牦牛奶中不同酪蛋白的提取及其功能特性分析

◎ 周 靜，張 鑫，陳旭雯，付 帥，王 練

（西昌新希望三牧乳業有限公司，四川 西昌 615000）

牦牛乳富含豐富的蛋白質、氨基酸、礦物質和維生素，具有易消化吸收和營養豐富等特點。牦牛乳的酪蛋白含量高，且酪蛋白組分豐富，具有良好的乳化性和發泡性。傳統牦牛乳酪蛋白的分離提取主要采用沉淀法、等電點沉淀法、高效液相色譜分離等方法，存在產率低、工藝復雜、分離效果不理想等問題，難以滿足工業化生產的需求。因此，本研究旨在為特色乳制品的深度開發和利用提供參考[1]。

1 實驗設計與方法

1.1 實驗操作步驟

1.1.1 設計α-、β-、κ-酪蛋白分離工藝流程

設計α-、β-、κ-酪蛋白分離工藝流程，是實驗中的關鍵步驟，需要考慮原料性質、分離方法和操作條件等。①將牦牛奶樣品進行初步處理，去除雜質和沉淀物，采用離心法對牦牛奶樣品進行預處理，去除脂肪和大分子蛋白。②對預處理后的樣品進行pH 調節，使其處于適宜的分離條件下。在分離過程中，采用鈣鹽沉淀法，通過添加0.1～0.5 mol·L-1的CaCl2溶液，使酪蛋白沉淀，進而實現α-、β-、κ-酪蛋白的分離。分離后的沉淀經過離心后，可得到不同酪蛋白的純化產物。③根據實驗需要，調節CaCl2的濃度，通常在0.1～0.5 mol·L-1的范圍內選擇合適的濃度，調節溶液的pH 為4.6～4.8，溫度通?？刂圃?～10 ℃，以促進酪蛋白的沉淀和分離，保證實驗環境的穩定性和分離效果的可靠性[2-3]。

1.1.2 進行α-、β-、κ-酪蛋白分離工藝的單因素實驗

（1）調節CaCl2濃度對分離效果的考察。①準備一系列不同濃度的CaCl2溶液，濃度范圍為0.1～0.5 mol·L-1，再將這些溶液分別與牦牛奶樣品混合，并進行離心分離過程。②離心后，沉淀物為0.1～0.5 mol·L-1。其中，若CaCl2溶液≤0.1 mol·L-1，表明濃度過低，無法充分沉淀酪蛋白，分離效果不佳；若CaCl2溶液≥0.5 mol·L-1，表明濃度較高，會造成過度沉淀，使純化產物中雜質含量超標，導致分離效果不佳。因此，保持CaCl2溶液濃度在0.1～5 mol·L-1，即可實現高效、純凈的酪蛋白分離。

（2）調節冷卻溫度對分離效果的評估。調節冷卻溫度范圍通常在4～10 ℃。通過觀察可知，當冷卻溫度為4 ℃時，雖然沉淀質量評分較高，但分離純度和上清液殘留物質評分較低，表明低溫下酪蛋白的沉淀速度較慢，導致分離時間延長，但同時也有利于提高分離純度；當溫度為10 ℃時，雖然沉淀質量較低，但分離純度和上清液殘留物質評分較高，因為高溫度加速了沉淀過程，導致較多的雜質殘留在產物中；當溫度在6～8 ℃時，沉淀質量、分離純度和上清液殘留物質的評分都相對均衡，分離效果更佳，既能保證較高的分離純度，又能控制殘留物質的含量。

1.2 利用SDS-PAGE 電泳方法評估牦牛奶中α-、β-、κ-酪蛋白的純度

樣品制備過程如下。①取出待分析的樣品2 mg，然后放入一個容量為1.5 mL 的離心管中。按照1 ∶4的比例，向離心管中加入4 倍樣品重量的純水，使樣品得以溶解。例如，如果樣品為2 mg，則需要加入8 mL 的純水。②待樣品充分溶解后，從中取出20 μL 的溶液，轉移到另一個離心管中。在新的離心管中，向樣品溶液中加入20 μL 的β-巰基乙醇（β-ME）、15 μL 的飽和溴酚藍溶液，用于反應和標記樣品的試劑。③混合均勻后，將混合溶液置于金屬浴中，設定溫度為95 ℃，并進行反應處理，持續時間為10 min，處理完成后，備用樣品可用于后續的分析實驗中。

電泳分析牦牛奶酪蛋白組分純度的具體步驟（見表1）。

表1 電泳分析牦牛奶酪蛋白組分純度步驟表

1.3 測定牦牛奶酪蛋白組分的功能特性

1.3.1 溶解性的測量方法

稱取2 mg 的酪蛋白樣品，將其溶解在水中或者緩沖液溶劑中，在室溫或者37 ℃條件下觀察其溶解過程。在溶解過程中，輕輕搖晃溶液，以促進酪蛋白的充分溶解。同時，技術人員需要觀察溶液的透明度和均勻性，確保酪蛋白能夠完全溶解，不產生任何沉淀或凝固物。

1.3.2 乳化性的檢測程序

根據實驗設計和所需乳化性能，取2 mg 的酪蛋白樣品，溶解于pH 5.5～7.0、1.5 mL的緩沖液中。準備1∶1的油相和水相，將酪蛋白樣品溶液加入油相和水相中，輕輕攪拌使其充分混合。觀察乳液10 min，看其是否形成了穩定的乳液，并詳細記錄乳液的外觀、穩定性以及乳化度等參數[4]。

2 實驗結果與分析

2.1 牦牛奶中α-、β-、κ-酪蛋白的提取與分離效果

2.1.1 鈣離子濃度調節實驗結果分析

一方面，α-CN 具有較多的磷酸絲氨酸基團，在堿性條件下帶有更多的負電荷，與鈣離子結合的能力更強。隨著Ca2+濃度的增加，其與αs-酪蛋白的親和性也增加，導致αs-酪蛋白的沉淀。另一方面，在低溫條件下，β-酪蛋白往往處于游離態，溫度越低分離到β-酪蛋白的可能性就越高。

2.1.2 冷卻溫度調節實驗結果分析

隨著冷卻溫度的降低，分子的運動減弱，導致分子間的相互作用減弱。在低溫下（2 ℃）β-CN 處于游離狀態，其含量較高，達到16.90 g。隨著溫度升高，α-CN 和β-CN 的含量逐漸降低，0 ℃時α-CN和β-CN 的含量低于2 ℃時。因此，選擇2 ℃作為不同酪蛋白分離溫度是合理的。此外，在溫度為2 ℃、CaCl2溶液濃度為0.065 mol·L-1的條件下，也能成功分離得到αs-CN 和β-CN 組分，進一步表明選擇2 ℃是適宜的。

2.2 牦牛奶α-、β-、κ-酪蛋白功能特性的分析

2.2.1 不同pH 對酪蛋白組分溶解性的影響分析

對牦牛奶中的α-、β-、κ-酪蛋白進行溶解性的研究，可以揭示它們在不同條件下的溶解行為。研究發現，隨著溶液pH 的變化，牦牛奶中的酪蛋白溶解度也會發生變化。隨著pH 增大，酪蛋白溶解度呈先降低后增加的趨勢，達到峰值后趨于平緩。特別是在等電點附近，酪蛋白的溶解度最低。這一現象與其他研究結果相符，由于pH變化引起蛋白質的結構變性，疏水基團外露，影響與水分子的相互作用，從而影響了溶解度。另外，牦牛奶中的α-、β-、κ-酪蛋白的溶解度還受溫度的影響。研究證實，在40～80 ℃之間時，溫度與酪蛋白的溶解度呈負相關，其原因可能在于加熱導致蛋白質分子內部的非極性基團暴露，引起蛋白分子極化和構象的改變，從而導致溶解度的下降。

2.2.2 不同pH 對酪蛋白組分乳化性的影響分析

牛乳中的α-、β-、κ-酪蛋白在不同pH 下的乳化能力表現明顯的變化趨勢。隨著pH 從酸性到堿性的變化，乳化能力先降后升，直至趨于平緩。當pH 為2.1 時，牦牛乳中的α-、β-、κ-酪蛋白乳化能力最佳，表現較好的乳化特性。這可能是由于pH 變化導致蛋白質結構發生輕微變化，增加了靜電斥力，使得疏水基團暴露增多，從而提升了乳化性能[5]。相反，在pH 為4～5 時，蛋白質的可溶性減少，影響乳化穩定性。當pH 偏離等電點時蛋白質帶電，乳化液之間的相互作用有效抑制了液滴的聚集，乳化穩定性得以提高。當pH 為6.15 時，乳化穩定性達到最佳狀態。

2.2.3 pH 變化對酪蛋白組分發泡性的影響分析

當pH 為2.1 時，三者的起泡性達到最佳狀態；當pH 為4.26 時，泡沫穩定性表現最佳，可能是蛋白質的兩性電解質性質所致。當蛋白質的電荷與溶液的pH 相近時，其帶電荷為0，導致溶解性下降，從而影響了其在氣－液界面的排列和展開能力，進而降低了起泡性。然而，當蛋白質的電荷偏離等電點時，其溶解性增加，分子間的自由度提高，促進蛋白質在氣－液界面的快速排列和展開，從而提高了起泡性。這表明，蛋白質的電荷狀態和溶解性對其在液體中的表現具有重要影響，特別是在液體界面的作用。

3 結語

本實驗對牦牛奶中的α-、β-、κ-酪蛋白進行研究，觀察了蛋白質在不同pH 下的溶解性變化，發現其呈現先降低后增加的規律。當pH 為2.1 時，溶解度達到最高值，與其他研究結果相符合；當溫度為40 ℃時，牦牛奶中的α-、β-、κ-酪蛋白的溶解度較高，隨著溫度升高，溶解度逐漸降低；當pH 為2.1時，牦牛奶中的酪蛋白表現較好的乳化能力和泡沫穩定性。因此，本研究結果可以為牦牛奶蛋白質的功能特性提供重要參考，對牦牛奶產品的生產和質量控制具有指導意義。