超聲波協(xié)同低溫等離子體活化水降解黑木耳中抗生素

蔡瑞，焦睿智，岳田利，高振鵬，袁亞宏，王周利*

（1.西北大學食品科學與工程學院,陜西西安 710069；2.西北農(nóng)林科技大學食品科學與工程學院,陜西楊凌 712100）

黑木耳肉質(zhì)細膩、營養(yǎng)豐富,是我國珍貴的藥食兼用膠質(zhì)真菌[1]。作為食用菌中的第二大產(chǎn)業(yè),黑木耳的人工栽培或自然生長已遍布我國20 多個省份。據(jù)統(tǒng)計,2022 年我國黑木耳產(chǎn)量超過830 萬t 且產(chǎn)業(yè)規(guī)模仍在不斷擴大。近年來獸類抗生素的大量使用已對自然環(huán)境造成影響,不同基質(zhì)中都檢測到了抗生素的殘留[2]。喹諾酮類抗生素作為常見獸藥成分,污染食品后可引起消費者過敏反應、器官損傷、急性中毒等[3],對此,我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部對相關食品中抗生素有嚴格的限量標準,如牛奶中恩諾沙星和環(huán)丙沙星的限量分別為0.1μg/kg 和100μg/L,蛋制品中兩種抗生素的限量為10μg/kg。在木耳栽培中,由于抗生素殘留會污染木屑、麩皮等栽培基料,進而逐漸遷移到木耳產(chǎn)品中,因此我國相關標準對食用菌中恩諾沙星、環(huán)丙沙星等喹諾酮類抗生素的限量標準為10～500μg/kg[4],故建立木耳中抗生素的有效控制方法非常必要。超聲處理具有一定的超聲機械效應,超聲波的傳播使水分子振動,加速分子位移和碰撞速度,對內(nèi)容物分子結構產(chǎn)生巨大沖擊力,破壞內(nèi)容物的化學鍵；同樣還具有空化效應[5],導致溶液局部出現(xiàn)高溫高壓環(huán)境,使水分子裂解形成·H 和·OH,內(nèi)容物進入空化泡內(nèi),也會使化學結構在高溫高壓條件下發(fā)生熱裂解,導致化學鍵斷裂[6]。等離子體是物質(zhì)繼固態(tài)、液態(tài)和氣態(tài)之后的第4 種狀態(tài),當外加電壓達到分子的擊穿電壓時,分子會發(fā)生電離并形成電子、離子、原子和原子團的混合物。低溫等離子體放電過程中電子溫度很高,但重粒子溫度較低,故整個系統(tǒng)仍呈現(xiàn)出低溫狀態(tài)。低溫等離子體中的活性組分與水反應,電子從電場中獲得能量,通過碰撞將能量轉(zhuǎn)化為分子的內(nèi)能和動能；獲得能量的分子被激發(fā),同時部分分子被電離生成大量的活性粒子,如處于激發(fā)態(tài)的原子和離子,最終這一系列電子、分子及自由基等形成等離子體活化水[7]。超聲波協(xié)同低溫等離子體活化水,利用超聲波對內(nèi)容物的機械效應及空化效應,協(xié)同低溫等離子體活化水中的大量活性離子,強化對黑木耳中的抗生素結構破壞及降解效果,目前該種聯(lián)合方法對于抗生素的降解研究還處于空白。

本研究以超聲波降解為核心手段,協(xié)同低溫等離子體活化水中的活性粒子,重點研究其對黑木耳中恩諾沙星、環(huán)丙沙星兩種喹諾酮類抗生素的降解效果,通過響應面試驗優(yōu)化超聲處理工藝參數(shù),并分析超聲協(xié)同低溫等離子體活化水處理后黑木耳的品質(zhì)變化,以期為食用菌生產(chǎn)加工過程中抗生素的控制提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇、甲酸、乙腈、磷酸（均為色譜純）:四川西隴科學有限公司；乙二胺四乙酸二鈉、檸檬酸、無水硫酸鈉、氯化鈉（均為分析純）:廣東光華科技股份有限公司；磷酸氫二鈉（分析純）:國藥集團化學試劑有限公司；乙二胺-N-丙基硅烷（ethylenediamine-N-propylsilane silica gel,PSA）（色譜純）:煙臺青云儀器設備有限公司；乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA）-Mcllvaine 緩沖液（pH4.0）:上海源葉生物科技有限公司；黑木耳:產(chǎn)自陜西省商洛市柞水縣下梁鎮(zhèn)西川村,經(jīng)檢測無環(huán)丙沙星和恩諾沙星抗生素殘留污染。

1.2 儀器與設備

HN5-150A 型超聲波清洗器、XH-D 型漩渦混合器:上海汗諾儀器有限公司；DBD-100A/B 型低溫等離子體設備:上海萬木春生物工程有限公司；LC-20A 型高效液相色譜儀:日本島津公司；HC-3018R 型高速冷凍離心機:安徽中科中佳科學儀器有限公司；Y1 升級版破壁機:九陽股份有限公司。

1.3 低溫等離子體活化水制備

利用介質(zhì)阻擋放電低溫等離子體設備制備活化水。調(diào)節(jié)介質(zhì)阻擋放電設備的參數(shù),在預試驗基礎上確定輸出電壓為4 kV,頻率為10 kHz。將1 L 無菌去離子水置于低溫等離子體設備料斗中,并將介質(zhì)阻擋放電等離子體設備極板放置于水平面之上,極板與液面的距離為5 mm。開啟電源,以外界空氣中惰性氣體（N2、O2、CO 等）為工作氣體,激發(fā)產(chǎn)生大量活性粒子,去離子水處理3 min 后得到低溫等離子體活化水,隨用隨制,置于常溫（25 ℃）環(huán)境下待用[8]。

1.4 單因素試驗

黑木耳中抗生素的加標與富集:將干制的黑木耳分別浸泡在不同抗生素濃度（1、2、4、8、16 mg/kg）水溶液中,常溫（25 ℃）環(huán)境下間隔一定時間取樣,經(jīng)高效液相色譜儀檢測處理后樣品的初始濃度,使其分別含有0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mg/kg 的抗生素。將100 mL 低溫等離子體活化水加入250 mL 燒杯中并加入5 g 黑木耳,放入超聲設備中（超聲波洗槽中加入6～8 L 水,保證浸沒1/2 高度燒杯）,利用低溫等離子體活化水中的高能電子、自由基等活性粒子對黑木耳中的抗生素進行降解,考察抗生素初始濃度（0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mg/kg）、超聲功率（240、320、400、480、560 W）、超聲頻率（25、33、40、59 kHz）、超聲時間（20、30、40、50、60 min）、超聲溫度（20、30、40、50 ℃）對抗生素降解效果的影響。每個樣品經(jīng)處理后,取一定量進行前處理并按色譜條件進行液相色譜分析,評價不同參數(shù)對抗生素降解的影響。

1.5 響應面優(yōu)化試驗

表1 三因素三水平的Box-Behnken 設計Table 1 Three-factor and three-level Box-Behnken design

在此基礎上,以優(yōu)化獲得的參數(shù)為基礎,分別采用超聲波（去離子水代替活化水）和低溫等離子體活化水進行抗生素降解試驗,評價不同處理對抗生素的降解效果。抗生素降解率計算公式如下。

T=（A0-Ai）/A0× 100

式中:T為降解率,%；A0為處理前抗生素濃度,mg/kg；Ai為處理后抗生素濃度,mg/kg。

1.6 高效液相色譜檢測

標準液制備:準確稱取環(huán)丙沙星、恩諾沙星2 種抗生素標準品各30 mg,溶于30 mL 乙腈中配制成濃度為1 g/L 的混合標品,避光置于-18 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

樣品制備:將處理后的基質(zhì)樣品用破壁機粉碎并裝入潔凈的密封袋,標明編號于干燥處保存。

提取:稱取1 g 基質(zhì)樣品置于100 mL 離心管中,加5 mL 去離子水浸泡10 min 后加入8 mL EDTAMcllvaine 緩沖液（pH4.0）,渦旋振蕩1 min 后加17 mL含有5% 甲酸的乙腈溶液中,提取并渦旋振蕩1 min；然后加入2 g NaCl 和3 g 無水Na2SO4鹽析除水,迅速搖勻再次渦旋振蕩1 min,用高速冷凍離心機在4 ℃、5 000 r/min 下離心5 min,待凈化步驟使用。

凈化:稱取0.15 g PSA,加入0.5 g 無水Na2SO4于10 mL 離心管中,向其中加入上述提取步驟中離心后的試管上清液5 mL,渦旋振蕩1 min 使其充分混合。用高速冷凍離心機在4 ℃、5 000 r/min 下離心5 min,再用1 mL 注射器吸取上清液1 mL,過0.22μm 有機相濾膜并裝入液相小瓶,于-20 ℃保存,待測[9]。

檔案管理是一項動態(tài)性的工作，主要體現(xiàn)在兩個方面：其一是檔案的生成具有動態(tài)性的特點，油田檔案的組成包括技術資料、日常文件等，經(jīng)過簡單篩選后，大多數(shù)都會作為檔案進行留存。其二是檔案的管理具有動態(tài)性的要求，管理人員需要根據(jù)油田企業(yè)工作需要，定期對這些檔案進行銷毀、更新或解密等處理。例如，一些檔案具有保存時效，這些檔案超過保存時效后，就需要按照相關要求銷毀。還有一些加密檔案，例如專利檔案等，也有加密時效，一段時間后需要解密，對外公開。確保檔案管理的動態(tài)性，對更好地發(fā)揮檔案價值也有很大幫助。

色譜檢測條件:色譜柱為Agilent TC-C18（4.6 mm×150 mm,5μm）；流動相A 為乙腈,流動相B 為0.7%磷酸水溶液；流速0.8 mL/min,等度洗脫（A 相20%,B相80%）；色譜柱柱溫30 ℃；進樣量20μL。熒光檢測器:激發(fā)波長280 nm,發(fā)射波長450 nm。

1.7 木耳品質(zhì)評價

總糖含量:參照GB/T 15672—2009《食用菌中總糖含量的測定》[10]；粗蛋白含量:參照GB 5009.5—2016《食品安全國家標準食品中蛋白質(zhì)的測定》[11]；粗脂肪含量:參照GB 5009.6—2016《食品安全國家標準食品中脂肪的測定》[12]；粗纖維含量:參照GB/T 5009.10—2003《植物類食品中粗纖維的測定》[13]；灰分含量:參照GB 5009.4—2016《食品安全國家標準食品中灰分的測定》[14]。測定處理后黑木耳的基礎理化指標,評價最優(yōu)處理條件下該方法對木耳中營養(yǎng)指標的影響。

1.8 數(shù)據(jù)處理與分析

每次樣品檢測或理化指標測定均做3 次平行取平均值,響應面試驗設計及分析采用Design Expert 8.0,采用SPSS 18 軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析及顯著性檢驗（p<0.05）,并使用Origin 2018 軟件作圖。

2 結果與討論

2.1 超聲波協(xié)同低溫等離子體活化水單因素試驗

超聲波協(xié)同低溫等離子體活化水處理對黑木耳中抗生素降解率的影響如圖1 所示。

圖1 超聲波協(xié)同低溫等離子體活化水對黑木耳中抗生素降解率的影響Fig.1 Effect of ultrasonic-assisted low-temperature PAW on degradation of antibiotics in Auricularia auricular

鑒于不同的抗生素限量一般是0.01～0.5 mg/kg,因此本研究按照對應限量的1、2、4、8、16 倍設置5 個濃度梯度,即0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mg/kg。如圖1（a）所示,在抗生素濃度為0.5 mg/kg 時,抗生素的降解效果最好,恩諾沙星與環(huán)丙沙星兩種喹諾酮類抗生素的降解效果分別可達53.11%和49.91%。隨著抗生素初始濃度升高,協(xié)同處理對抗生素的降解效果呈現(xiàn)逐漸降低趨勢,且不同濃度梯度之間有明顯差異。因此,抗生素初始濃度為0.5 mg/kg 效果較佳。如圖1（b）所示,隨著超聲功率增大,恩諾沙星降解率逐漸上升,環(huán)丙沙星降解率呈現(xiàn)先增大后減小趨勢,在超聲功率480 W時對黑木耳中抗生素的降解效果均達到52% 以上。如圖1（c）可知,當超聲頻率為25 kHz 時抗生素降解效果最好,提高超聲頻率對抗生素的降解有一定的抑制作用。如圖1（d）所示,在超聲時間20～50 min 時抗生素降解率不斷提高,超聲時間50～60 min 時降解效果升高不明顯,超聲時間50 min 時恩諾沙星與環(huán)丙沙星的降解率最高可以達到52.31% 和50.11%。如圖1（e）所示,在30 ℃時抗生素的降解效果較好,此時恩諾沙星和環(huán)丙沙星的降解率為53.66%和52.20%。不同處理參數(shù)變化時抗生素降解效果差異較大,這可能與等離子體中活性離子的組成和活性有關。在等離子體放電過程中,等離子體活化水中產(chǎn)生了大量的活性離子,并會顯著影響體系的pH 值、氧化還原電位和電導率等指標。比如,在空氣放電過程中會產(chǎn)生單態(tài)氧、超氧陰離子自由基、氫自由基、羥自由基、一氧化氮自由基等活性物質(zhì),這些活性物質(zhì)相互之間或與周圍氣體繼續(xù)發(fā)生反應并生成NO、NO2、H2O2、HNO3、O3等次級氧化產(chǎn)物。NO2還會進一步擴散到液體中并生成NO2-、NO3-和過氧亞硝基陰離子等活性物質(zhì),這些含氮物質(zhì)會造成溶液的酸化,顯著降低溶液的pH 值。此外,等離子體處理能夠顯著提高水溶液的氧化還原電位,這主要與活性氧、活性氮等物質(zhì)作用有關[15-16]。因此,超聲波協(xié)同低溫等離子體活化水處理樣品時,超聲波的空穴效應及處理參數(shù)差異會引起體系中活性離子組成及其活性變化,進而影響體系的pH 值和氧化還原電位等,最終引起抗生素降解率差異。綜上,超聲波協(xié)同低溫等離子體處理黑木耳時,超聲功率、超聲時間、超聲溫度對抗生素降解影響較大,因此以這3 個因素繼續(xù)進行優(yōu)化試驗。

2.2 超聲波協(xié)同低溫等離子體活化水響應面優(yōu)化試驗

2.2.1 響應面優(yōu)化試驗設計結果

在單因素試驗基礎上,固定超聲頻率25 kHz、抗生素初始濃度0.5 mg/kg,以超聲功率、超聲時間和超聲溫度3 個因素為自變量,采用Box-Behnken 中心組合試驗評估不同因素組合對抗生素降解效果的影響。響應面設計及結果見表2。

表2 Box-Behnken 設計試驗的結果Table 2 Results of Box-Behnken design test

通過Design Expert 8.0 軟件對不同因素組合的恩諾沙星與環(huán)丙沙星降解率數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合,得到與A、B、C相關的恩諾沙星降解率（Y1）的二次多項回歸模型為Y1=55.23+1.93A+0.99B+0.88C+0.75AB+1.31AC+0.49BC-2.42A2-5.22B2-2.80C2；環(huán)丙沙星降解率（Y2）的二次多項回歸模型為Y2=50.76+2.09A+1.47B+1.21C+0.65AB+1.63AC+1.02BC-2.62A2-4.20B2-1.99C2。對恩諾沙星降解率的二次多項回歸模型與環(huán)丙沙星降解率的二次多項回歸模型進行顯著性方差分析,結果見表3、表4。

表3 Y1 回歸模型的方差分析Table 3 Variance analysis of Y1 regression model

表4 Y2 回歸模型的方差分析Table 4 Variance analysis of Y2 regression model

由表3、表4 可知,Y1模型的R2=0.977 0,R2Adj=0.947 4,Y2模型的R2=0.979 2,R2Adj=0.952 4。在統(tǒng)計學上,模型的決定系數(shù)R2表示該模型的擬合優(yōu)度,R2值越大則該模型表現(xiàn)的顯著性越高,自變量對因變量的解釋程度越高[17-18]。Y1與Y2模型的R2Adj系數(shù)表明這兩種模型與真實數(shù)據(jù)的擬合程度良好,符合研究實際意義,可用該模型優(yōu)化超聲波協(xié)同低溫等離子體活化水的處理條件。Y1回歸模型的F值為33.02,p值小于0.01,Y2回歸模型的F值為36.60,p值同樣小于0.01,表明兩種回歸模型都極顯著；失擬項p值分別為0.933 7 與0.815 3,均遠大于0.05,表明失擬項差異不顯著且模型的擬合性良好,該模型具有實際研究意義。根據(jù)p值大小可以看出模型的因子顯著性,其中Y1模型的一次項A、二次項A2、B2、C2對響應值的影響極顯著（p<0.01）,一次項B、C、交互項AC對響應值影響顯著（p<0.05）,模型交互項AB、BC影響不顯著（p>0.05）；Y2模型的一次項A、B、C、交互項AC、二次項A2、B2、C2的影響均極顯著（p<0.01）；交互項BC影響顯著（p<0.05）且交互項AB影響不顯著（p>0.05）。根據(jù)F值的大小比較各種因素對抗生素降解率的影響,兩種抗生素模型影響大小排序為超聲時間>超聲溫度>超聲功率。

2.2.2 響應面試驗結果分析

超聲時間、超聲溫度、超聲功率3 個不同因素兩兩交互作用對恩諾沙星及環(huán)丙沙星降解率的影響如圖2和圖3 所示。

圖2 兩因素交互作用對恩諾沙星降解率的影響Fig.2 The effect of two factors interaction on the degradation rate of enrofloxacin

圖3 兩因素交互作用對環(huán)丙沙星降解率的影響Fig.3 The effect of two factors interaction on the degradation rate of ciprofloxacin

由圖2 和圖3 可知,響應面及等高線結果與兩模型方差分析的結果基本一致,Y1回歸模型中超聲時間與超聲功率的交互作用影響顯著；Y2回歸模型中,超聲時間與超聲功率、超聲溫度與超聲功率之間的交互作用對環(huán)丙沙星的降解率影響顯著。根據(jù)建立的兩種抗生素降解率模型Y1與Y2,得到的最優(yōu)條件為超聲時間45.21 min、處理溫度31.69 ℃、超聲功率507.33 W,此時對恩諾沙星、環(huán)丙沙星的降解效果為55.91%和51.85%,預測準確度為96.2%。張秀芬等[19]在研究超聲波輔助水酶法對辣木籽油提取率的條件優(yōu)化中,采用響應面法優(yōu)化提取中的超聲條件,同樣分析了不同因素交互作用的響應面及等高線,得到不同因素對辣木籽油提取率的影響程度,并得到超聲條件的最優(yōu)工藝,其驗證試驗的降解率與模型建立的最優(yōu)工藝預測降解率無明顯差異。

2.2.3 驗證試驗

為進一步確定抗生素降解效果的最優(yōu)條件,根據(jù)Design Expert 8.0 模型預測的結果,綜合實際操作的可行性和經(jīng)濟原則,固定因素超聲頻率25 kHz、抗生素初始濃度0.5 mg/kg,將最優(yōu)試驗條件調(diào)整為超聲時間45 min、處理溫度30 ℃、超聲功率480 W,使用超聲協(xié)同低溫等離子體活化水平行處理3 次,結果見圖4。

圖4 不同處理方式對木耳中抗生素降解率的影響Fig.4 The effect of different treatments on the degradation rate of antibiotics in Auricularia auricular

由圖4 可知,恩諾沙星與環(huán)丙沙星兩種抗生素降解率分別為55.47%和51.92%,與預測值無明顯差異,說明該響應面法優(yōu)化抗生素的降解條件有效可行。同時,以優(yōu)化獲得的超聲波處理參數(shù)為基礎,以去離子水代替活化水進行木耳加標樣品處理,發(fā)現(xiàn)其對恩諾沙星與環(huán)丙沙星的降解率分別為26.36%和23.48%；將木耳樣品置于低溫等離子體活化水中,30 ℃條件下處理45 min時兩種抗生素的降解率分別為16.58%和15.36%。

以上結果表明,超聲波和等離子活化水均對抗生素的降解有一定作用,而二者協(xié)同處理能進一步提高抗生素的降解率。這與Ali 等[20]采用超聲波聯(lián)合等離子水活化水/緩沖液進行番茄中百菌清降解,發(fā)現(xiàn)聯(lián)合處理對農(nóng)藥的降解率達到93%以上,且顯著優(yōu)于超聲波、等離子水體活化水和等離子體緩沖液單獨處理的結果一致。Thokchom 等[21]以等離子體活化水和超聲波協(xié)同處理污染物時,超聲波的空穴效應可以提高氧化過程和羥基自由基的生成,進而提高目標物的降解率；Zhu 等[22]發(fā)現(xiàn)高壓、高溫、來源于水分子的OH-以及超聲波的空穴效應等可以持續(xù)提高有機殺蟲劑的降解率。

2.3 超聲波協(xié)同低溫等離子體活化水處理后木耳的品質(zhì)評價

在上述最優(yōu)參數(shù)下評價超聲波協(xié)同低溫等離子體活化水處理對木耳品質(zhì)的影響,結果如表5 所示。

表5 超聲波協(xié)同低溫等離子體活化水處理對木耳品質(zhì)的影響Table 5 Effect of ultrasonic-assisted low-temperature PAW treatment on the quality of Auricularia auricula

由表5 可知,處理后木耳中總糖含量為34.65%,比處理前降低了5.24%,依然高于國家標準中木耳總糖含量不低于22%的要求。同時,處理后木耳的粗蛋白含量降低1.24%、粗脂肪含量降低0.12%,對粗纖維、灰分無顯著性影響（p>0.05）,且均符合國家標準對黑木耳的理化指標要求[23]。

3 結論

本研究采用超聲波協(xié)同低溫等離子體活化水對木耳中抗生素進行處理,并通過響應面設計優(yōu)化得到最佳工藝參數(shù),在超聲功率480 W、超聲時間45 min、超聲溫度30 ℃、超聲頻率25 kHz、抗生素濃度0.5 mg/kg條件下,木耳中環(huán)丙沙星和恩諾沙星降解率分別可達51.92% 及55.47%。經(jīng)過處理后,木耳中總糖、粗蛋白、粗脂肪含量分別降低5.24%、1.24%、0.12%,粗纖維和灰分含量無顯著變化,經(jīng)過處理后主要營養(yǎng)指標均符合國家標準要求,因此,本研究建立的處理方法為木耳中抗生素控制提供了新思路。