趕黃草活性成分提取及不同部位成分分布對比

向卓亞

朱柏雨1

朱永清1

夏 陳1

陳 松2

(1. 四川省農業科學院農產品加工研究所〔四川省農業科學院食物與營養健康研究所〕,四川 成都 610066;2. 古萃〔古藺〕生物科技有限公司,四川 瀘州 646500)

趕黃草為虎耳科扯根菜屬植物(PenthorumchinensePursh)全草,又名水楊柳、扯根菜,主要分布于東北、華北、華南和西南,是四川古藺縣重要農作物及中藥材[1]。其富含多種活性成分,主要為類黃酮類、香豆素類、鞣質類、三萜類等,其中黃酮類化合物被認為是其主要活性成分[2-3]。基于其豐富的活性成分,趕黃草常被苗醫作為治療肝病傳統藥物,現代研究[4-5]表明其具有抗氧化、抗肝炎病毒、酒精/非酒精性肝臟保護等作用。

趕黃草作為新食品原料[6-7],已有不同溶劑提取趕黃草的研究[8],但考察指標僅為槲皮素這一指標。此外,趕黃草作為全草植物,目前市場上通常將其花、葉、莖3個部位分別出售,其中花的價格最高,葉次之,莖最低,可能是由于不同部位的槲皮素含量差異較大[9],而關于趕黃草不同部位各類活性物質分布及抗氧化活性的研究尚未見報道。研究擬以水、乙醇和甲醇作為溶劑提取趕黃草全草中的活性成分,以總多酚、總黃酮含量以及體外抗氧化能力為指標,比較不同溶劑的提取效果。并以趕黃草不同部位(花、莖、葉)為研究對象,采用最佳提取溶劑進行提取,比較不同部位趕黃草活性成分含量差異,為趕黃草的合理開發與進一步利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

趕黃草全草:分別于2021年8月和2022年8月在四川省瀘州市古藺縣黃荊鎮采收,將其花、葉、莖剝離分開,標記為H1、J1、Y1、H2、J2、Y2,自然風干,樣品信息見表1,所有樣品經粉碎并過80目篩,密封,于-18 ℃保存備用;

表1 供試樣品信息來源

沒食子酸、兒茶素、原兒茶酸、表兒茶素、蘆丁、異槲皮苷、山奈酚-3-O-蕓香糖苷、紫云英苷、阿福豆苷、喬松素葡萄糖苷、槲皮素、山奈酚、沒食子酰3苯并、喬松素、趕黃草苷A(純度≥98%):色譜純,美國Simga公司;

α-生育酚聚乙二醇琥珀酸酯(水溶性VE)、福林酚、三硝基化鋁、碳酸鈉、沒食子酸:分析純,成都市科龍化工試劑廠;

數控超聲波清洗儀:KQ-250DB型,昆山市超聲儀器有限公司;

酶標儀:ELX-800型,美國伯騰儀器有限公司;

高效液相色譜儀:1290型,配備自動進樣器、二元泵、柱溫箱、DAD檢測器,美國Agilent公司;

超純水儀:UPT-11-2T型,四川優普超純科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品提取

(1) 溶劑:參照Guo等[10]的方法略作修改,稱取1 g趕黃草樣品,分別加入8 mL 不同溶劑(水、40%甲醇、80%甲醇、100%甲醇、40%乙醇、80%乙醇以及100%乙醇),40 ℃超聲提取30 min,8 000 r/min離心15 min,殘渣重復提取2次,合并3次提取液,定容至25 mL,即為趕黃草全草提取液,過0.22 μm濾膜,于4 ℃保存備用。

(2) 部位:分別稱取1 g趕黃草葉、花和莖,加入8 mL 80%乙醇,40 ℃超聲浸提30 min,6 000 r/min離心10 min,殘渣重復提取2次,合并3次提取液,定容至25 mL,即為趕黃草樣品提取液,過0.22 μm濾膜,于離心管中4 ℃保存備用。

1.2.2 總多酚含量測定 參照Xiang等[11]的方法。以沒食子酸質量濃度為橫坐標,吸光度為縱坐標繪制標準曲線為y=0.006 5x+0.004,R2=0.999。

1.2.3 總黃酮含量測定 參照Zhang等[12]的方法。以兒茶素質量濃度為橫坐標,吸光度為縱坐標繪制標準曲線為y=0.001 7x+0.001,R2=0.999。

1.2.4 抗氧化活性測定

(1) ABTS自由基清除能力:參照Ma等[13]的方法,以水溶性VE質量濃度為橫坐標,ABTS自由基清除率為縱坐標制作標準曲線為y=0.098x-0.140 1,R2=0.992 4。

(2) DPPH自由基清除能力:參照Deng等[14]的方法,以水溶性 VE質量濃度為橫坐標,DPPH自由基清除率為縱坐標制作標準曲線為y=0.310 7x+ 0.032 9,R2=0.998 6。

(3) 鐵離子還原能力(FRAP):參照Tian等[15]的方法,以水溶性VE質量濃度為橫坐標,吸光度為縱坐標制作標準曲線為y=1.786 3x+0.010 6,R2=0.999 8。

1.2.5 多酚類化合物測定 參照朱柏雨等[16]的方法稍作修改,提取物經0.22 μm微孔濾膜過濾后,采用高效液相色譜法進樣分析。流動相A為1%甲酸—水溶液,流動相B為乙腈,梯度洗脫:0～10 min, 5%～10% B;10～15 min, 10%～20% B;15～20 min, 20%～35% B;20～30 min,35%～75% B;30～32 min,75%～95% B。Eclipse Plus C18柱(2.1 mm×50 mm,1.8 μm),檢測波長分別為280,350 nm;柱溫30 ℃;流量0.8 mL/min;進樣量2 μL。15個標準品分別用甲醇溶解,以二倍稀釋法制備不同濃度的標準品溶液,以質量濃度為橫坐標,峰面積為縱坐標繪制標準曲線。

1.3 數據處理

采用SPSS 20.0統計軟件進行數據分析,差異顯著性比較使用Duncan多重比較方法,P<0.05表示差異具有顯著性。

2 結果與分析

2.1 不同溶劑提取趕黃草全草活性成分

2.1.1 總多酚、總黃酮含量 由表2可知,不同溶劑提取趕黃草總多酚、總黃酮含量強弱為80%乙醇=40%乙醇≥100%甲醇>80%甲醇>40%甲醇>水>100%乙醇。80%,40%乙醇提取物中總多酚含量顯著高于其他溶劑提取物。此外,除100%乙醇外,乙醇提取總多酚的效果總體優于甲醇,其中40%,80%乙醇更有利于獲得較高含量的酚類化合物,但乙醇體積分數過高(100%)對酚類物質提取量反而顯著降低。酚類物質在水中的溶解度較低,水提物中總多酚含量最低。研究[17-19]表明,多酚易溶于一定濃度的有機溶劑中,不同體積分數的乙醇溶液提取中藥材中多酚效果優于水提取物。

表2 不同溶劑提取趕黃草全草中總多酚、總黃酮含量及抗氧化活性?

總黃酮與總多酚含量趨勢大致相同,80%乙醇提取物中總黃酮含量最高,水提物的最低。相同溶劑條件下,隨著溶劑極性降低,提取物中總黃酮含量顯著增加,相同濃度下乙醇提取物中的總黃酮量顯著高于甲醇提取物的,一方面可能是由于黃酮類化合物在水中的溶解度低于有機溶劑;另一方面,趕黃草中可能存在大量弱極性黃酮類化合物,極性較低的溶劑容易破壞細胞膜,使其他細胞器中的黃酮類化合物被釋放[20]。

2.1.2 抗氧化活性比較 由表2可知,趕黃草全草的DPPH自由基清除能力為8.97～20.67 mg/g。Ismail等[21]指出DPPH在極性溶劑體系中可以清除更多自由基。與其他溶劑提取物相比,80%乙醇提取物的抗氧化能力最高,水提物的最低,可能與其較高含量的總多酚和總黃酮有關。除100%乙醇外,其他溶劑提取物對DPPH自由基清除能力差異不顯著(P>0.05)。ABTS自由基清除能力與鐵離子還原能力變化趨勢大致相似,80%乙醇提取物的抗氧化活性最高,而100%乙醇提取物的最低。Lu等[22]發現,趕黃草醇提物的DPPH自由基清除能力和氧化還原能力高于水提物的。綜上,除DPPH自由基清除能力外,ABTS自由基清除能力與鐵離子還原能力均為80%乙醇提取物的最高。

2.1.3 15種多酚類化合物含量 由表3和圖1(a)可知,80%乙醇提取物中有7種化合物含量最高,分別為兒茶素(2.03 mg/g)、蘆丁(0.04 mg/g)、喬松素葡萄糖苷(0.86 mg/g)、槲皮素(0.46 mg/g)、山奈酚(0.32 mg/g)、喬松素(1.12 mg/g)以及趕黃草苷A(88.60 mg/g)。40%乙醇提取物中異槲皮苷(0.39 mg/g)含量最高;80%甲醇提取物中山奈酚-3-O-蕓香糖苷(1.18 mg/g)、紫云英苷(1.22 mg/g)和沒食子酰3苯并(13.38 mg/g)含量最高,而水提物中沒食子酸(1.85 mg/g)和原兒茶酸(0.57 mg/g)含量最高。說明不同溶劑對趕黃草中酚類物質的提取差異較大,80%乙醇是較有前景的提取溶劑,與He等[23]的研究結果一致。范玲等[24]研究發現,相比水提物和95%乙醇提取物,趕黃草中70%乙醇提取物對小鼠內毒素性肝損傷具有明顯保護作用。槲皮素在《四川省中藥材標準》中作為趕黃草的指標成分,但其含量<1 mg/g且與趕黃草保肝的臨床療效關聯性較小[25]。

圖1 趕黃草液相圖

表3 不同溶劑提取趕黃草中多酚類化合物?

綜上,結合總多酚、總黃酮、多酚類化合物提取量,80%乙醇提取趕黃草中活性成分具有更強優勢,將作為提取溶劑提取趕黃草不同部位(花、莖、葉)活性成分。

2.2 趕黃草不同部位活性成分比較

2.2.1 總多酚、總黃酮含量 由圖2可知,同一收獲時期的趕黃草花和葉中總多酚、總黃酮含量顯著高于莖,說明趕黃草多酚物質主要存在于葉和花中,與陀揚凌等[9]的結果一致。此外,2022年采收的趕黃草多酚、總黃酮含量順序均為花>葉>莖,隨著貯藏時間的延長,2021年采收的順序則為葉≥花>莖,花和莖中總多酚、總黃酮含量顯著降低,減少了約36%～ 50%,而葉中含量無顯著差異,可能是葉中酚類物質性質較花和莖中更穩定,通常酚類物質性質極其活潑,貯藏過程中極易發生氧化[26]。綜上,多酚物質主要分布在趕黃草花和葉中,但隨著貯藏時間的延長,花和莖中的總多酚、總黃酮含量顯著下降(P<0.05)。

小寫字母不同代表差異顯著(P<0.05)

2.2.2 15種多酚類化合物含量 由表4和圖1(b)可知,除兒茶素、蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷、喬松素葡萄糖苷、槲皮素、沒食子酰3苯并以及喬松素外,7種多酚類化合物含量分布情況均為葉>花>莖,與孫佩等[27]的結果一致。花和葉中含量最高的為趕黃草苷A,其次為沒食子酰3苯并,與Sun等[28]的結果一致。但與Yin等[29]的結論存在差異,可能是由趕黃草品種、產地等因素導致的。喬松素含量在花中較高,僅次于沒食子酰3苯并,在葉和莖中含量較低。趕黃草苷A、喬松素、沒食子酰3苯并以及喬松素葡萄糖苷的藥理作用與趕黃草的藥理作用密切相關,具有保肝護肝活性[3]。槲皮素在花、莖和葉中含量接近,與孫佩等[27]、周瀅等[30]的研究結果不一致。此外,趕黃草中表兒茶素、蘆丁、紫云英苷、槲皮素以及山奈酚在3個部位的含量均<1 mg/g,且各部位的酚類物質含量隨貯藏時間的延長而降低,其中花和莖中酚類物質降低程度最大。

表4 趕黃草不同部位多酚類化合物含量?

2.2.3 抗氧化活性比較 由圖3可知,趕黃草不同部位提取物的DPPH自由基、ABTS自由基清除能力以及鐵離子還原能力均為花>葉>莖。隨著貯藏時間的延長,趕黃草花和葉中DPPH自由基、ABTS自由基清除能力顯著減弱(P<0.05),而葉中鐵離子還原能力也顯著減弱。不同部位的抗氧化活性變化趨勢與總多酚、總黃酮含量變化趨勢一致,表明趕黃草提取物的抗氧化活性與總多酚、總黃酮含量有密切關聯。

小寫字母不同代表差異顯著 (P<0.05)

2.3 相關性分析

由表5可知,兒茶素、山奈酚-3-O-蕓香糖苷、阿福豆苷以及喬松素葡萄糖苷、山奈酚均與總多酚含量呈顯著正相關(P< 0.05)或極顯著正相關(P< 0.01);兒茶素、山奈酚-3-O-蕓香糖苷、阿福豆苷、喬松素葡萄糖苷、山奈酚沒食子酰苯并以及趕黃草苷A與總黃酮含量呈顯著正相關(P< 0.05)或呈極顯著正相關(P< 0.01);而原兒茶酸與總黃酮含量呈顯著負相關(P< 0.05)。DPPH自由基清除能力、鐵離子還原能力與總多酚含量分別呈顯著(P<0.05)或極顯著正相關(P<0.01),DPPH自由基清除能力與兒茶素、異槲皮苷、山奈酚-3-O-蕓香糖苷、阿福豆苷、喬松素葡萄糖苷以及山奈酚分別呈顯著(P<0.05)或極顯著正相關(P<0.01),鐵離子還原能力與兒茶素、異槲皮苷、山奈酚-3-O-蕓香糖苷、阿福豆苷以及喬松素葡萄糖苷分別呈顯著(P<0.05)或極顯著正相關(P<0.01)。Liu等[31]研究表明,酚類化合物中游離羥基是抗氧化活性的主要原因,而游離羥基數量越多抗氧化活性越強,這可能是酚類化合物與抗氧化活性有較強相關性的原因。

表5 趕黃草中總多酚、總黃酮、多酚化合物與抗氧化活性的相關性?

3 結論

研究先利用不同溶劑提取趕黃草全草中活性成分,再對其總多酚、總黃酮、多酚類化合物含量以及抗氧化活性進行比較。結果表明,提取溶劑類型和溶劑濃度對酚類物質提取能力及抗氧化活性有顯著影響。隨著溶劑濃度的增加,趕黃草葉提取物中總多酚、總黃酮含量和抗氧化活性大體上呈先升高后降低的趨勢,且乙醇的提取能力優于甲醇,而80%乙醇提取物中有7種化合物含量最高。綜合比較,80%乙醇提取趕黃草中活性成分具有更強的優勢。總多酚、總黃酮、15種多酚類化合物主要分布于趕黃草花和葉中,且葉中的多酚物質穩定。隨著貯藏時間的延長,總多酚、總黃酮及多酚類化合物含量顯著下降,尤其是花和莖的。后續可以將趕黃草不同部位(花、莖、葉)分開研究和使用,以提高療效和更大程度開發利用川產趕黃草新食品資源。