雷帕霉素核殼型pH敏感遞藥系統制備及其對乳腺癌細胞的體外作用

王金梅，張 凱，張 穎，王 爽，劉凡凡，何 勐

(鄭州大學附屬鄭州中心醫院藥學部,河南 鄭州 450000)

雷帕霉素(rapamycin,RAPA)是從吸水性鏈霉菌發酵液中提取出來的內酯類抗生素[1]。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)在癌細胞中的表達通常被上調,RAPA作為一種mTOR抑制劑,可有效抑制mTOR活性,激活自噬,同時降低缺氧誘導因子-1α的表達,進而抑制新生血管形成[2-3]。有研究表明,RAPA具有抑制乳腺癌細胞增殖、誘導乳腺癌細胞凋亡的特性[4-5]。但由于RAPA自身具有毒性作用、親水性差、治療指數偏低等藥理學缺點[6],嚴重限制了RAPA在臨床中的應用。目前,RAPA有片劑和口服液2種制劑,這2種制劑在體內生物利用度低,分布缺乏選擇性[7-8]。因此,如何克服RAPA自身的藥理學缺點并降低口服藥物非特異性分布所帶來的毒副作用,是RAPA得以在臨床廣泛應用的關鍵。腫瘤藥物遞送系統的研發已成為目前醫藥領域研究的熱點方向,脂質體納米粒遞藥系統因其獨特的優勢而引起了研究者的廣泛關注[9],其是將一定濃度的脂質囊泡和納米粒通過自組裝形成的具有脂質外殼和納米粒核心的新型藥物傳輸系統[10-11]。本研究選擇脂質體納米粒作為藥物載體,以介孔二氧化硅(mesoporous silica nanoparticles,MSN)作為納米粒核心,將RAPA載入MSN制備RAPA-MSN,然后采用pH敏感脂質體包裹RAPA-MSN 納米粒,制備載雷帕霉素介孔二氧化硅核-脂質殼納米粒(rapamycinloaded mesoporous silica nanoparticles core-lipid shell nanoplatform,RAPA-MSN-LN),并對其體外釋藥行為及對乳腺癌細胞的體外作用進行研究,現將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑與儀器

人乳腺癌細胞MCF-7、小鼠乳腺癌細胞4T1購自中國科學院上海細胞庫,細胞接種于含有體積分數10%血清的RPMI-1640培養基(含100 U·mL-1青霉素、100 mg·L-1鏈霉素)并置于含體積分數5% CO2、37 ℃恒溫培養箱中培養。RAPA購自大連美侖生物技術有限公司,十六烷基三甲基氯化銨(cetyltrimethylammonium chloride,CTAC)購自成都貝斯特試劑有限公司,三乙醇胺(triethanolamine,TEA)、硅酸四乙酯(tetraethyl orthosilicate,TEOS)購自阿拉丁試劑(上海)有限公司,3-氨丙基三甲基氧基硅烷[(3-aminopropyl)trimethoxysilane,APTMS]購自國藥集團化學試劑有限公司,二油酰磷脂酰乙醇胺(dioleoyl phosphoethanola-mine,DOPE)購自上海艾韋特醫藥科技有限公司,膽固醇購自北京索萊寶生物科技有限公司,二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺聚乙二醇2000(distearoyl phosphoethanolamine-PEG2000,DSPE-PEG2000)購自美國Corden Pharma公司,體積分數75%乙醇購自上海勵致化工有限公司,4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)染色液購自北京雷根生物技術有限公司,異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)購自上海麥克林生化科技有限公司,IR780碘化物購自美國Sigma-Aidrich公司,胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)購自蘭州民海生物工程有限公司,噻唑藍(methylthiazol tetrazolium,MTT)購自美國Sigma-Aldrich公司,細胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物科技發展有限公司,其他試劑均為分析純; AB135-S型分析天平購自瑞士Mettler Toledo公司,WSJB-03恒溫磁力攪拌器購自河南中良科學儀器有限公司,DZF-6021型真空干燥箱購自上海精宏實驗設備有限公司,RE-52AA 型旋轉蒸發儀購自上海亞榮生化儀器廠,傅里葉紅外光譜儀購自美國Thermo Scientific公司,JEM-1400透射電子顯微鏡購自日本電子株式會社,Malvern Zetasizer Nano-2000 動態光散射粒徑儀購自英國馬爾文儀器有限公司,Waters e2695 高效液相色譜儀購自美國Waters公司,Synergy H1多功能酶標儀購自美國博騰(BioTek)有限公司,Accuri C6型流式細胞儀購自美國BD公司。實驗所用緩沖溶液和樣品溶液配制用水均為超純水。

1.2 RAPA-MSN-LN的制備

1.2.1 MSN的制備

稱取2 g CATC、20 mg TEA,置于50 mL的圓底燒瓶中,加入20 mL超純水充分溶解,將圓底燒瓶置于80 ℃ 油浴條件下攪拌20 min,緩慢滴加1.5 mL TEOS,回流反應4 h。反應結束后,將反應液轉移至離心管中,12 000 r·min-1離心30 min,收集沉淀并用適量的無水乙醇和去離子水洗滌2次。使用含NaCl的甲醇溶液(8 g·L-1)將洗滌后的沉淀萃取3次,每次12 h,最后用超純水洗滌沉淀,真空干燥后即得MSN。

1.2.2 氨基化MSN的制備

參照文獻[12]中的方法制備MSN-NH2。將7 mg 的MSN超聲分散于10 mL無水乙醇中,在磁力攪拌下加入冰乙酸(50 μL),反應0.5 h后,逐滴加入APTMS(25 μL),反應1 h。然后,將所有溶液轉移至離心管中,12 000 r·min-1離心5 min,將所得沉淀用無水乙醇和去離子水洗滌,真空干燥得白色粉末,即為MSN-NH2。取一定量干燥的溴化鉀放入瑪瑙研缽中,加入適量MSN和MSN-NH2干燥粉末混勻,研磨后壓片,將壓好的薄片放置于傅立葉紅外掃描儀中進行掃描,分析特征吸收峰。

1.2.3 RAPA-MSN的制備

分別稱取40 mg MSN-NH2和80 mg RAPA,各加入4 mL甲醇分散后混勻。常溫下磁力攪拌8 h后,12 000 r·min-1離心5 min,保留上清液用于包封率的測定,沉淀經洗滌后真空干燥,所得白色粉末即為RAPA-MSN納米粒。平行制備3份樣品,分別測定包封率后取均值。

1.2.4 RAPA-MSN-LN的制備

通過薄膜分散法制備RAPA-MSN-LN[13]。分別稱取一定量的DOPE、膽固醇、DSPE-PEG2000(質量比為7：1：7)于茄型瓶,加入15 mL氯仿,超聲溶解后將茄型瓶置于45 ℃、真空條件下旋轉蒸發30 min 以除去氯仿。取制備好的RAPA-MSN納米粒,超純水分散后加入茄型瓶中,45 ℃水浴條件下旋轉茄型瓶至脂質薄膜全部脫落。1 h后將所有產物取出,超聲波細胞粉碎機中超聲處理5 min,功率200 W,工作3 s,間隔5 s,所得混懸液即為RAPA-MSN-LN。將制備的納米粒置于4 ℃條件下保存。

1.3 RAPA-MSN-LN的質量評價

1.3.1 形態觀察

取適量RAPA-MSN-LN溶液滴加至銅網上,自然晾干后,在透射電鏡下觀察納米粒形態并拍照記錄。

1.3.2 粒徑和電位表征

取適量的RAPA-MSN-LN納米粒溶液,加入超純水稀釋3倍,然后采用激光粒度分析儀測定RAPA-MSN-LN的粒徑和電位,每個樣品平行制備3份,記錄平均粒徑和電位。

1.3.3 RAPA包封率的測定

1.3.3.1 色譜條件

色譜柱為Symmetry C18 (4.6 mm×250.0 mm,5 μm),流動相為甲醇：水：乙腈 = 67：18：15,流速為1.0 mL·min-1,柱溫40 ℃,檢測器為紫外檢測器(L-2489),檢測波長277 nm。

1.3.3.2 標準曲線的建立

稱取一定量的RAPA,以甲醇為溶劑,使用10 mL 容量瓶配制RAPA儲備液(500 mg·L-1),然后將儲備液稀釋成一系列標準濃度:64、32、16、8、4、2、1 mg·L-1,按照“1.3.3.1”項下色譜條件對所有樣品進行測定,以峰面積為縱坐標,濃度為橫坐標,建立RAPA的標準曲線回歸方程。

1.3.3.3 RAPA包封率的測定

取“1.2.3”中保留的上清液,采用高效液相色譜法,按照“1.3.3.1”的色譜條件對上清液進行檢測,采用“1.3.3.2”中的標準曲線回歸方程計算上清液中RAPA含量[14],并計算包封率;包封率(%)=(RAPA投入量-上清液中RAPA含量)/RAPA投入量×100%。

1.3.4 RAPA-MSN-LN穩定性檢測

(1)儲存穩定性:取3份適量的RAPA-MSN-LN溶液,分別置于4、25、37 ℃條件下,并于0、1、3、7、15 d時測量RAPA-MSN-LN的粒徑。重復3次,取均值。(2)血清穩定性:取RAPA-MSN-LN溶液,加入體積分數20%的FBS,然后將其置于37 ℃水浴鍋中,分別于靜置0、1、3、6、12、24 h時,取出納米粒溶液并測定其粒徑,平行測定3次取均值。

1.4 RAPA-MSN-LN體外釋放實驗

配制pH 7.4磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)和pH 5.0 PBS溶液,均含質量分數0.5%的十二烷基硫酸鈉。取2份等量的RAPA-MSN-LN溶液,分別加入2種PBS溶液稀釋后置于透析袋(截留相對分子質量= 8 000～14 000)中,于37 ℃下100 r·min-1恒溫振蕩。在振蕩0、1、2、4、6、8、12、24、36、48 h取出500 μL釋放介質,同時補加等體積的釋放介質。每組平行制備3份樣品進行釋放實驗,采用高效液相色譜法測定各時間點釋放介質中RAPA的含量,計算釋放量,取均值繪制累積釋放曲線。

其中Cn為第n個時間點釋放介質中的藥物濃度,V為釋放介質的總體積,Ci為第i個時間點時釋放介質中的藥物濃度,V0為取樣體積。

1.5 RAPA-MSN-LN的體外抗腫瘤實驗

1.5.1 細胞毒性實驗

取對數生長期人乳腺癌細胞MCF-7和小鼠乳腺癌細胞4T1,胰蛋白酶消化后,收集細胞并進行計數。將人乳腺癌細胞MCF-7、小鼠乳腺癌細胞4T1分別接種于96孔板中,每孔7.0 ×103個細胞,培養24 h后,將2種細胞均分為MSN-LN組、RAPA組和RAPA-MSN-LN組,MSN-LN組和RAPA組分別加入含0、5、10、20、30 mg·L-1MSN-LN、RAPA培養基,RAPA-MSN-LN組分別加入含0、5、10、20、30 mg·L-1RAPA的RAPA-MSN-LN培養基;每個濃度設3個復孔,孵育24 h后,向各孔加入20 μL MTT溶液(5 g·L-1),培養4 h,然后吸去孔內培養液,加入150 μL二甲基亞砜,37 ℃下100 r·min-1恒溫振蕩10 min。使用酶標儀于490 nm波長處測各孔的吸光度值,計算細胞存活率。

1.5.2 細胞凋亡檢測

取對數生長期人乳腺癌細胞MCF-7和小鼠乳腺癌細胞4T1,胰蛋白酶消化后,收集細胞并進行計數。將人乳腺癌細胞MCF-7、小鼠乳腺癌細胞4T1分別接種于6孔板,每孔3.0×105個細胞,培養 24 h 后,吸去舊培養基,將2種細胞均設置空白對照組、MSN-LN組、RAPA組和RAPA-MSN-LN組,各組分別加入空白培養基和含有MSN-LN、RAPA和RAPA-MSN-LN的培養基(RAPA質量濃度為20 mg·L-1),每組設3個復孔。繼續培養24 h后,胰蛋白酶消化并收集細胞,分別用500 μL的Binding Buffer緩沖液重懸細胞,然后加入5 μL的膜聯蛋白(annexin V)-FITC溶液,室溫條件下靜置15 min,再加入5 μL 的碘化丙啶(propidium iodide,PI)溶液,5 min后使用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.6 統計學處理

2 結果

2.1 紅外光譜分析特征吸收峰結果

MSN在3 428 cm-1處存在1個特征峰,此峰對應于MSN中O-H的伸縮振動峰,1 632 cm-1處特征峰為O-H的彎曲振動峰,1 102 cm-1和798 cm-1分別對應于Si-O-Si反對稱伸縮振動峰和對稱伸縮振動峰。氨基改性后的MSN-NH2在668 cm-1附近處出現了新峰,該新峰為N-H的面外彎曲振動峰,表明-NH2 成功地接枝到了MSN上。結果見圖1。

圖1 MSN和MSN-NH2的紅外光譜圖Fig.1 Infrared spectra of MSN and MSN-NH2

2.2 RAPA-MSN-LN的質量評價

2.2.1 RAPA-MSN-LN形態、粒徑、電位及包封率

RAPA-MSN-LN納米粒呈球形,分散性好,粒徑均一,具有介孔結構。經脂質體包裹后,MSN表面增加了一層薄膜,核-殼結構明顯可見,表明脂質體成功地包裹在MSN的表面。RAPA-MSN-LN的粒徑為(98.12±1.8) nm,多分散性指數(polydispersity index,PDI)為 0.146±0.013,電位(-18.4±1.2)mV,包封率為(48.92±1.50)%。結果見圖2。

圖2 RAPA-MSN-LN的形態結構(透射電鏡)Fig.2 Morphology of RAPA-MSN-LN(transmission electron microscopy)

2.2.2 RAPA-MSN-LN穩定性

在 4、25 ℃條件下,RAPA-MSN-LN的粒徑變化范圍在95～115 nm,無顯著性增大。在37 ℃條件下,RAPA-MSN-LN的粒徑從(95.2±1.0)nm增加到(133.1±2.5)nm,差異有統計學意義(P<0.05),但無沉淀現象。與血清共孵育0、1、3、6、12、24 h,RAPA-MSN-LN粒徑分別為(97.9±1.5)、(96.3±1.2)、(96.6±0.8)、(98.2±0.3)、(98.6±1.1)、(99.4±0.7)nm,粒徑大小無顯著變化(P>0.05)。結果見表1。

表1 RAPA-MSN-LN在不同環境溫度下的粒徑變化Tab.1 Particle size changes of RAPA-MSN-LN at different ambient temperatures

2.3 RAPA-MSN-LN在體外不同pH環境中的釋放量

RAPA-MSN-LN在pH 5.0環境中釋放較快,6 h時累積釋放量為(68.24±2.40)%,48 h時累積釋放量為(92.24±3.20)%。在pH 7.4環境中,48 h時的累積釋放量為(49.93±2.80) %。結果見圖3。

圖3 RAPA-MSN-LN的體外釋放曲線Fig.3 Release curve of RAPA-MSN-LNinvitro

2.4 RAPA-MSN-LN的體外抗腫瘤作用

2.4.1 RAPA-MSN-LN對人乳腺癌細胞MCF-7和4T1小鼠乳腺癌細胞的毒性作用

RAPA和RAPA-MSN-LN對人乳腺癌細胞MCF-7和小鼠乳腺癌細胞4T1的殺傷作用均呈現濃度依賴性(P<0.05)。 當RAPA的質量濃度為10、20 mg·L-1時,RAPA-MSN-LN組人乳腺癌細胞MCF-7的存活率顯著低于RAPA組,差異有統計學意義(P<0.05)。當RAPA的質量濃度為10、20、30 mg·L-1時,RAPA-MSN-LN組小鼠乳腺癌4T1的細胞存活率顯著低于RAPA組,差異有統計學意義(P<0.05)。結果見表2和表3。

表2 3組人乳腺癌細胞MCF-7細胞存活率比較Tab.2 Comparison of survival rate of human breast cancer cells MCF-7 among the three groups

表3 3組4T1小鼠乳腺癌細胞存活率比較Tab.3 Comparison of survival rate of 4T1 mouse breast cancer cells among the three groups

2.4.2 人乳腺癌細胞MCF-7和小鼠乳腺癌細胞4T1凋亡情況

空白對照組、MSN-LN組、RAPA組和RAPA-MSN-LN組MCF-7細胞的凋亡率分別為(1.1±1.0)%、(8.8±1.5)%、(25.8±1.3)%、(55.9±1.7)%。空白對照組、MSN-LN組、RAPA組和RAPA-MSN-LN組4T1細胞的凋亡率分別為(1.6±1.4)%、(8.2±2.1)%、(35.4±2.1)%和(61.9±1.7)%。RAPA-MSN-LN組MCF-7細胞和4T1細胞的凋亡率均顯著高于空白對照組、MSN-LN組、 RAPA組,差異有統計學意義(P<0.05)。結果見圖4和圖5。

A:空白對照組;B:MSN-LN組;C:RAPA組;D:RAPA-MSN-LN組。圖4 各組人乳腺癌細胞MCF-7凋亡情況(Annexin V-FITC/PI雙染法)Fig.4 Apoptosis of human breast cancer cells MCF-7 in each group (Annexin V-FITC/PI double staining)

3 討論

本研究通過溶膠-凝膠法制備了MSN,使用APTMS對MSN進行氨基化修飾,將RAPA載入MSN-NH2后,采用薄膜分散法將pH敏感脂質薄膜包裹在RAPA-MSN-NH2納米粒的表面。紅外光譜分析結果證明,氨基改性后的MSN-NH2在 668 cm-1附近處出現了新峰,該新峰為N-H的面外彎曲振動峰,表明-NH2成功地接枝到了MSN上[15]。

本研究透射電鏡結果顯示,pH敏感脂質薄膜包裹在MSN表面,形成的納米粒形態均一,分散性好;RAPA-MSN-LN的包封率為(48.92±1.50 )%,平均粒徑為(98.12±1.8 )nm(PDI=0.146±0.013),電位為(-18.4±1.2)mV;這樣的RAPA-MSN-LN有利于實現體內藥物遞送。RAPA-MSN-LN穩定性實驗結果顯示,RAPA-MSN-LN在4、25、37 ℃環境溫度下具有良好的穩定性,受環境因素影響小,相對而言,更適合在低溫條件下保存。將RAPA-MSN-LN與血清共孵育不同時間,RAPA-MSN-LN的粒徑未發生明顯的變化,表明RAPA-MSN-LN具有一定的抗血清成分降解能力,血清穩定性較好。

體外釋放實驗結果表明,在pH 5.0時,RAPA釋放較快,48 h時累積釋放量達(92.24±3.20)%。這是因為在酸性條件下,pH敏感脂質體的結構變為疏松的六方晶相,促使MSN孔道中的藥物快速釋放出來[16],該結果表明RAPA-MSN-LN納米粒具有pH敏感性,在正常體液環境中較穩定,能夠有效防止藥物泄漏,從而減少藥物對正常組織的毒副作用。

體外抗腫瘤實驗結果表明,MSN-LN納米載體生物相容性好,與RAPA相比,RAPA-MSN-LN對人乳腺癌細胞MCF-7和小鼠乳腺癌細胞4T1均具有較強的抑制作用;細胞凋亡結果表明,在MCF-7和4T1細胞中,RAPA-MSN-LN均可以有效誘導細胞發生凋亡;且RAPA-MSN-LN組人乳腺癌細胞MCF-7和小鼠乳腺癌細胞4T1存活率低于RAPA組,細胞凋亡率高于RAPA組,差異有統計學意義;說明RAPA-MSN-LN具有更顯著的抑制腫瘤細胞生長的作用。這是由于將RAPA載入MSN-LN后,增加了藥物在細胞內的蓄積量,從而使RAPA-MSN-LN對腫瘤細胞的殺傷作用增強。

4 結論

脂質體納米粒作為一種新型藥物傳輸系統,充分結合了納米粒和脂質體各自的優點[17]。脂質體結構類似于細胞膜,具有良好的生物相容性,將脂質體包裹在納米粒表面,可以賦予納米載體緩釋和被動靶向性等優良特性[18-19]。納米粒作為脂質體的核心,為脂質體提供支撐骨架,給予脂質體機械穩定性[11]。本研究制備的MSN-LN納米載體具有載藥量高,分散性好,粒徑均一,且在生物相容性好等優點,不僅提高了難溶性抗腫瘤藥物的包封率,而且能夠保護藥物在正常生理條件下不被釋放,從而減少對正常組織的損傷,降低毒副作用。將抗腫瘤藥物RAPA載入MSN-LN納米粒后,納米粒通過內吞作用進入細胞,增強了RAPA的抗腫瘤作用,RAPA通過抑制腫瘤細胞生長、誘導細胞凋亡而殺死腫瘤細胞。