草地貪夜蛾與黏蟲腸道微生物的多樣性分析

摘要：通過比較分析對食用玉米葉的草地貪夜蛾與黏蟲體內腸道共生菌進行比較分析，研究玉米葉內生細菌的組成與草地貪夜蛾和黏蟲腸道微生態的相互關系。選用玉米葉飼養的草地貪夜蛾和黏蟲，通過16S rDNA全長擴增子測序，比較分析其腸道菌群多樣性和豐富度。由α多樣性研究結果可知，草地貪夜蛾和黏蟲腸道菌群多樣性、物種豐富度比較接近；β多樣性分析結果也表明，草地貪夜蛾和黏蟲腸道菌群落結構相似性較高。KEGG通路功能預測結果表明，草地貪夜蛾和黏蟲腸道菌群中均以代謝功能占比最高，主要涉及糖類代謝、氨基酸代謝和能量代謝。同樣取食玉米葉的草地貪夜蛾和黏蟲的腸道細菌在門水平上的核心菌群相同，在屬水平上的優勢菌屬豐度和物種多樣性差異不大，群落結構相似度高，菌群功能差異不顯著，其原因可能是物種遺傳特點相似、取食食物和生長環境中微生物種類相同。

關鍵詞：草地貪夜蛾；黏蟲；玉米葉；腸道微生物；多樣性；豐度

中圖分類號：S433.4" 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）05-0140-06

草地貪夜蛾（Spodoptera frugiperda），又名秋黏蟲、行軍蟲，屬鱗翅目（Lepidoptera）、夜蛾科（Noctuidae），是原產于美洲的重要的農業入侵害蟲，危害禾本科、豆科和菊科等76科353種植物，具有飛行能力強、繁殖速度快、遷徙速度快等特點。該蟲于2019年1月11日入侵我國云南省［1-4］，隨后迅速擴散至26個省（市、區），對我國農業生產造成了巨大的威脅。黏蟲（Mythimna seperata）屬鱗翅目（Lepidoptera）夜蛾科（Noctuidae），是一種多食性、暴發性害蟲，喜食禾本科作物［5-8］。田間調查發現，草地貪夜蛾與黏蟲形態相近，常在我國重要的糧食作物玉米上分布，防治不及時的區域蟲害發生嚴重，影響玉米產量。

有人就草地貪夜蛾與黏蟲的幼蟲和成蟲的形態差異進行了很多研究，為草地貪夜蛾的準確鑒別和田間調查提供依據［9-12］。與草地貪夜蛾、黏蟲外部生態學、生物學研究相比，關于兩者腸道微生物差異的研究還比較少。大量微生物棲居在昆蟲腸道內，形成腸道的微生態系統，而昆蟲腸道的微生物種類和豐富度因食物、地區和生長發育等不同而出現差異，同一地區以相同食物為食的不同昆蟲間腸道微生物有較大差異［13-15］。徐天梅等發現，從云南2個不同地區采集的草地貪夜蛾腸道內可培養的優勢菌屬種類有一定的相似性之處［16］。顧偌鋮等采用分離培養鑒定法研究草地貪夜蛾與黏蟲腸道菌群時發現，草地貪夜蛾和黏蟲雖然生長在相同的環境中且食用相同的食物，但腸道細菌組成差異很大［17-18］。草地貪夜蛾、黏蟲的生態位和寄主范圍相似，這可能使得這2個物種的腸道微生物具有一定的相似性，兩者同時入侵將加重危害程度。

本研究比較草地貪夜蛾、黏蟲腸道細菌群落結構和多樣性差異，預測其腸道代謝途徑的功能，以獲得它們在腸道微生物和代謝途徑方面的異同，并探討2種害蟲與玉米葉內生菌間的關系，研究結果將為探索腸道微生物在生物防治方面的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

2022年8月從四川省農業科學院新都基地將草地貪夜蛾與黏蟲采回室內，在智能光照培養箱（鴻科GHP-160 中國）中以恒溫（27±1） ℃、相對濕度75%、光—暗周期為16 h—8 h的條件，采用室外種植的玉米葉片在養蟲盒中飼養，分別記為Sf組和Ms組，各取4個平行。

1.2 腸道解剖

將收集的9日齡試蟲轉移至新的離心管中，在飼養環境下饑餓處理24 h，使試蟲體內的腸道菌群達到相對穩定的水平。將饑餓處理后的試蟲采用無菌水清洗1遍，置于75%乙醇中浸泡2 min，然后用無菌水沖洗去除殘留的乙醇。在無菌條件下完整地取出腸道，置于無菌離心管中，采用液氮速凍，于 -80 ℃ 冰箱內保存、待用。

1.3 試蟲腸道共生菌群與玉米葉內生菌16S rDNA全長擴增子測序

采用CTAB法提取試蟲腸道菌群與玉米葉內生菌的基因組DNA，測定DNA濃度，并用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性。PCR全長擴增，產物純化，構建SMART bel文庫，PacBio上機進行高通量測序。

1.4 數據分析

PacBio下機數據通過美國太平洋生物科學公司（PacBio）SMRT分析軟件導出bam文件。按barcode區分樣本后進行操作分類單元（OTU）聚類和物種分類分析。根據OTU聚類結果，對每個OTU的代表序列進行物種注釋，得到對應的物種信息和基于物種的豐度分布情況；對OTU進行樣品復雜度分析（α多樣性指數），得到樣品內物種豐富度、Shannon指數、辛普森指數、Chao1指數、ACE指數、覆蓋度和譜系多樣性指數；對OTU進行多序列比對（β多樣性指數），得到不同樣品和分組的群落結構差異，以無度量多維標定法（NMDS）降維圖展示；用LEfSe分析方法對分組樣品的物種組成和群落結構進行差異顯著性檢驗，以LDA值分布柱狀圖展示。采用KEGG數據庫預測草地貪夜蛾與黏蟲幼蟲腸道菌群功能，通過對每個OTU進行KEGG功能注釋，獲得OTU在KEGG各功能水平的注釋信息。

2 結果與分析

2.1 菌群OTU物種注釋及相對豐度差異

由圖1可知，草地夜貪蛾（Sf）共獲得56 276條有效的細菌序列和185個OTU，通過物種注釋后獲得16門和118屬；黏蟲（Ms）共獲得44 591條有效的細菌序列和232個OTU，通過物種注釋后獲得11門和93屬；玉米葉（Zml）共獲得51 927條有效的細菌序列和43個OTU，通過物種注釋后獲得5門和19屬。草地貪夜蛾、黏蟲和玉米葉片共注釋到19個門和158個屬。

由圖2可知，在門分類水平，變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和酸桿菌門（Acidobacteria）是Sf組和Ms組細菌菌群的主要門。厚壁菌門是Sf組和Ms組中相對豐度最高的門，其在Ms4組中的相對豐度顯著高于其余各組。變形菌門是Sf組和Ms組中的第二大門，其在Ms2組的相對豐度顯著高于其余各組。另外，酸桿菌門在Ms1組的相對豐度顯著高于其余各組，擬桿菌門在Sf2組的相對豐度顯著高于其余各組。玉米葉內共生菌主要是藍細菌門（Cyanobacteria）（91.07%），其次是厚壁菌門（6.48%）和變形菌門（2.36%），其余門的相對豐度均低于0.1%。

在屬分類水平中，腸球菌屬（Enterococcus）、蒼白桿菌屬（Ochrobarctrum）和沙雷氏菌屬（Serratia）是Sf組和Ms組細菌菌群的主要屬。由圖3可知，Sf組腸道中腸球菌屬的相對豐度（35.23%）明顯高于Zml和Ms組腸道中的相對豐度（分別為0.01%和30.02%）；在Ms組腸道中沙雷氏菌屬的相對豐度（16.57%）明顯高于Zml和Sf組腸道中的相對豐度（分別為0.01%和7.21%）；而unidentified_Cyanobacteria在Zml和Sf組中均檢測出一定的相對豐度，而在Ms組中未被檢測出。

2.2 草地貪夜蛾與黏蟲腸道微生物豐富度與多樣性分析

對不同樣品在97%一致性閾值下的α多樣性指數進行統計。由表1可知，草地貪夜蛾腸道菌群的Chao1指數（79.94）和ACE指數（81.04）稍低于黏蟲的Chao1指數（85.56）和ACE指數（87.91），但不顯著（Pgt;0.05）；草地貪夜蛾與黏蟲的香農（Shannon）指數和辛普森（Simpson）指數分別為2.76、2.90和0.73、0.70，各組之間存在差異但不顯著（Pgt;0.05），說明菌群中優勢種的集中程度相近。采用Shannon指數和Chao1指數來評估草地貪夜蛾與黏蟲腸道細菌菌群的豐富度和多樣性（表1），Sf組和Ms組細菌菌群的豐富度存在差異但不顯著（Pgt;0.05）。兩者的譜系多樣性指數差異不顯著，表明兩者腸道菌群間親緣關系復雜度差異不顯著。

對草地貪夜蛾與黏蟲腸道菌群的相異系數進行檢測，結果（圖4）表明，它們之間的加權Unifrac距離和未加權Unifrac距離分別為0.31和0.65，表明草地貪夜蛾與黏蟲腸道菌群的差異較小。無度量多維標定法（NMDS，non-metric multi-dimensional scaling）分析結果表明各樣本間有些差異，但草地貪夜蛾與黏蟲二者之間的腸道群落結構沒有表現出明顯的分組，相似性較高。

采用Shannon指數和Chao1指數評估草地貪夜蛾與黏蟲腸道細菌菌群的豐富度和多樣性，由表1可知，Sf組和Ms組細菌菌群的豐富度存在差異，但不顯著（Pgt;0.05）。

2.3 草地貪夜蛾與黏蟲腸道微生物組成差異分析

為找到草地貪夜蛾和黏蟲腸道微生物各分類水平下具有統計差異的生物標志物，本研究做組間t檢測，但各水平均無顯著差異的物種（Pgt;0.05）。故又采用LEfse分析，在組間尋找具有統計學差異的Biomarker。由圖5可知，黏蟲具有顯著差異的為變性菌綱；草地貪夜蛾腸道細菌具有顯著差異的為蒼白桿菌。

2.4 菌群基因功能預測

采用KEGG數據庫對草地貪夜蛾、黏蟲的腸道菌群測序數據進行差異顯著分析，共注釋到6種KEGG一級功能通路。由表2可知，草地貪夜蛾和黏蟲腸道菌群間的各通路無顯著性差異（Pgt;0.05）。其中， 代謝功能通路的豐度占一級功能通路的1/2，說明草地貪夜蛾和黏蟲腸道菌群主要參與代謝反應。對二者腸道菌代謝通路的二級通路進行注釋，共注釋到12種代謝功能通路（表3）。這些二級通路對應的功能中，糖類代謝在二者腸道中的占比為：草地貪夜蛾23.37%、黏蟲22.05%，氨基酸代謝在二者腸道中的占比為：草地貪夜蛾18.45%、黏蟲19.79%。由此可知，草地貪夜蛾和黏蟲均以糖類代謝和氨基酸代謝為最主要的代謝通路，雖然存在數量上的差異，但趨勢上基本相同。

3 討論

腸道微生物的主要功能是幫助宿主消化食物、幫助宿主降解有毒有害物質、增強宿主免疫、提高宿主環境適應性、調節宿主行為等［19-23］，大量微生物與昆蟲共生，與宿主協同進化，直接或間接地在宿主生長發育中發揮重要作用。昆蟲腸道微生物結構受遺傳、食物、生存環境和物種差異等因素影響［24］。在對取食不同寄主植物的3種植食性葉蜂的腸道菌群研究中發現，3種葉蜂的腸菌群組成與其各自的寄主植物密切相關［25］，同樣取食椰子樹的椰心葉甲與椰子織蛾，兩者腸道菌群、代謝通路方面存在一定差異［26］。

本研究采用16S rDNA擴增子測序法對草地貪夜蛾、黏蟲的腸道菌微生物多樣性進行系統分析，共注釋到19門23綱43目77科158屬。草地貪夜蛾和黏蟲的腸道細菌均以厚壁菌門和變形菌門為優勢菌門，之前有人也發現鱗翅目昆蟲腸道微生物主要以變形菌門、放線菌門和厚壁菌門為主［19，27-28］。玉米葉內共生菌主要是藍細菌門（91.07%），但玉米葉內生菌中的厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門及放線菌門是在草地貪夜蛾和黏蟲腸道中檢測到的共有細菌，表明這些微生物可能源于植物內生菌。其中，梭桿菌門、軟壁菌門、浮霉菌門僅在草地貪夜蛾和黏蟲腸道中存在，說明這些微生物不是源于植物內生菌，可能是從環境中獲得的。

有研究表明，鱗翅目昆蟲幼蟲在相同環境中生長，如果取食相同食物，其腸道微生物的優勢屬相同，雖然菌株略有不同，但菌群組成相似度卻很高，推測與其取食食物相同及均歸屬于鱗翅目有關［29］。本研究的對象草地貪夜蛾和黏蟲均屬鱗翅目昆蟲，其生活環境、取食食物均相同，α多樣性分析表明，兩者腸道細菌群多樣性、豐富度比較接近，同時，β多樣性分析結果也發現二者腸道菌群結構相似度較高，這與前人研究結果［29］相一致。顧偌鋮等就重慶地區取食高粱的草地貪夜蛾與黏蟲的腸道細菌進行比較，分離鑒定結果顯示，雖然草地貪夜蛾和玉米黏蟲生長在相同環境、取食相同的食物，但它們的腸道細菌組成差異很大，這與本研究結果不同，可能是因為其研究的是野外種，且采用的培養條件單一，而本研究采用實驗室玉米葉片飼養多代草地貪夜蛾和黏蟲，也從側面顯示腸道共生菌與宿主有協同進化的關系［17］。

兩者代謝通路方面雖然存在差異但不顯著，其腸道微生物的功能均以代謝為主，其中以糖類代謝和氨基酸代謝所占比例最高。另外，能量代謝也占有較高的比例，表明腸道細菌在協助草地貪夜蛾和黏蟲進行代謝，并幫助宿主合成自身不能合成的各種物質，進而在適應環境中發揮著重要作用。但是總體上來看，草地貪夜蛾和黏蟲的腸道微生物在代謝通路上具有較高的一致性，可能是由于二者均屬于鱗翅目昆蟲，遺傳特性、食性、習性較一致。這些微生物在糖類代謝、氨基酸代謝或能量代謝方面可能會與其宿主發生相互作用。

本研究分析了草地貪夜蛾、黏蟲腸道細菌及玉米葉內生菌的組成，靜態地反映了二者腸道菌群的情況，初步探究了食物對草地貪夜蛾及黏蟲腸道菌群的影響，為后續深入研究奠定了基礎。今后筆者將結合其他技術手段分析取食不同玉米品種，來自不同生長環境或不同地點的這2種害蟲腸道微生物組成，及單個菌群在草地貪夜蛾、黏蟲等宿主腸道微生態中發揮的作用。

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