice

由圖2 可知,與空白對照組相比,陽性對照組、PFTJ 低劑量組和PFTJ 高劑量組的乳酸含量分別下降了4.90%、5.01% 和14.00%,其中PFTJ 高劑量組能顯著降低小鼠體內乳酸的產生（P<0.05）。綜上,PFTJ 能夠有效清除劇烈運動后小鼠體內的BUN 和LA,延緩疲勞的產生、增強抗疲勞能力。

2.4 PFTJ 對小鼠肌糖原含量的影響

肌糖原是機體運動時的主要能量來源,肌糖原消耗嚴重會影響小鼠的運動能力,尤其是運動耐受力[20]。劇烈運動會使肌糖原迅速分解,從而為肌肉收縮提供能量,所以肌糖原的含量可以很好地反映疲勞程度。PFTJ 對小鼠肌糖原含量的影響見圖3。

圖3 PFTJ 對小鼠骨骼肌中肌糖原含量的影響Fig.3 Effect of PFTJ on muscle glycogen content in the skeletal muscle of mice

由圖3 可知,空白對照組的肌糖原含量為5.28 mg/g,與空白對照組相比,陽性對照組、PFTJ 低劑量組和高劑量組肌糖原含量分別顯著提高了44.70%、21.97%和47.35%（P<0.05）。PFTJ 處理組能提高肌糖原含量,為肌肉收縮提供足夠能量,減少糖原消耗,緩解疲勞。Kim 等[21]研究發現,灌喂高劑量鐵皮石斛提取物能降低小鼠運動期間作為能量來源的糖原的利用,這與本研究結果相同。

2.5 PFTJ 對小鼠肌肉組織中抗氧化相關指標的影響

高強度運動會使機體處于氧化應激狀態,產生大量自由基[如活性氧自由基（reactive oxygen species,ROS）],降低機體抗氧化能力,進而誘導疲勞產生[1]。SOD、GSH-Px 和CAT 這些抗氧化酶在清除自由基及其代謝產物方面起重要作用,還可以預防各種疾病,被認為是抵抗ROS 的重要防線。PFTJ 對小鼠肌肉組織中抗氧化相關指標的影響見圖4～圖6。

圖4 PFTJ 對小鼠SOD 活性的影響Fig.4 Effect of PFTJ on SOD activity in mice

由圖4 可知,空白對照組小鼠肌肉組織的SOD 活性為16.51 U/mg。與空白對照組相比,陽性對照組、PFTJ 低劑量組和高劑量組分別顯著提高了55.00%、29.07% 和76.56%（P<0.05）。由圖5 可知,PFTJ 高劑量組GSH-Px 活性較空白對照組顯著提高了21.35%（P<0.05）。由圖6 可知,MDA 含量隨PFTJ 劑量的增加而降低,與空白對照組相比,PFTJ 高劑量組顯著降低了38.06%（P<0.05）。以上結果表明,PFTJ 能夠提高小鼠肌肉抗氧化酶（SOD 和GSH-Px）活性,降低自由基代謝產物MDA 的積累,且具一定的劑量效應關系。

圖5 PFTJ 對小鼠GSH-Px 活性的影響Fig.5 Effect of PFTJ on GSH-Px activity in mice

圖6 PFTJ 對小鼠MDA 含量的影響Fig.6 Effect of PFTJ on MDA content in mice

2.6 PFTJ 對小鼠骨骼肌中AMPK 和PGC-1α 基因表達的影響

AMPK/PGC-1α 是調控能量代謝的關鍵信號通路,在肌肉運動和物質利用中發揮重要作用。AMPK 在運動疲勞時被迅速激活,PGC-1α 作為AMPK 的重要下游靶分子,可直接被AMPK 磷酸化,在線粒體生物發生中起關鍵作用[20]。PFTJ 對小鼠骨骼肌中AMPK和PGC-1α基因表達的影響見圖7。

圖7 PFTJ 對小鼠骨骼肌中AMPK 和PGC-1α 基因相對表達的影響Fig.7 Effects of PFTJ on the mRNA relative genes expression of AMPK and PGC-1α in the skeletal muscle of mice

由圖7 可知,與空白對照組相比,陽性對照組和PFTJ 處理組小鼠肌肉中AMPK和PGC-1α的mRNA表達水平均有所提高。隨著PFTJ 劑量的增加,AMPK和PGC-1α的表達水平增加。與空白對照組相比,陽性對照組AMPK和PGC-1α的mRNA 表達水平分別提高了38.71%和80.95%,PFTJ 低劑量組和高劑量組小鼠骨骼肌AMPK的表達水平分別顯著提高了83.40%和231.90%,PGC-1α的mRNA 表達水平分別顯著提高了160.60% 和417.87%（P<0.05）。由此可見,PFTJ 可誘導AMPK和PGC-1α表達水平的升高,促進線粒體的合成,從而增加ATP 的產生,延緩疲勞。Wen 等[7]發現番茄紅素可以激活AMPK/PGC-1α 調控通路,促進線粒體的生物合成,使快收縮肌肉纖維向慢收縮肌肉纖維的轉變,慢收縮肌肉纖維能夠高效利用氧合成ATP 維持肌肉收縮,增強骨骼肌的疲勞抗性。

2.7 PFTJ 對小鼠腸道菌群多樣性的影響

腸道菌群多樣性及其對人體的生理和病理之間的關系現已得到廣泛研究證實。利用香菜類黃酮[20]、鐵皮石斛多糖[22]進行飲食干預調節小鼠腸道菌群,增加菌群多樣性,可以提高抗疲勞能力。腸道菌群Alpha多樣性分析能反映生物群落的豐富度和多樣性。Chao指數主要反映微生物群落的豐富度,數值越大,表明群落中含有OTU 數目越多,群落的豐富度越大；Shannon指數反映微生物群落的多樣性,數值越大,表明群落中多樣性越高。PFTJ 對小鼠腸道菌群多樣性的影響見圖8。

圖8 PFTJ 對小鼠腸道菌群Alpha 多樣性指數的影響Fig.8 Effects of PFTJ on Alpha diversity indexes of the intestinal microflora in mice

由圖8 可知,空白對照組小鼠Chao 和Shannon 指數分別為226.90 和1.36,陽性對照組小鼠Chao 和Shannon 指數均顯著高于空白對照組（P<0.05）。與空白對照組相比,PFTJ 低劑量組和PFTJ 高劑量組小鼠Chao 和Shannon 指數均有所提高,其中PFTJ 高劑量組小鼠Chao 和Shannon 指數分別提高了22.24% 和111.76%。以上結果表明,PFTJ 能提高Chao 和Shannon 指數,改善小鼠腸道菌群的豐富度和多樣性,并隨著PFTJ 劑量呈現一定劑量依賴趨勢。

Beta 多樣性是利用每個樣品序列的進化關系和豐度信息來計算樣本之間的距離,以反映樣本（組）之間是否存在顯著的微生物群落差異[23]。主坐標分析（principal co-ordinates analysis,PCoA）是Beta 多樣性常用的分析方法。小鼠腸道菌群在OTU 水平上的PCoA 分析如圖9 所示。

圖9 各組小鼠腸道菌群Beta 多樣性主坐標分析Fig.9 PCoA diagram of Beta diversity of the intestinal microflora in mice of each group

由圖9 可知,空白對照組與陽性對照組、PFTJ 低劑量組和高劑量組均產生分離,而PFTJ 高劑量組與低劑量組距離靠近,說明PFTJ 可以改變小鼠腸道菌群的組成。PFTJ 高、低劑量組的分布更為集中,且PFTJ 劑量越高各組樣本之間距離越小,個體差異越小,說明給予PFTJ 可以提高小鼠腸道菌群的進化相似性,通過PFTJ 干預能夠使小鼠建立新的腸道菌群環境。馮瑞方等[24]利用牛骨膠原蛋白肽干預Balb/c 小鼠4 周以提高小鼠抗疲勞能力,發現主成分分析在PC2 軸（解釋度為15.45%）上,對照組和肽干預組間菌群無交叉,這與本研究結果相似。

2.8 小鼠腸道菌群的科、屬水平物種組成分析

小鼠腸道菌群的科、屬水平物種組成分析見圖10、圖11。

圖10 PFTJ 對小鼠腸道菌群科水平物種組成的影響Fig.10 Effect of PFTJ on the species composition of the intestinal microflora in mice at family level

圖11 PFTJ 對小鼠腸道菌群屬水平物種組成的影響Fig.11 Effect of PFTJ on the species composition of the intestinal microflora in mice at genus level

由圖10、圖11 可知,利用PFTJ 進行干預后小鼠腸道菌群發生了變化。在科水平上乳桿菌科（Lactobacillaceae）和Muribaculaceae 科的相對豐度上調,丹毒絲菌科（Erysipelotrichaceae）、雙歧桿菌科（Bifidobacteriaceae）的相對豐度下調。在屬水平上,乳酸桿菌屬（Lɑctobɑcillus）和norɑnk_f_Muribɑculɑceɑe相對豐度上調,而糞桿菌屬（Fɑecɑlibɑculum）和雙歧桿菌屬（Bifidobɑcterium）則下調。有研究表明,增加腸道微生物群乳酸桿菌屬的豐度可以提高腸道內短鏈脂肪酸（short chain fat acid,SCFA）的濃度[25],對于調節腸道菌群起到了積極作用。牛骨膠原蛋白肽能夠明顯上調小鼠腸道菌群中norank_f_Muribɑculɑceɑe的相對豐度,提高小鼠疲勞能力[24]。norɑnk_f_Muribɑculɑceɑe的豐度與健康小鼠糞便中富集的代謝產物呈正相關,可能是一種富含于健康腸道環境中的細菌[26]。在PFTJ 干預后,小鼠腸道中乳酸桿菌屬和norɑnk_f_Muribɑculɑceɑe相對豐度上調,由于這兩種有益菌對增加SCFA 和腸道健康有積極作用,推測其相對豐度的提高可能與PFTJ 的抗疲勞作用有關。

3 討論與結論

機體疲勞的產生機制主要包括代謝產物積累理論、能量消耗理論和自由基理論[27]。細胞無氧呼吸過程中糖代謝會產生LA,蛋白質代謝水解加強則會產生氨,經肝循環形成尿素,最后形成BUN,體內LA 和BUN 這兩種產物積累越多越容易產生疲勞。本研究結果發現PFTJ 可以降低LA 和BUN 含量,提高機體的疲勞耐受。根據“能量消耗理論”,運動開始時消耗細胞中的葡萄糖,血糖降低,肌糖原分解進行有氧呼吸,當肌糖原大量消耗而得不到及時補充,便會導致機體疲勞。PFTJ 能夠提高小鼠肌糖原水平,且呈現一定的劑量效應。自由基被認為是導致機體疲勞的主要因素,過量的高強度運動會導致產生過量的自由基,破壞蛋白質和核酸結構,攻擊生物膜致使脂質過氧化生成MDA,造成氧化應激損傷,引發肌肉疲勞。細胞的抗氧酶包括SOD、GSH-Px 等,能清除過多的自由基以維持機體氧化抗氧化平衡。高劑量PFTJ 能夠顯著提高SOD 和GSH-Px 的活性以清除自由基避免細胞受損,同時降低MDA 含量。AMPK/PGC-1α 信號通路在調節缺氧和能量代謝過程中起著非常重要的作用。激活此通路可促進線粒體生物合成緩解細胞缺氧,修復氧化損傷。在本研究中發現高劑量PFTJ 能顯著提高小鼠骨骼肌中AMPK和PGC-1α的mRNA 表達水平,進而提高PGC-1α的轉錄活性,為細胞提供能量。

腸道菌群被稱為機體的“第二基因組”,腸道菌群多樣性分析已成為近年來研究健康與疾病的新視角[20]。劇烈運動產生過量自由基造成運動性氧化應激損傷,增加有害代謝物沉積,誘發疲勞加重,可能還會導致腸道菌群多樣性降低,致病菌相對豐度升高。本研究發現PFTJ 能夠提高腸道菌群多樣性,促進乳酸桿菌屬和norɑnk_f_Muribɑculɑceɑe生長,抑制丹毒絲菌科。在屬水平上,PFTJ 促進了產SCFA 的乳桿菌屬的大量增殖,而短鏈脂肪酸可以改善葡萄糖的代謝、吸收和轉移,并有助于緩解疲勞[28]；同時PFTJ 提高了腸道有益菌屬norɑnk_f_Muribɑculɑceɑe的豐度。

綜上所述,PFTJ 通過減少疲勞相關代謝物的堆積,抑制糖原消耗增強能量儲備,還可以調節氧化相關酶以減緩氧化應激,激活AMPK/PGC-1α 通路來緩解疲勞。PFTJ 干預調節腸道菌群結構,有助于產SCFA 腸道微生物群直接獲得競爭優勢,以達到更好的抗疲勞效果。PFTJ 有望成為抗疲勞、調節腸道菌群的新型保健功能性飲料原料,但其抗疲勞與腸道菌群的關系有待進一步通過代謝組學和宏基因組學的方法進行深入研究。