大米免疫活性肽在小鼠體內的作用機制

文詩雨

張芷萌1

吳 昊1

謝雨菲1

黃慶明2

廖 娟2

文 李1

(1. 長沙理工大學食品與生物工程學院,湖南 長沙 410014;2. 湖南助農米業有限公司,湖南 益陽 413200)

生物活性肽可為機體提供基本營養,還具備多種有益于人體健康的生物學功能,因此可以通過調節和改善生理功能來抑制慢性疾病[1]。來自于食物蛋白的生物活性肽是一類經蛋白酶水解及分離純化后、具有特殊生物活性的多肽,其氨基酸殘基數目不等且相對分子質量一般較小,由2～20個氨基酸組成[2]。研究[3-4]表明,食物源生物活性肽具有顯著高血壓抑制、抗氧化、免疫調節、降血糖血脂、降人體總脂蛋白膽固醇、抗腫瘤、體外抗菌、識別體外免疫異常細胞、抗疲勞、改善提高人體骨代謝和神經活性調節能力等多種功能特性。

中國是水稻種植和消費大國,其中湖南省為水稻種植大省。精白米加工會產生大量副產物——米糠,其中仍含有豐富的營養物質,但在實踐中的利用率極低。國內外對免疫活性肽的研究主要集中在大豆肽和一些動物源肽,而有關植物肽——大米源生物活性肽的報道較少。大米胰蛋白酶解物可從蛋白及mRNA水平抑制RAW264.7細胞的炎癥因子表達,通過阻礙p65入核及ERK的磷酸化,分別影響巨噬細胞的NF-κB及MAPK炎癥通路,從而實現抗炎作用顯示出免疫活性[5-6]。有研究[7]表明,通過計算機預測、網絡藥理學方法可進行免疫活性成分的篩選。將先進的組學技術與生物信息學分析相結合,有望闡明肽在體內的新作用途徑[8]。研究擬在前期以大米源免疫活性肽GBP1細胞試驗研究[5]的基礎上,深入探討GBP1進入小鼠體內后對小鼠體重、血清中細胞因子(IL-2、TNF-α、IFN-γ)、脾細胞增殖數和臟器系數的影響,并對免疫器官胸腺和脾臟的病理切片進行分析;利用RNA-Seq在基因轉錄組水平上分析大米源免疫活性肽GBP1對小鼠機體基因表達水平的影響,以期為大米源免疫活性肽在臨床上的應用提供理論及研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

1.1.1 材料

合成大米肽GBP1:肽序NSVFRALPVDVVANAYR,合肥賽曼諾生物科技有限公司;

免疫低下型SPF級雄性Balb/c小鼠:20只,體重18.6～22.2 g,湖南斯萊克景達實驗動物有限公司。

1.1.2 試劑

0.9%氯化鈉注射液:湖南康源制藥有限公司;

胎牛血清(FBS):浙江天杭生物科技有限公司;

刀豆蛋白A(Con A):分析純,德國默克公司;

噻唑藍(MTT)細胞活力及毒性測試試劑盒:上海碧云天生物技術有限公司;

二甲亞砜:99.8%,北京蘭杰柯科技有限公司;

白細胞介素-2(IL-2)、γ干擾素(IFN-γ)、α腫瘤壞死因子(TNF-α)、免疫球蛋白G(IgG)酶聯免疫試劑盒:江蘇酶免生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

電子天平:ME2002E/02型,梅特勒—托利多儀器有限公司;

生物顯微鏡:B203LED型,重慶奧特光學儀器有限公司;

石蠟切片機:RM2235型,德國Leica公司;

全自動脫水機:TP1020型,德國Leica公司;

攤片機:HI1210型,德國Leica公司;

組織包埋機:EG1150H+C型,德國Leica公司;

病理成像系統:DFC 420C型,德國Leica公司;

壓力蒸汽滅菌器:BKQ-B75L型,山東博科生物產業有限公司;

生物安全柜:BSCIIB2-1101型,山東博科生物產業有限公司;

高速冷凍離心機:Centrifuge 5418R型,德國Eppendorf公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 試驗設計 選取免疫低下型SPF級Balb/c小鼠20只,雌雄各半,體重18.6～22.2 g,根據性別、體重隨機分為4組,分別為GBP1肽灌胃低、中、高劑量組(25,50,100 mg/kg)和對照組,每組5只,對照組灌胃純水,給藥量為20 mL/kg,每天給藥1次,連續給藥21 d。觀察給藥期間是否出現動物死亡,按式(1)計算各組死亡率。解剖取血、脾臟、腸系膜淋巴結、胸腺、肝臟、腎臟,稱重相應臟器并按式(2)計算免疫器官指數。

(1)

(2)

式中:

D——死亡率,%;

C1——每組動物死亡數量,只;

C2——每組動物數量,只;

R1——免疫器官指數,mg/kg;

m1——器官質量,mg;

m2——體重,kg。

1.3.2 GBP1肽對小鼠脾細胞的增殖作用 采用MTT法檢測脾細胞增殖。使用RPMI-1640磨碎脾組織,過200目細胞篩網。使用紅細胞裂解緩沖液清除紅細胞,離心,加入10% FBS至RPMI-1640中,重懸細胞濃度為1×107個/mL。將脾細胞(106個/孔)接種于96孔板上,每孔加入含ConA(12.5 μg/mL)或不含Con A(作為對照)的培養基培養72 h,每孔加入20 μL MTT(5 mg/mL)再培養4 h,棄培養液,每孔加入二甲亞砜,用分光光度計測定570 nm處吸光值,并按式(3)計算刺激增殖指數。

(3)

式中:

R2——脾細胞增殖指數,%;

A1——加入ConA培養后的吸光值;

A0——不含ConA培養后的吸光值。

1.3.3 GBP1肽對小鼠細胞因子釋放及免疫球蛋白分泌情況的影響 末次給藥24 h后取眼球采血,4 ℃、3 000 r/min離心10 min取血清,對血清樣本進行細胞因子分析。在相同稀釋液中制備細胞因子標準品的系列稀釋液,將對照品、標準品和血清樣品添加至ELISA試劑盒孔中,并根據ELISA試劑盒說明書測定IL-2、IFN-γ、TNF-α及免疫球蛋白IgG水平。

1.3.4 GBP1肽對小鼠組織病理的影響 末次給藥2 h后,在深度麻醉下處死每個治療組的一只小鼠。取小鼠的胸腺、脾臟組織,用4%福爾馬林固定24 h,石蠟包埋,采用蘇木精—伊紅對組織切片進行染色,并使用生物顯微鏡觀察。

1.3.5 轉錄組學分析 采用酚/氯仿法,分別從對照組和GBP1肽處理組小鼠的脾臟中提取RNA,在濃度與完整性檢測前對提取的Total RNA按一定比例進行稀釋。利用微量分光光度計檢測RNA純度,Agilent 2100 Bioanalyzer和Agilent RNA 6000 Nano Kit檢測RNA濃度與完整性;基于UHPLC-MS/MS和聯合測序平臺,進行全面轉錄組分析;并委托武漢希望組生物科技有限公司進行測定。

1.3.6 差異表達基因功能富集分析

(1) GO富集:GO的基本單位是term(詞條、節點),富集性分析首先需把所有差異表達基因映射到Gene Ontology數據庫(http://www.geneontology.org/)的各個term上,篩選出與參考基因組相比樣本差異表達基因中顯著富集的GO條目。將閾值Qvalue≤0.05的GO term定義為在差異表達基因中顯著富集的GO term,通過GO功能的顯著富集分析確定差異表達基因所執行的主要生物學功能。

(2) KEGG富集:通過KEGG數據庫可以在基因水平上對生物學上的復雜行為進行深入研究,經多重校驗后,篩選出滿足Qvalue≤0.05條件的Pathway即為在差異表達轉錄本中顯著富集的Pathway。

(3) 數據處理與統計分析:使用SPSS 22.0軟件進行差異顯著性分析和相關性分析,其中*表示有統計學意義(P≤0.05),**表示非常顯著性意義(P≤0.01),結果以平均值±標準偏差表示。采用IBM SPSS Statistics 22、Origin 9.0、Cytoscape軟件進行數據分析及繪圖。

2 結果與討論

2.1 GBP1肽對小鼠的影響

2.1.1 對小鼠機體的影響 體重變化是反映機體健康狀態的一個重要指標,通常免疫力低下都會伴隨著體重下降[9]。由圖1(a)可知,肽處理前,各組小鼠體重隨時間延長不斷增加。經灌胃遞送GBP1肽后,各組小鼠相對體重均上漲。灌胃第7天,肽處理組小鼠體重顯著上升,對小鼠機體有良性影響,因此GBP1肽處理組符合對照組體重增長趨勢,尤其是50 mg/kg肽處理組的體重值出現極顯著增加。

圖1 GBP1肽對小鼠機體的影響

體外培養T細胞時,受到植物血凝素或特異性抗原刺激后,可出現細胞體積增大,代謝旺盛,蛋白和核酸合成增加并能進行分裂,成為淋巴母細胞,因此淋巴細胞增殖率的高低可以反映機體細胞免疫水平,可作為測定機體免疫功能的指標之一,正常脾淋巴細胞增殖區間為3%～5%[10]。由圖1(b)可知,經25,50 mg/kg的GBP1肽處理后,小鼠脾細胞增殖數趨于正常值水平。

免疫器官臟器系數的變化能直接反映機體免疫功能的改變[11],其中脾臟和胸腺是機體內重要的免疫器官,其臟器系數的變化能夠有效反映機體免疫狀態。由圖1(c)可知,與對照組比較,25 mg/kg的GBP1肽處理組小鼠胸腺臟器系數和25,50 mg/kg的GBP1肽處理組的肝臟器系數顯著升高,說明GBP1肽未對脾臟、腎臟組織產生不良影響。

由圖1(d)可知,經肽處理后,小鼠血清中IgG含量穩定,無統計學差異;說明肽處理后機體的體液免疫功能狀態良好,未產生不良影響。

2.1.2 對血清中細胞因子表達量的影響 由圖2可知,25 mg/kg的GBP1肽處理對小鼠機體產生的促炎因子IL-2、IFN-γ和TNF-α均有抑制作用;50 mg/kg的GBP1肽處理組中小鼠機體產生的促炎因子IL-2、IFN-γ和TNF-α有上升趨勢,說明低濃度肽對促炎因子分泌具有良好的抑制作用。

圖2 GBP1肽對小鼠細胞因子分泌的影響

2.1.3 對小鼠胸腺和脾臟組織的影響 小鼠的脾臟、胸腺代表適應性免疫器官,在其中維持了免疫穩態的平衡[12]。由圖3可知,與對照組相比,GBP1肽處理組小鼠的脾臟和胸腺組織切片顯示正常結構,形態清晰,無組織學改變,表明GBP1肽可以提高正常小鼠的免疫力,不會對脾臟、胸腺形態造成損害,且未對胸腺、脾臟組織產生病理影響。

從上至下依次為胸腺、脾臟切片;從左至右依次為對照組、25,50,100 mg/kg GBP1肽處理組

綜上,經25 mg/kg的GBP1肽處理后,可以顯著影響小鼠的臟器指數變化、脾臟細胞增殖及炎癥因子的分泌,且對臟器無損害。因此,進一步對25 mg/kg的GBP1肽處理的小鼠脾臟組織進行轉錄組分析。

2.2 小鼠脾臟組織轉錄組測序分析

2.2.1 過濾后的Reads質量統計 由表1可知,經過濾和比對后,共獲得299 632 082 Raw Reads,293 293 182 Clean Reads。Clean Reads達到了Raw Reads的98%,比對到基因組上的比例均>97%。二代測序要求Q20的堿基比例>95%,Q30的堿基比例>85%;該測序中6個樣品的Q20值均>97%以上,Q30值均>92%,表明每個樣品的堿基正確識別率均>90%。

表1 過濾后的 Reads 質量統計

2.2.2 基因表達水平分析 Reads計數除了與基因的真實表達水平成正比外,還與基因的長度和測序深度呈正相關[13]。每百萬映射讀片段的每千堿基讀數(FPKM)值可以反映出一個基因在RNA樣本中的相對表達水平大小,FPKM在0.10～3.75 可以認為是低豐度表達水平的基因;FPKM 在3.75～15.00為中等豐富度表達水平基因;FPKM>15為高豐富度表達水平基因。利用StringTie[14]軟件對所有基因表達量進行統計,結果見表2。

表2 表達量統計表

依據各樣品的基因表達量繪制主成分分析圖,樣本的表達分布及相關性分析結果如圖4所示。由圖4可知,對照組與GBP1處理組分開,各樣本轉錄組間差異較大,說明GBP1處理改變了脾臟組織的基因表達豐度。

圖4 主成分分析圖

2.2.3 差異表達基因分析 有生物學重復的差異表達基因定義為FoldChange≥2且fdr≤0.05,無生物學重復的差異表達基因定義為FoldChange≥2且fdr≤0.005。由此可得差異基因共780個,其中顯著上調的差異基因741個,顯著下調的差異基因39個。通過兩組轉錄本對比,對基因表達進行層次聚類分析,結果如圖5所示。由圖5可知,經GBP1肽處理后的小鼠脾臟組織中上調基因數高于下調基因數。通過兩組樣本中差異表達基因分析,GBP1肽可明顯促進小鼠脾臟組織中基因的轉錄水平。

圖5 差異基因分析圖

2.3 GO和KEGG富集分析

GO富集包括生物過程(BP)、細胞組分(CC)和分子功能(MF)3部分。由圖6可知,GO分析共富集了219個條目,其中70個與生物過程相關,24個與細胞成分相關,125個與分子功能相關。根據P值<0.01,選取生物過程、細胞成分、分子功能富集結果排名靠前的條目進行可視化處理。GBP1處理脾臟組織的差異基因主要參與微管運動和跨膜轉運等生物過程,存在于血紅蛋白的復合物和質膜等細胞成分,行使微管結合、調節絲氨酸型內肽酶活性和微管運動等分子功能。

a.. 氧氣運輸 a2. 基于微管的運動 a3. 跨膜轉運 a4. DNA復制 a5. DNA修復 a6. 脂蛋白代謝過程 a7. 趨化性 b1. 血紅蛋白復合物 b2. 轉錄調節因子復合物 b3. 微管 b4. 質膜的組成部分 c1. 氧結合 c2. 微管結合 c3. 微管運動活動 c4. 蛋白質同源二聚化活性 c5. 細胞骨架的結構成分 c6. 絲氨酸型內肽酶活性 BP. 生物過程 CC. 細胞組分 MF. 分子功能

KEGG分析共富集了217個信號通路。根據P值<0.01,選取前16條通路進行可視化處理,主要涉及細胞周期、鐵死亡、ECM-受體相互作用、p53信號通路、次生代謝物的生物合成等途徑。這些通路均與免疫、癌癥、細胞凋亡等息息相關。其中p53信號通路是一個重要的細胞生存和死亡調控通路,p53是所有癌癥中最常見的突變蛋白。研究[15]認為,活性p53在腫瘤抑制方面具有重要作用。p53信號通路中所富集到的10個基因均上調,其中表達量最高的基因為Rrm2,該基因編碼核糖核苷酸還原酶,參與核苷酸代謝并催化核苷酸轉化為脫氧核苷酸,且該基因與耐藥性、調節細胞死亡和腫瘤免疫有關[16];另一個表達量較高的基因為細胞周期蛋白B2(Ccnb2),該基因是細胞周期蛋白通路的重要組成部分,在癌癥的發生發展中起關鍵作用[17];鐵死亡通路是一種細胞死亡形式,具有直接殺死癌細胞的能力,并具有潛在的抗腫瘤作用,隨著免疫細胞在腫瘤微環境(TME)中的作用不斷增強,鐵死亡可能對免疫細胞產生額外的影響[18]。鐵死亡信號通路中所富集到的8個基因均上調,其中表達量最高的基因為Tfrc,該基因編碼轉鐵蛋白受體,該受體表達廣泛分布于免疫系統、造血系統(如骨髓干細胞、紅細胞和白細胞)、神經系統(如神經元和神經膠質細胞)等[19]。補體和凝血級聯是由具有相似結構特征的絲氨酸蛋白酶組成的共同祖先途徑衍生的兩個進化級聯反應,具有綜合和高度復雜的功能,它們將彼此交織在機體的全過程中,從而達到機體的止血作用和免疫防御作用[20]。補血和凝體級聯通路中所富集到的11個基因均上調,其中表達量最高的為Itgam,該基因編碼整合素αM鏈,整合素 ITGAM/ITGB2 與單核細胞、巨噬細胞和粒細胞的各種黏附相互作用以及介導補體包被顆粒和病原體的攝取有關[21]。

2.4 GBP1肽對脾臟組織轉錄組信號通路及差異基因表達分析

選擇KEGG富集分析中免疫調節相關通路前8條進行分析。由表3可知,細胞周期通路相關的差異基因為20個,與鐵死亡通路相關的差異基因為8個,ECM-受體相互作用通路相關的差異基因為11個,次生代謝物的生物合成通路相關的差異基因為32個,p53信號通路相關的差異基因為10個,補體和凝血級聯反應通路相關的差異基因為11個,谷胱甘肽代謝通路相關的差異基因為9個,細胞衰老通路相關的差異基因為15個。

表3 差異基因與免疫調節相關的KEGG途徑

結合GO和KEGG富集結果,與免疫調節密切相關的有鐵死亡通路、p53信號通路、補體和凝血級聯反應3條通路,包含相關的差異基因有28個(表4),且均為上調基因。

表4 脾臟組織的差異基因及差異表達水平分析

2.5 差異基因互作網絡分析

利用String網站分析得到總的差異基因的互作網絡,如圖7所示。為明確與免疫調節相關通路的關鍵基因,選擇KEGG富集分析中免疫調節相關通路前8條及其相關基因導入Cytoscape軟件,分析得到關鍵基因互作網絡圖。

圖7 免疫相關關鍵基因互作網絡圖

通過比較介數中心度(betweenness centrality),篩選出與免疫調節相關的基因包括Rrm2、Thbs1、Tfrc、Itgam、Ccnb1、Cdk1等。Thbs1基因編碼血小板凝血酶蛋白-1,其是近年來腫瘤領域研究的熱門靶點基因[22];Ccnb1基因編碼細胞周期蛋白B1,該基因編碼周期蛋白依賴性激酶1,且Ccnb1、Cdk1和Ccnb2與肝癌細胞的免疫浸潤相關[21]。這些關鍵基因,均與腫瘤、癌癥、炎癥等免疫調節有關。

3 結論

研究考察了大米源免疫活性肽GBP1肽小鼠機體發揮的免疫調節作用,并從轉錄組水平分析了免疫活性肽對小鼠發揮免疫調節作用的機制。結果表明,大米源免疫活性肽GBP1肽處理后的小鼠體重整體呈上升趨勢,25 mg/kg的GBP1肽處理組小鼠肝臟器系數升高,50 mg/kg的GBP1肽處理組小鼠胸腺、肝臟器系數升高,低濃度肽組對促炎因子分泌具有良好的抑制作用,肽處理組脾淋巴細胞體外增殖能力無明顯變化,免疫球蛋白IgG水平無統計學差異。經GO功能富集和KEGG通路富集,發現GBP1肽與p53信號通路、鐵死亡、補體和凝血級聯等免疫調節通路相關;通過分析免疫相關通路的基因表達量以及構建關鍵基因互作網絡,預測與腫瘤、癌癥、免疫調節等相關的關鍵基因包括Rrm2、Ccnb2、Thbs1、Tfrc、Itgam、Ccnb1和Cdk1等。研究主要考察了免疫活性肽GBP1肽小鼠機體發揮免疫調節作用,從轉錄組水平出發分析了免疫活性肽對在小鼠發揮免疫調節作用的機制,這為未來更進一步研究GBP1肽的免疫活性及作用機制提供了相關的研究路線。后續可對GBP1肽進行人群試驗以探討其在人體內的作用機制。