低頻重復經顱磁刺激對BTBR T+ Itpr3tf/J小鼠孤獨癥樣行為的影響☆

王心怡 蔡玉龍 李燕娜 袁琳瑛 花艷凡 李蕓子 藍文雅 劉新峰

孤獨癥譜系障礙（autism spectrum disorder，ASD）的核心癥狀是社交缺陷及刻板行為[1]，其發病機制尚不清楚，通常認為與遺傳和環境因素有關[2]，且臨床尚無針對核心癥狀的治療方法[3]。近年來，重復經顱磁刺激（repetitive transcranial magnetic stimulation，rTMS）成為神經精神疾病的研究熱點[4-6]，rTMS 對抑郁癥和強迫癥有很好的療效，但在ASD 中的應用尚未取得確切證據。由于ASD 的發病機制不明、癥狀的異質性較大[7]及磁刺激方案復雜多樣，目前開展的rTMS 治療ASD 臨床研究雖觀察到一些行為和電生理結果的改善[8]，但尚未得出安全性及有效性的一致結論[9-10]，而相關基礎研究較少且尚未闡明磁刺激對ASD 療效的具體機制[11-12]。因此本研究結合臨床研究選取的刺激方案，著眼于ASD 的核心癥狀，用低頻rTMS 治療BTBRT+Itpr3tf/J（BTBR）ASD 模型鼠，試圖探究其治療效果及作用機制。

1 對象與方法

1.1 實驗動物 所有實驗經金陵醫院動物護理委員會批準。本研究選用的雄性BTBR小鼠和雄性B6小鼠購自南京大學模式動物研究所。BTBR小鼠隨機分配至孤獨癥模型+1 Hz rTMS治療組（BTBR+1 Hz組）和BTBR 組，B6 小鼠隨機分配至B6+1 Hz 組和對照組（B6 組），每組7 只。動物在受控環境條件下飼養，12 h光/暗的循環，提供足量的食物和水。

1.2 低頻重復經顱磁刺激 使用丹麥MagVenture公司的MagPro X100 刺激器及配套120 mm圓形線圈。靜息運動閾值（resting motor threshold, RMT）為在10個刺激中至少5個刺激可以誘發目標肌肉超過50 μV運動誘發電位的最小刺激強度。BTBR+1 Hz 組和B6+1 Hz組刺激強度采用90% RMT，頻率為1 Hz。每天15個序列，每個序列包含30個刺激，序列間隔20 s，共450個刺激。BTBR組和B6組進行假刺激。磁刺激治療在小鼠6 周大時開始，每天1 次，連續5 d，休息2 d，再治療5 d，總計在12 d內刺激10 d。用50 mL離心管制作約束裝置固定小鼠[13]。治療前1天將小鼠放入約束裝置3次，每次5 min。假刺激組的治療與刺激組同時進行，使用同樣大小但未插電的線圈，以保證和刺激組相比接受了除磁刺激以外相同的刺激。

1.3 行為學測試 治療結束后次日開始行為學實驗，各項行為學實驗間隔3 d，以防止前一個實驗的影響。測試當天至少提前1 h讓小鼠適應環境。每只小鼠測試結束，用75%乙醇清洗裝置并等待至少5 min使氣味消散。

1.3.1 三箱社交實驗 采用三箱社交實驗評估小鼠社交能力[14]。實驗箱采用具有3個等大腔室的裝置（60 cm × 40 cm × 22 cm），相鄰腔室間有允許小鼠通過的小門。實驗包括3個階段，每階段10 min：習慣化階段，將小鼠放入中間腔室，允許其自由探索3個腔室；社交偏好測試，將1 只陌生小鼠（同品系，同性別，同年齡）放在側室中，另一側室內放置新物體，允許其再次探索；社交新奇偏好測試，將新物體替換成另1 只陌生小鼠，讓其再次探索。使用ANYmaze 7.08計算小鼠在每個側室中花費的時間。小鼠處在陌生小鼠側室的時間比新物體或熟悉小鼠的側室時間長，表明小鼠具有正常的社交偏好。

1.3.2 理毛實驗、埋珠實驗 采用理毛及埋珠實驗評估小鼠刻板行為[14]。理毛實驗是將受試小鼠放入干凈無墊料的透明籠子中，攝像機放置在離籠子至少15 cm 處錄像20 min，統計后10 min 的理毛時間。理毛時間的長短反映刻板行為的多少。埋珠實驗是在籠子中放置5 cm 厚的碎玉米芯墊料，將20 個大理石珠按照5×4 的排列方式均勻放置在墊料上。將受試小鼠輕放籠中。30 min 后，計算覆蓋超過50%的大理石珠的數量。埋珠數量越多，表明小鼠刻板行為越多。

1.3.3 曠場實驗 曠場實驗評估小鼠運動能力及焦慮水平[14]。將小鼠置于灰色亞克力裝置（50 cm×50 cm×40 cm）中心，允許小鼠自由活動5 min。使用ANYmaze 7.08評估運動總距離、進入中央區的次數和在中央區花費的時間。運動總距離的多少反映小鼠運動能力的好壞。小鼠進入中央區的次數和在中央區花費的時間減少提示存在焦慮。

1.3.4 懸尾實驗、強迫游泳實驗 采用懸尾及強迫游泳實驗評估小鼠抑郁水平。懸尾實驗固定小鼠尾部后三分之一處使小鼠懸掛，鼻尖距桌面約15 cm，如果攀爬尾巴，則該小鼠剔除。強迫游泳實驗將小鼠放在裝有20 cm深溫水的圓桶（高25 cm，直徑10 cm）中。記錄小鼠6 min的活動，統計后4 min內的不動時間。小鼠的不動時間較長提示存在抑郁。

1.4 炎癥因子檢測 使用酶聯免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）檢測皮質及海馬中白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、白介素-6（interleukin-6，IL-6）、白介素-18（interleukin-18，IL-18）、白介素-23（interleukin-23，IL-23）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）水平。麻醉小鼠后灌注0.9%生理鹽水，取腦分離皮質及海馬。組織勻漿取上清液，使用武漢華美生物工程有限公司（IL-1β：CSB-E08054m，IL-18：CSB-E04609m，IL-23：CSB-E08463m，TNF-α：CSB-E04741m，IFN-γ：CSB-E04578m）和abcam（IL-6：ab100713）試劑盒，加入生物素標記的抗體工作液，37 ℃溫育1 h，洗板，加辣根過氧化物酶標記親和素工作液，37 ℃溫育1 h，洗板，加底物37 ℃避光顯色，加終止液，用酶標儀測定450 nm處OD值。

1.5 統計學方法 使用Graphpad Prism 9.3.1 進行統計分析。所有數據以±s描述。三箱社交實驗采用配對t檢驗[15]對兩側室時間進行組內比較。其余實驗結果采用雙因素（模型因素和rTMS 治療因素）方差分析法進行組間比較[16]，并使用Tukey 法進行事后檢驗。檢驗水準α=0.05，雙側檢驗。

2 結果

2.1 三箱社交實驗 習慣化階段，各組小鼠在兩個側室的時間無統計學差異（P＞0.05）。社交偏好測試中，BTBR+1 Hz組（t=3.167，P=0.019）、B6+1 Hz組（t=3.247，P=0.018）和B6 組（t=2.800，P=0.031）處在陌生小鼠側室時間較新物體側室時間更長且差異有統計學意義，BTBR 組處在兩側室時間差異無統計學意義（t=0.645，P=0.543）。社交新奇偏好測試中，BTBR+1 Hz 組（t=3.521，P=0.013）、B6+1 Hz 組（t=2.550，P=0.044）和B6組（t=3.230，P=0.018）偏好陌生小鼠側室，BTBR 組（t=0.678，P=0.523）對陌生小鼠側室無偏好。見圖1、表1。

Tab.1 Time in each chamber during the three-chambered social approach task表1 三箱社交實驗小鼠處在各腔室時間

Fig.1 Representative heat map of the three-chambered social approach task圖1 三箱社交實驗代表性熱圖 A.社交偏好測試；B.社交新奇偏好測試。顏色越紅表明停留時間越長。

2.2 理毛、埋珠、曠場、懸尾、強迫游泳實驗 理毛實驗中，模型因素（F=9.865，P=0.004）、治療因素（F=8.623，P=0.007）和交互作用（F=10.040，P=0.004）均有統計學意義；BTBR 組小鼠較B6組小鼠理毛時間延長（P＜0.001），BTBR+1 Hz 組小鼠理毛時間較BTBR組小鼠減少（P=0.001）。見表2。

Tab.2 Results of self-grooming, marble burying, open field, tail suspension, and forced swimming tests表2 理毛、埋珠、曠場、懸尾、強迫游泳實驗結果

埋珠實驗中，埋珠個數模型因素（F=86.230，P＜0.001）有統計學意義，而治療因素（F=0.383，P=0.542）和交互作用（F=0.862，P=0.362）無統計學意義。見表2。

曠場實驗中，運動總距離的模型因素（F=0.113，P=0.739）、治療因素（F=0.098，P=0.757）和交互作用（F＜0.001，P=0.995）均無統計學意義。小鼠進入中央區次數的模型因素（F=5.019，P=0.035）有統計學意義，治療因素（F=0.645，P=0.430）和交互作用（F=0.002，P=0.967）無統計學意義。中央區總時間的模型因素（F=12.850，P=0.002）有統計學意義，治療因素（F=0.079，P=0.781）和交互作用（F=0.366，P=0.551）無統計學意義。見表2。

懸尾實驗中，不動時間的模型因素（F=0.401，P=0.533）、治療因素（F=0.625，P=0.437）和交互作用（F=0.425，P=0.521）均無統計學意義。強迫游泳實驗中，不動時間的模型因素（F=0.182，P=0.674）、治療因素（F=0.950，P=0.340）和交互作用（F=0.042，P=0.840）均無統計學意義。見表2。

2.3 皮質及海馬的炎癥因子 小鼠皮質中，IL-1β的模型因素（F=10.400，P=0.004）、治療因素（F=34.380，P＜0.001）和交互作用（F=8.459，P=0.008）均有統計學意義。IL-6 的模型因素（F=1.680，P=0.207）、治療因素（F=1.263，P=0.272）和交互作用（F=1.072，P=0.311）均無統計學意義。IL-18 的模型因素（F=11.900，P=0.002）、治療因素（F=40.470，P＜0.001）和交互作用（F=6.518，P=0.018）均有統計學意義。IL-23 的模型因素（F=1.810，P=0.191）無統計學意義，治療因素（F=13.730，P=0.001）有統計學意義，交互作用（F=0.501，P=0.486）無統計學意義。TNF-α 的模型因素（F=2.746，P=0.111）無統計學意義，治療因素（F=4.967，P=0.036）和交互作用（F=7.243，P=0.013）有統計學意義。IFN-γ 的模型因素（F=1.839，P=0.188）無統計學意義，治療因素（F=8.748，P=0.007）有統計學意義，交互作用（F=2.622，P=0.119）無統計學意義。事后分析顯示，BTBR 組小鼠IL-1β（P=0.001）、IL-18（P=0.002）、TNF-α（P=0.025）較B6 組小鼠升高有統計學意義。rTMS 治療后，BTBR+1 Hz 組小鼠皮質IL-1β（P＜0.001）、IL-18（P＜0.001）和TNF-α（P=0.010）較BTBR組小鼠降低有統計學意義。見表3。

Tab.3 ELISA results for cortical and hippocampal cytokines表3 皮質、海馬炎癥因子ELISA結果

小鼠海馬中，IL-1β 的模型因素（F=4.404，P=0.047）、治療因素（F=33.660，P＜0.001）和交互作用（F=15.600，P＜0.001）均有統計學意義。IL-6 的模型因素（F=8.325，P=0.008）、治療因素（F=23.530，P＜0.001）和交互作用（F=7.213，P=0.013）均有統計學意義。IL-18 的模型因素（F=0.820，P=0.374）無統計學意義，治療因素（F=40.780，P＜0.001）和交互作用（F=16.600，P＜0.001）有統計學意義。IL-23 的模型因素（F=1.011，P=0.325）無統計學意義，治療因素（F=20.400，P＜0.001）有統計學意義，交互作用（F=3.837，P=0.062）無統計學意義。TNF-α 的模型因素（F=11.020，P=0.003）、治療因素（F=8.846，P=0.007）和交互作用（F=10.530，P=0.003）均存在統計學意義。IFN-γ 的模型因素（F=13.770，P=0.001）、治療因素（F=5.753，P=0.025）和交互作用（F=13.190，P=0.001）均有統計學意義。事后分析顯示BTBR 組小鼠IL-1β（P=0.001）、IL-6（P=0.003）、IL-18（P=0.009）、TNF-α（P＜0.001）和IFN-γ（P＜0.001）水平較B6組小鼠升高；rTMS治療后，BTBR+1 Hz組小鼠IL-1β（P＜0.001）、IL-6（P＜0.001）、IL-18（P＜0.001）、TNF-α（P=0.001）和IFN-γ（P=0.001）較BTBR組小鼠降低。見表3。

3 討論

ASD 影響著全球約1%的兒童，但FDA 尚未批準任何針對其核心癥狀的干預措施。基于既往研究，本研究使用低頻重復經顱磁刺激治療BTBR ASD 模型鼠，探究其療效及可能機制。使用三箱社交實驗評估社交能力，結果表明具有正常行為學表型的B6組小鼠表現出社交偏好，而BTBR組小鼠表現出社交缺陷，rTMS 治療后，BTBR+1 Hz 組小鼠的社交缺陷改善。使用理毛和埋珠實驗評估刻板行為：理毛實驗顯示BTBR組小鼠刻板行為較B6組小鼠增加，rTMS治療顯著改善了BTBR 組小鼠的理毛時間；埋珠實驗顯示BTBR小鼠埋珠數量較B6小鼠多，而1 Hz rTMS 不影響小鼠埋珠數量。該結果表明1 Hz rTMS 可以調控BTBR 小鼠特定類型的刻板行為[17-18]。

為避免運動能力、焦慮水平對孤獨癥核心癥狀的行為學影響，使用曠場實驗進一步評估各組小鼠狀態。曠場實驗發現各組小鼠運動能力相仿，而BTBR 小鼠較B6 小鼠進入中央區的次數多且處在中央區的時間長，表明BTBR 小鼠具有更低的焦慮水平，這與既往的研究結果相吻合[19]。1 Hz rTMS不影響小鼠的運動能力及焦慮水平。為了檢測抑郁樣行為，本研究采用懸尾和強迫游泳實驗，結果顯示1 Hz rTMS 對各組小鼠抑郁樣行為沒有顯著影響。

既往研究認為皮質[20-21]和海馬[22-23]的炎癥參與ASD 的發生發展過程[24-26]，ASD 的發病也與妊娠期母體的急慢性炎癥相關[27]。已有研究發現，ASD 患者腦脊液中IL-6 和TNF-α 等炎癥因子增加[24]，而高濃度的炎癥因子可通過降低長時程增強作用損害突觸可塑性[28]，同時小膠質細胞活化會釋放更多的IL-6、TNF-α 等炎癥因子[29]。而rTMS 可以直接影響皮質及海馬的炎癥反應[4,30-31]，這可能是通過TNF-α 減少實現的[28,32]，同時rTMS 可以通過調節小膠質細胞功能進而影響突觸可塑性及炎癥因子水平的變化[33-34]。本研究發現BTBR 組小鼠皮質中IL-1β、IL-18、TNF-α和海馬中IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α 和IFN-γ 表達較B6 組小鼠明顯升高，而BTBR+1 Hz 組小鼠皮質IL-1β、IL-18 和TNF-α 及海馬中IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α 和IFN-γ的水平較BTBR組顯著降低。此外，1 Hz rTMS顯著降低小鼠皮質IL-23、IFN-γ及海馬IL-23水平。這些結果提示，1 Hz rTMS 可能是通過抑制腦內炎癥水平，進而發揮治療BTBR ASD模型鼠的作用。

綜上所述，本研究發現1 Hz rTMS 能顯著降低BTBR 小鼠皮質IL-1β、IL-18、IL-23、TNF-α 和IFN-γ 及海馬中IL-1β、IL-6、IL-18、IL-23、TNF-α和IFN-γ 的炎癥因子水平，進而改善BTBR ASD 模型鼠的社交缺陷及刻板行為，且對運動能力和焦慮抑郁水平沒有影響。這提示rTMS 可能通過抑制炎癥水平，發揮治療ASD的作用，為rTMS治療ASD的應用提供了一定理論基礎，但是其具體的作用機制仍需進一步探討。