同位素內(nèi)標(biāo)法—超高效液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜法測定六堡茶中苦參堿和氧化苦參堿殘留量

石金娥

張洪禹3

辛若竹4

丁 梅4

奚廣生1,2

(1. 梧州學(xué)院食品與制藥工程學(xué)院,廣西 梧州 543002;2. 梧州學(xué)院六堡茶現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)學(xué)院,廣西 梧州 543002;3. 梧州學(xué)院體育健康學(xué)院,廣西 梧州 543002;4. 梅河口市食品藥品檢驗檢測中心,吉林 梅河口 135000)

六堡茶為黑茶的一種,以“紅、濃、陳、醇”著稱。與其他茶樹一樣,六堡茶茶樹每年也會受小綠葉蟬、茶尺蠖、茶毛蟲、茶麗紋象甲等蟲害的侵襲[1-3]。茶園中常用苦參堿、印楝素、魚藤酮、藜蘆堿等植物源農(nóng)藥防治小綠葉蟬、茶尺蠖等蟲害[4-7],植物源農(nóng)藥已成為茶園病蟲害綠色防控的新趨勢[8-10]。其中苦參堿和氧化苦參堿屬于喹諾里西啶類生物堿,為高效、廣譜植物源殺蟲劑[11],聯(lián)合使用更具速效和持久毒殺效果[12-15]。但一定劑量的苦參堿和氧化苦參堿會導(dǎo)致神經(jīng)、肝損傷等[16]。

GB/T 19630—2019中有機(jī)產(chǎn)品可以施用苦參堿和氧化苦參堿等植物源農(nóng)藥,但GB 2763—2021中卻未對茶葉中苦參堿和氧化苦參堿的施用殘留量及檢測方法做出任何規(guī)定。目前,有關(guān)苦參堿檢測的研究較多,而氧化苦參堿的研究卻鮮見報道[17],主要涉及的檢測技術(shù)有GC技術(shù)[18]、LC技術(shù)[19]、GC/MS技術(shù)[20-21]、HPLC-MS/MS技術(shù)等[22-23],多采用外標(biāo)法或基質(zhì)外標(biāo)法為主要定量方法,且多數(shù)方法回收率不高[24-26]。

研究擬結(jié)合苦參堿和氧化苦參堿的性質(zhì),通過優(yōu)化色、質(zhì)譜條件及樣品前處理過程,采用同位素內(nèi)標(biāo)法定量,建立UPLC-MS/MS法測定六堡茶中苦參堿和氧化苦參堿殘留量的測定方法,為茶葉中苦參堿和氧化苦參堿殘留量檢測以及風(fēng)險評估提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

甲醇、甲酸、乙腈、甲酸銨:色譜純,美國MREDA公司;

濃氨水、無水硫酸鈉:化學(xué)純,北京化工廠;

QEChERS提取鹽 (1.5 g NaAc,6 g MgSO4)、QuEChERS凈化管1(15.1 mg GCB,147.7 mg PSA,887.2 mg MgSO4)、QuEChERS凈化管2(200 mg GCB,400 mg C18,400 mg PSA,1 200 mg MgSO4):美國Agilent公司;

0.2 μm濾膜:美國Pall公司;

苦參堿、氧化苦參堿標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì):純度≥98.9%,美國 Cerilliant 公司;

苦參堿-D3、氧化苦參堿-D3:純度≥98%,加拿大Trc公司;

六堡茶樣品:不同年份、不同季節(jié)的六堡茶16批次(2012年春茶、2012年秋茶、2012年老樹茶、2014年夏茶、2014年秋茶、2016年社前茶、2016年明前茶、2018年春茶、2018年秋茶、2020年春茶、2020年秋茶、2020年老茶婆、2020年金花茶、2022年春茶、2022年秋茶、2022年老茶婆),市售。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜儀:TSQ Endura型,美國 Thermo Fisher公司;

渦旋混合器:IKA型,歐萊博科學(xué)儀器有限公司;

超聲波清洗器:DQ-110E型,瑞萊博科技有限公司;

離心機(jī):Allegra 64 型,美國Beckman公司;

氮吹儀:TTL-DC型,聯(lián)泰科技發(fā)展有限公司。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

(1) 標(biāo)準(zhǔn)儲備液:以甲醇為溶劑分別配制苦參堿、氧化苦參堿、苦參堿-D3、氧化苦參堿-D3標(biāo)準(zhǔn)儲備液(1 mg/mL),于-18 ℃避光保存。

(2) 混合標(biāo)準(zhǔn)使用液:取苦參堿和氧化苦參堿標(biāo)準(zhǔn)儲備液,用50%的甲醇溶液(含0.1%甲酸)配制,得到質(zhì)量濃度分別為10,100 μg/L的苦參堿和氧化苦參堿混合標(biāo)準(zhǔn)使用液。

(3) 內(nèi)標(biāo)使用液:取苦參堿-D3和氧化苦參堿-D3標(biāo)準(zhǔn)儲備液,用50%甲醇溶液(含0.1%甲酸)配制,得到苦參堿-D3質(zhì)量濃度為10 μg/mL,氧化苦參堿-D3質(zhì)量濃度為1 μg/mL。

(4) 混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液:分別吸取10 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)使用液10,50,100 μL及100 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)使用液50,100,200,500,800 μL于樣品瓶中,加內(nèi)標(biāo)使用液10 μL,用含0.1%甲酸的甲醇溶液(V甲酸∶V甲醇為1∶1)定容至1.0 mL,混勻。配制的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液質(zhì)量濃度分別為0.1,0.5,1.0,5.0,10.0,20.0,50.0,80.0 μg/L。其中苦參堿-D3質(zhì)量濃度為100 μg/L,氧化苦參堿-D3質(zhì)量濃度為10 μg/L。

1.2.2 樣品前處理 稱取0.5 g(精確至0.01 g)試樣于50 mL玻璃離心管中,加入50 μL內(nèi)標(biāo)混合使用液,加入10 mL含0.2%氨水的乙腈水溶液(V氨水∶V乙腈為4∶1),渦旋60 s,超聲10 min,加入5 g無水Na2SO4,再次渦旋2 min,離心5 min(9 500 r/min,4 ℃)。吸取5.0 mL上清液于QuEChERS凈化管1中,渦旋2 min,離心5 min(5 000 r/min,4 ℃)。將2.00 mL上述液體轉(zhuǎn)移至另一支10 mL玻璃離心管中,氮吹近干(40 ℃水浴),加入1.0 mL含0.1%甲酸的50%甲醇溶液溶解殘渣,渦旋1 min,過0.22 μm濾膜,上機(jī)測定。

1.2.3 液相色譜條件 色譜柱為Kinetex?2.6 μm Biphenyl 100 ?(100 mm×3.0 mm)或等效柱;柱溫35 ℃;流動相A泵為水相 (0.1%甲酸),B泵為甲醇相 (0.1%甲酸),流速0.35 mL/min;進(jìn)樣量5 μL;洗脫程序見表1。

表1 流動相配比及洗脫條件

1.2.4 質(zhì)譜條件 電離方式為電噴霧離子源正離子模式,多反應(yīng)監(jiān)測模式采集;電噴霧電壓5 500 V;氣簾氣壓力207 kPa;輔助氣壓力483 kPa;霧化氣壓力345 kPa;離子源溫度500 ℃;碰撞氣6 mL/min;離子對、保留時間等參數(shù)見表2。

表2 去簇電壓、離子對及碰撞能量值?

1.2.5 線性范圍測定 按優(yōu)化后的參數(shù)和條件對標(biāo)準(zhǔn)工作液系列進(jìn)行測定,以苦參堿標(biāo)準(zhǔn)溶液中待測組分峰面積與相應(yīng)氧化苦參堿內(nèi)標(biāo)物峰面積的比值為縱坐標(biāo),苦參堿標(biāo)準(zhǔn)溶液中待測組分濃度與相應(yīng)氧化苦參堿內(nèi)標(biāo)物濃度的比值為橫坐標(biāo),繪制內(nèi)標(biāo)—校準(zhǔn)工作曲線。

1.2.6 定量限及檢出限測定 向基質(zhì)中添加一定濃度的目標(biāo)物及內(nèi)標(biāo)物,以3倍信噪比(S/N=3)對應(yīng)的目標(biāo)物濃度計算檢出限,以10倍信噪比(S/N=10)對應(yīng)的目標(biāo)物濃度計算定量限。

1.2.7 回收率和精密度測定 向基質(zhì)中定量添加目標(biāo)物及內(nèi)標(biāo)物,按建立的方法測定6次,并計算方法回收率和精密度。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理條件優(yōu)化

2.1.1 提取溶劑選擇 因苦參堿和氧化苦參堿為堿性水溶性化合物[23],考慮茶葉基質(zhì)(含鞣酸等酸性物質(zhì))的特殊性,僅對中性和堿性提取體系進(jìn)行考察。分別對水復(fù)溶+1%氨水乙腈提取、水復(fù)溶+含0.2%氨水的乙腈水溶液(V氨水∶V乙腈為4∶1)提取和直接用含0.2%氨水的乙腈水溶液(V氨水∶V乙腈為4∶1)提取3種方式進(jìn)行回收率考察。試驗發(fā)現(xiàn),直接用80%乙腈水溶液(含0.2%氨水)對茶葉樣品進(jìn)行提取的回收率最高,可能是水的前期參與會使茶葉溶出大量的酸性物質(zhì),這些酸性物質(zhì)會與苦參堿發(fā)生反應(yīng)[25],導(dǎo)致回收率較低;但直接用80%乙腈水溶液(含0.2%氨水)提取時,因過量的氨水可以中和茶葉基質(zhì)中的酸性物質(zhì),保護(hù)了苦參堿,從而有利于提取效率的提升。當(dāng)直接用80%乙腈水溶液(含0.2%氨水)提取時,苦參堿回收率為93.8%～103.7%,氧化苦參堿回收率為92.0%～104.7%,結(jié)果均滿意。

2.1.2 凈化方法優(yōu)化 分別選用無水硫酸鈉和QuEChERS鹽為提取鹽,用80%乙腈水溶液(含0.2%氨水)對加標(biāo)樣品進(jìn)行提取,選擇QuEChERS凈化管1、QuEChERS凈化管2進(jìn)行凈化,考察凈化方式對回收率的影響。由表3可知,當(dāng)以無水硫酸鈉為提取鹽QuEChERS凈化管1凈化時,苦參堿和氧化苦參堿的回收率較好,其余組合回收率均較低,可能是QuEChERS凈化管2中大量的石墨化炭黑(GCB)對苦參堿和氧化苦參堿有較強(qiáng)的吸附[24],導(dǎo)致苦參堿和氧化苦參堿的回收率偏低。

表3 凈化方法對回收率的影響

2.2 儀器條件優(yōu)化

2.2.1 色譜條件優(yōu)化 分別以0.1%甲酸水—甲醇、0.1%甲酸水—0.1%甲酸—甲醇、0.1%甲酸水—0.1%甲酸—乙腈、5 mmol/L甲酸銨溶液(含0.1%甲酸)—0.1%甲酸—甲醇為流動相,考察不同配比的流動相對目標(biāo)物的洗脫效果,結(jié)果見表4。由表4可知,以甲醇為主體的流動相使得苦參堿和氧化苦參堿的響應(yīng)值和分離效果均較好,且甲酸濃度增加后,響應(yīng)效果更顯著;甲酸銨的存在同樣能得到較高的響應(yīng)值和較好的分離效果,但從配制便捷的角度考慮,優(yōu)先選擇0.1%甲酸水—0.1%甲酸—甲醇為流動相。

表4 流動相對苦參堿和氧化苦參堿響應(yīng)值的影響

2.2.2 質(zhì)譜條件優(yōu)化 按試驗條件進(jìn)樣分析,進(jìn)一步驗證所選離子對的響應(yīng)值和穩(wěn)定性,最終確定了4種目標(biāo)物的離子對,苦參堿和氧化苦參堿及內(nèi)標(biāo)物溶液的MRM色譜圖如圖1所示。

圖1 苦參堿、氧化苦參堿及內(nèi)標(biāo)物的MRM色譜圖

2.3 方法的校準(zhǔn)曲線和檢出限

由表5可知,苦參堿和氧化苦參堿在0.1～80.0 ng/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)均>0.999 6。以3倍信噪比(S/N=3)對應(yīng)的加標(biāo)量為檢出限,10倍信噪比(以S/N=10)對應(yīng)的加標(biāo)量為定量限,測得苦參堿和氧化苦參堿的檢出限均為1.0 μg/kg,定量限均為3.0 μg/kg。

表5 校準(zhǔn)曲線及線性范圍

2.4 方法的精密度和加標(biāo)回收率

茶葉樣品按5個濃度水平加標(biāo),分別測定6次,其回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差見表6。由表6可知,苦參堿的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.7%～4.8%,回收率為93.8%～103.7%;氧化苦參堿的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.1%～5.3%,回收率為92.0%～104.7%;均滿足GB/T 27404—2008的要求,說明試驗方法準(zhǔn)確可靠。

表6 精密度及回收率結(jié)果

2.5 樣品測試

對采購的16種不同年份、不同季節(jié)的六堡茶進(jìn)行測定,結(jié)果顯示,苦參堿和氧化苦參堿均未檢出,說明在苦參堿和氧化苦參堿類生物類農(nóng)藥考察中,六堡茶具有較高的安全性。

3 結(jié)論

通過對色譜、質(zhì)譜條件及樣品前處理過程的不斷優(yōu)化,建立了一種內(nèi)標(biāo)法測定六堡茶中苦參堿和氧化苦參堿殘留量的方法。該方法縮短了茶葉中苦參堿和氧化苦參堿的前處理周期,提高了檢測效率,且該方法具有良好的線性范圍和較高的回收率,靈敏度、準(zhǔn)確度、精密度均滿足GB/T 27404—2008要求。對市售六堡茶進(jìn)行摸底,結(jié)果顯示六堡茶中均未檢出苦參堿和氧化苦參堿。后續(xù)將以六大茶類為研究對象,確認(rèn)該方法在六大茶類中的適用性,同時對市售六大茶類在施用苦參堿和氧化苦參堿殺蟲劑的安全性進(jìn)行考察,以期該方法有更廣泛的適用性。