頭孢唑林及其雜質(zhì)誘導(dǎo)的斑馬魚胃腸道毒性反應(yīng)比較分析

張苗青?張靖溥?胡昌勤

摘要：目的 本研究利用藥源性斑馬魚胃腸道毒性反應(yīng)模型，比較分析頭孢唑林及其雜質(zhì)F和雜質(zhì)A誘導(dǎo)的胃腸道毒性反應(yīng)及其機制。方法 熒光顯微鏡下活體觀測頭孢唑林、雜質(zhì)F和雜質(zhì)A對斑馬魚幼魚胃腸道排空過程的影響，評價其毒性反應(yīng)，比較分析3種化合物結(jié)構(gòu)與毒性關(guān)系；利用RNA-seq技術(shù)分析3種化合物胃腸道毒性反應(yīng)機制的差異；利用分子對接模擬分析3種化合物與膽汁鹽外排蛋白（BSEP）蛋白結(jié)合親和力。結(jié)果 雜質(zhì)F胃腸排空能力明顯大于頭孢唑林，雜質(zhì)A的胃腸排空能力明顯小于頭孢唑林，MMTD結(jié)構(gòu)是頭孢唑林導(dǎo)致胃腸道毒性反應(yīng)的主要毒性功能基團；RNA-seq分析發(fā)現(xiàn)雜質(zhì)F處理組分別與頭孢唑林和雜質(zhì)A處理組相比較具有45個共同呈顯著差異的基因，主要顯著富集在礦物質(zhì)吸收通路和膽汁分泌通路中，其中abcb11b基因的表達與胃腸道毒性反應(yīng)呈明顯相關(guān)；分子對接結(jié)果顯示雜質(zhì)F與斑馬魚BSEP的親和力高于頭孢唑林，頭孢唑林的結(jié)合親和力高于雜質(zhì)A。結(jié)論 臨床中頭孢唑林鈉的胃腸毒性反應(yīng)可能與產(chǎn)品中雜質(zhì)F有關(guān)，通過藥物和雜質(zhì)與BSEP蛋白結(jié)合的親和力可以評估頭孢唑林雜質(zhì)引起的胃腸道毒性反應(yīng)的差異，可為頭孢唑林鈉的生產(chǎn)工藝評估和質(zhì)量控制提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：頭孢唑林；雜質(zhì)；斑馬魚；胃腸道毒性

中圖分類號：R978.1文獻標志碼：A

Comparative analysis of gastrointestinal toxicity induced by cefazolin and its impurities in zebrafish

Abstract Objective This study employed a zebrafish model to comprehensively assess and compare the gastrointestinal toxicity induced by cefazolin， impurity F， and impurity A， shedding light on the underlying mechanisms. Methods Real-time observation of zebrafish larvaes gastrointestinal emptying under a fluorescence microscope allowed the evaluation of toxicity responses to cefazolin， impurity F， and impurity A. Structural relationships among the three compounds were analyzed. Genome expression patterns associated with gastrointestinal toxicity reactions were elucidated by means of RNA-seq technology. Molecular docking assessed the binding affinity between the compounds and the bile salt export pump （BSEP） protein. Results Impurity F exhibited significantly higher gastrointestinal emptying capacity compared to cefazolin， while impurity A demonstrated notably lower emptying capacity than cefazolin. The MMTD structure emerged as the primary toxic functional group responsible for cefazolin-induced gastrointestinal toxicity. RNA-seq analysis unveiled 45 significantly differentially expressed genes shared between the impurity F group and the cefazolin and impurity A groups. These genes were predominantly enriched in the mineral absorption and bile secretion pathways， with the expression of the abcb11b gene closely linked to gastrointestinal toxicity reactions. Molecular docking results indicated that impurity F had a stronger affinity for zebrafish BSEP than cefazolin， while cefazolin exhibited a higher binding affinity compared to impurity A. Conclusion Clinical gastrointestinal toxicity reactions attributed to cefazolin sodium may be associated with impurity F in the product. The assessment of the binding affinity of the drug and the impurities to the BSEP protein offered insights into variations in gastrointestinal toxicity reactions caused by the impurities in cefazolin sodium. This study provided a theoretical foundation for evaluating the production process and quality control of cefazolin sodium.

Key words Cefazolin; Impurities; Zebrafish; Gastrointestinal toxicity

頭孢唑林（cefazolin）為第一代頭孢菌素，用于治療多種細菌感染，包括但不限于上呼吸道感染（如鼻竇炎、扁桃體炎、喉炎）、下呼吸道感染（如支氣管炎和肺炎）、皮膚和軟組織感染等[1]。頭孢唑林在體內(nèi)幾乎不代謝，主要通過尿和膽汁排泄。隨著其在臨床中的廣泛應(yīng)用，不斷有頭孢唑林引起的藥物不良反應(yīng)包括過敏反應(yīng)、腎損傷、胃腸道反應(yīng)、心律失常等的報道[2]。其中，胃腸道反應(yīng)主要包括腹痛、腹瀉、惡心嘔吐、食欲不振等癥狀。這些反應(yīng)可通過有效的干預(yù)措施得以緩解和消失[3]。然而，頭孢唑林藥品導(dǎo)致胃腸道反應(yīng)的主要因素及作用機制目前尚未明確。

藥品雜質(zhì)是引起藥品安全問題的重要原因之一[4]。頭孢菌素類藥物在儲存過程中易發(fā)生降解。藥品中雜質(zhì)含量的增加，可能影響藥物的療效，降低藥物的安全性。由于藥物雜質(zhì)通常與原料藥（active pharmaceutical ingredient，API）具有相似的結(jié)構(gòu)，但含量較低，因而不易分離，難以直接對其進行安全性評價。建立靈敏的藥物雜質(zhì)毒性評價模型對藥品質(zhì)量控制尤為重要。

斑馬魚作為一種模式動物，具有遺傳水平與人類相似、高繁殖力以及可視化的發(fā)育過程等優(yōu)勢，已廣泛用于建立各類藥品安全性評價模型[5]。盡管斑馬魚沒有胃，但其腸道在基因表達、解剖結(jié)構(gòu)、細胞結(jié)構(gòu)以及對化學(xué)物質(zhì)的反應(yīng)方面與哺乳動物小腸相似[6]。斑馬魚腸道可分為腸球區(qū)、中腸區(qū)和遠腸區(qū)[7]。受精3 d（3 day post fertilization， 3 dpf）后的斑馬魚腸道可發(fā)生自發(fā)性的不穩(wěn)定收縮，受精5 d（5 dpf）后可發(fā)生自動蠕動，增強斑馬魚的攝食能力[8]。斑馬魚在進食、消化、吸收和排泄過程中的腸道蠕動行為與人類相似，已成功地用于機體胃腸道生理學(xué)的研究[9-11]。本課題組已利用斑馬魚模型對阿奇霉素導(dǎo)致的胃腸道不良反應(yīng)機理進行了研究，發(fā)現(xiàn)阿奇霉素雜質(zhì)J是引起胃腸道毒性反應(yīng)的主要雜質(zhì)[12]。

本研究利用建立的藥源性斑馬魚胃腸道毒性模型，深入探討頭孢唑林誘導(dǎo)胃腸道毒性的作用機制，評價頭孢唑林雜質(zhì)的胃腸道毒性反應(yīng)，以便為頭孢唑林雜質(zhì)的質(zhì)量控制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

斑馬魚采用野生型AB系；飼養(yǎng)液電導(dǎo)率為500～550 μS/cm，飼養(yǎng)溫度為28 ℃，光照條件為14 h光照/10 h黑暗。雌雄成魚按照1：1配對/交配盒，產(chǎn)卵后，隨機挑選正常受精卵在斑馬魚飼養(yǎng)液中培養(yǎng)，發(fā)育至受精后5 d（5 dpf）供后續(xù)實驗使用。本研究的實驗程序符合中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所的動物實驗倫理規(guī)則，并已獲得所實驗動物管理委員會的準許。

1.1.2 試劑

頭孢唑林、雜質(zhì)F和雜質(zhì)A對照品來自中國食品藥品檢定研究院；Neil red染色試劑購自Sigma-Aldrich公司；TRIzol試劑購自Thermo Fisher公司；PrimeScript RT Master Mix購自Takara公司。

1.2 方法

1.2.1 對斑馬魚幼魚胃腸排空過程的觀察

參照文獻[12]方法。隨機挑選發(fā)育正常的5 dpf仔魚，每組各20條；首先在飼養(yǎng)液中分別給予10 μg/L的熒光示蹤劑Neil red染料，于黑暗中喂養(yǎng)16 h后，轉(zhuǎn)移至光照條件。給藥組分別置于含不同濃度的頭孢唑林、雜質(zhì)F或雜質(zhì)A（1、10和100 μmol/L）的飼養(yǎng)液中，6 h后，在體式熒光顯微鏡下觀察熒光示蹤劑（紅色染料）在斑馬魚幼魚胃腸中的排空變化；以不給藥的野生型組為對照，拍照記錄；利用Image J軟件測量幼魚腸球處熒光示蹤劑的紅色熒光強度。

1.2.2 RNA-seq分析

取6 dpf野生型斑馬魚幼魚，置于分別含有100 μmol/L的頭孢唑林、雜質(zhì)F或雜質(zhì)A的飼養(yǎng)液中，給藥6 h后收集各組斑馬魚幼魚。總RNA提取、樣品質(zhì)量檢測、RNA-seq測序和分析均由上海美吉生物有限公司完成。所有生物信息學(xué)數(shù)據(jù)均在美吉生物云平臺上分析。差異基因（DEGs）顯著性差異定義為Fold change≥2。KEGG pathway富集分析的顯著性閾值為P＜0.05。

1.2.3 實時定量PCR（qRT-PCR）分析

取6 dpf野生型斑馬魚仔魚，分別給藥不同濃度的頭孢唑林、雜質(zhì)F或雜質(zhì)A（1、10和100 μmol/L），6 h后，收集各組斑馬魚幼魚。TRIzol法提取總RNA；利用PrimeScript RT Master Mix反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板，使用LightCycler480 system（Roche）進行qRT-PCR，實驗中選擇β-actin為內(nèi)對照，野生型斑馬魚組為外對照，mRNA的相對表達量采用2-△△Ct方法計算。qRT-PCR所需的引物序列如下：abcb11b（F： GGTGTGGCTGTTATCATCTCC， R： GTCCTGCTTGGCGAATCC）；β-actin（F： CCGTGACATCAAGGAGAAG; R： ATACCGCAAGATTC CATACC）。

1.2.4 統(tǒng)計學(xué)分析

利用GraphPad 8.0軟件進行統(tǒng)計分析，所有數(shù)據(jù)以3個獨立實驗的平均值±標準偏差（SD）表示。兩組間的比較采用t檢驗，P＜0.05被認為具有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 頭孢唑林及其雜質(zhì)F和雜質(zhì)A對斑馬魚幼魚胃腸道排空過程的影響

利用建立的藥源性斑馬魚胃腸道毒性反應(yīng)模型，觀測頭孢唑林、雜質(zhì)F（MMTD）和雜質(zhì)（TAA）（圖1A）對斑馬魚幼魚胃腸道排空過程的影響，評價其毒性反應(yīng)。與未處理組相比較，在熒光顯微鏡下可見，隨著給藥濃度的增加，頭孢唑林、雜質(zhì)F和雜質(zhì)A均導(dǎo)致紅色染料由腸球向中腸和遠腸區(qū)轉(zhuǎn)移；在100 μmol/L濃度下，雜質(zhì)F組中的紅色熒光幾乎消失（圖1B）。測量腸球區(qū)的紅色熒光強度，這3種化合物導(dǎo)致腸球區(qū)紅色熒光的減弱與給藥濃度呈明顯相關(guān)（圖1C）；當給藥濃度為1 μmol/L時，雜質(zhì)F處理組與頭孢唑林處理組相比熒光強度顯著降低，而雜質(zhì)A處理組的熒光強度與對照組相比沒有顯著差異；當給藥濃度為10 μmol/L時，雜質(zhì)F處理組與頭孢唑林處理組相比的熒光強度均再同步降低，而雜質(zhì)A處理組的熒光強度與對照組相比仍未顯示顯著差異；當給藥濃度為100 μmol/L時，雜質(zhì)F處理組與頭孢唑林處理組的熒光強度均進一步降低，雜質(zhì)A處理組與對照組相比熒光強度才顯示出顯著降低。上述結(jié)果表明，在相同處理濃度下，雜質(zhì)F的胃腸排空能力明顯大于頭孢唑林，雜質(zhì)A的胃腸排空能力明顯小于頭孢唑林。即頭孢唑林、雜質(zhì)F和雜質(zhì)A誘導(dǎo)的斑馬魚胃腸毒性依次為：雜質(zhì)F＞頭孢唑林＞雜質(zhì)A。

2.2 RNA-seq分析

利用RNA-seq技術(shù)通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析深入研究頭孢唑林及其雜質(zhì)導(dǎo)致的胃腸道毒性反應(yīng)機制，以及上述3種化合物胃腸道毒性反應(yīng)機制的差異。與野生型組相比，雜質(zhì)F處理組共有418個呈顯著差異的表達基因（DEGs），其中上調(diào)基因68個，下調(diào)基因350個；與頭孢唑林處理組相比，雜質(zhì)F處理組共有235個呈顯著差異的表達基因，其中上調(diào)基因98個，下調(diào)基因137個；與雜質(zhì)A處理組相比，雜質(zhì)F處理組共有211個呈顯著差異的表達基因，其中上調(diào)基因52個，下調(diào)基因159個（圖2A）。對上述3組呈顯著差異的表達基因進行維恩（Venn）分析，找到了45個共同呈顯著差異的基因（圖2B）。將這45個共同呈顯著差異的基因進行KEGG pathway功能富集分析，發(fā)現(xiàn)它們主要富集在消化系統(tǒng)相關(guān)的通路（digestive system）和與免疫系統(tǒng)相關(guān)的通路（immune system）中；其中，與消化系統(tǒng)相關(guān)通路中的礦物質(zhì)吸收（mineral absorption）通路和膽汁分泌（bile secretion）通路存在顯著富集情況（P＜0.05）（圖2C）。礦物質(zhì)吸收通路異常通常涉及腸道吸收問題，如脂肪吸收不良、乳糖不耐受等，吸收不良綜合癥通常影響了胃腸道的正常排空和吸收能力[13]。膽汁分泌通路異常可能會影響膽汁的質(zhì)量和數(shù)量，對脂肪的消化和吸收產(chǎn)生不利影響，表現(xiàn)為脂肪大量排出，脂溶性維生素吸收不良，以及腹瀉等胃腸道反應(yīng)[14]。富集到礦物質(zhì)吸收通路的差異基因有BX511021.1、fthl28、fthl31、fthl29和fthl27，富集到膽汁分泌通路的差異基因有nr0b2a、slc22a7b.2和abcb11b；與野生型相比，這些基因的表達只有雜質(zhì)F處理組顯示出顯著差異，頭孢唑林和雜質(zhì)A處理組則表現(xiàn)為沒有顯著差異（圖2D）。上述結(jié)果提示，雜質(zhì)F較頭孢唑林和雜質(zhì)A具有更強的胃腸道毒性反應(yīng)可能與這些差異基因的表達有關(guān)。將這些基因進行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析（PPI），發(fā)現(xiàn)只有富集到膽汁分泌通路的nr0b2a、slc22a7b.2和abcb11b具有蛋白互作關(guān)系，其中abcb11b在該網(wǎng)絡(luò)中具有較高的節(jié)點度（圖2E）。提示abcb11b在雜質(zhì)F導(dǎo)致的胃腸道毒性反應(yīng)中可能具有重要作用。

2.3 分子對接

結(jié)構(gòu)-毒性關(guān)系（structure-toxicity relationships）已被用于計算機預(yù)測藥物毒性。近年來的研究表明，結(jié)構(gòu)-毒性關(guān)系與分子對接（基于結(jié)構(gòu)的計算）聯(lián)合應(yīng)用可用于預(yù)測藥物雜質(zhì)的毒性。上述PPI分析結(jié)果表明，與abcb11b的相互作用可能與藥物誘導(dǎo)的胃腸道毒性有關(guān)。采用qRT-PCR驗證頭孢唑林、雜質(zhì)F和雜質(zhì)A對斑馬魚體內(nèi)abcb11b基因表達水平的影響，結(jié)果表明，雜質(zhì)F能濃度依賴地顯著降低abcb11b基因的表達水平，而頭孢唑林和雜質(zhì)A對abcb11b基因的表達無影響（圖3A）。abcb11b基因編碼膽汁鹽外排蛋白（bile salt export pump，BSEP），這是一種細胞膜轉(zhuǎn)運蛋白，主要在肝細胞的膽小管上表達。其主要功能是維持正常的膽汁酸循環(huán)和膽汁的排泄[15]。斑馬魚的BSEP和人類BSEP的氨基酸序列同源性高達70.9%。以頭孢唑林、雜質(zhì)F和雜質(zhì)A作為配體，分別與斑馬魚BSEP的活性位點進行對接，其最佳對接構(gòu)象如圖3B所示。采用-CDOCKER相互作用能量值（-CDOCKER interaction energy scores）表征配體與蛋白質(zhì)結(jié)合的親和力[16]，上述3種化合物的最高-CDOCKER相互作用能量值得分依次為雜質(zhì)F＞頭孢唑林＞雜質(zhì)A（表1）。雜質(zhì)F與斑馬魚BSEP的親和力高于頭孢唑林，頭孢唑林的結(jié)合親和力高于雜質(zhì)A，與體內(nèi)實驗結(jié)果一致。上述結(jié)果提示，藥物與BSEP蛋白結(jié)合的親和力可能表征其導(dǎo)致的胃腸道毒性反應(yīng)，利用藥物與BSEP蛋白分子的對接模擬分析，可以快速評估頭孢唑林雜質(zhì)導(dǎo)致的胃腸道毒性反應(yīng)。然而，BSEP是否是頭孢唑林及其雜質(zhì)誘導(dǎo)胃腸道毒性的真正靶標還需進一步研究。

3 討論

分子中直接導(dǎo)致機體毒性反應(yīng)的化學(xué)基團被稱為毒性功能基因[17]；頭孢菌素的3位和7位側(cè)鏈被認為是不同的毒性功能基團，可導(dǎo)致機體發(fā)生不同毒性反應(yīng)[18]。前期的研究證明，頭孢唑林分子3位側(cè)鏈的MMTD結(jié)構(gòu)是導(dǎo)致斑馬魚胚胎畸形的主要毒性功能基團，亦是引起藥物心臟毒性的主要毒性功能基團之一[19]；本文利用藥源性斑馬魚胃腸道毒性反應(yīng)模型比較頭孢唑林與雜質(zhì)F（C-3位側(cè)鏈的結(jié)構(gòu)單元）、雜質(zhì)A（C-7位側(cè)鏈的結(jié)構(gòu)單元）的胃腸道毒性反應(yīng)，雜質(zhì)F（MMTD）的胃腸道毒性反應(yīng)明顯大于頭孢唑林（圖1），證明MMTD結(jié)構(gòu)亦是導(dǎo)致頭孢唑林胃腸道反應(yīng)的主要毒性功能基團。頭孢唑林中的已知雜質(zhì)按其結(jié)構(gòu)可分為3類：第一類雜質(zhì)包括雜質(zhì)A（頭孢唑林的7側(cè)鏈TAA）、雜質(zhì)G（頭孢唑林的母核7-ACA）和雜質(zhì)F（頭孢唑林的3側(cè)鏈MMTD），為頭孢唑林分子結(jié)構(gòu)的基本單元；第二類雜質(zhì)的7側(cè)鏈均為TAA結(jié)構(gòu)，但3側(cè)鏈與頭孢唑林不同；第三類雜質(zhì)的3側(cè)鏈為MMTD結(jié)構(gòu)，但7側(cè)鏈的結(jié)構(gòu)或構(gòu)型與頭孢唑林不同[19]。本文的結(jié)果表明，含有MMTD結(jié)構(gòu)的第三類雜質(zhì)亦是導(dǎo)致頭孢唑林胃腸道反應(yīng)的毒性雜質(zhì)。

目前國內(nèi)上市的注射用頭孢唑林鈉分別由冷凍干燥工藝和溶媒結(jié)晶工藝生產(chǎn)，前者常稱為普通頭孢唑林鈉，后者稱為五水頭孢唑林鈉。2020年國家評價性抽驗數(shù)據(jù)顯示，冷凍干燥工藝產(chǎn)品中的雜質(zhì)含量明顯高于溶媒結(jié)晶工藝的產(chǎn)品；在冷凍干燥工藝產(chǎn)品中，雜質(zhì)F的含量約為0.4（SD=0.18），總雜質(zhì)的含量約為2.1（SD=0.75）；在溶媒結(jié)晶工藝產(chǎn)品中，雜質(zhì)F的含量約為0.1（SD=0.06）；總雜質(zhì)的含量約為1.2（SD=0.39）（未發(fā)表資料）；對2010—2018年國家藥品不良反應(yīng)數(shù)據(jù)庫中注射用頭孢唑林鈉的不良反應(yīng)監(jiān)測數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析（表2）。可見，不同工藝產(chǎn)品的不良反應(yīng)差異主要表現(xiàn)為胃腸道反應(yīng)的不同；凍干工藝產(chǎn)品的胃腸道反應(yīng)是溶媒結(jié)晶工藝產(chǎn)品的2倍。提示不同企業(yè)生產(chǎn)的注射用頭孢唑林鈉不良反應(yīng)的差異可能與其所含有的雜質(zhì)，特別是與雜質(zhì)F的含量不同有關(guān)。

化合物與BSEP蛋白結(jié)合的親和力可能表征其引起的胃腸道毒性反應(yīng)的差異（表1）；利用藥物與BSEP蛋白分子的對接模擬分析，可以快速評估頭孢唑林雜質(zhì)導(dǎo)致的胃腸道毒性反應(yīng)（圖3）。采用該方法對含有MMTD結(jié)構(gòu)的第三類頭孢唑林雜質(zhì)進行評估，比較其與頭孢唑林和雜質(zhì)F親和力的差異，可以評估它們導(dǎo)致胃腸道毒性反應(yīng)的能力。

4 結(jié)論

利用藥源性斑馬魚胃腸道毒性反應(yīng)模型，通過比較頭孢唑林、雜質(zhì)F（3位側(cè)鏈結(jié)構(gòu)單元MMTD）和雜質(zhì)A（3位側(cè)鏈結(jié)構(gòu)單元TAA）的胃腸道毒性反應(yīng)，證明MMTD結(jié)構(gòu)是頭孢唑林導(dǎo)致的胃腸道毒性反應(yīng)的主要毒性功能基團，但雜質(zhì)F的胃腸道毒性遠強于頭孢唑林，臨床中頭孢唑林鈉的胃腸道毒性反應(yīng)差異可能與產(chǎn)品中雜質(zhì)F的含量有關(guān)。雜質(zhì)F可以來源于合成中殘留的前體，也可以通過降解反應(yīng)產(chǎn)生，與生產(chǎn)工藝關(guān)系密切，是頭孢唑林中的主要雜質(zhì)之一。上述研究為頭孢唑林鈉的生產(chǎn)工藝評估和質(zhì)量控制提供了理論依據(jù)。

對頭孢唑林胃腸道毒性反應(yīng)機理的研究表明，雜質(zhì)F下調(diào)abcb11b基因的表達與胃腸道毒性反應(yīng)呈明顯相關(guān)。abcb11b基因編碼膽汁鹽外排蛋白（Bile Salt Export Pump，BSEP），利用分子對接技術(shù)，通過藥物與BSEP蛋白結(jié)合的親和力可以評估其引起的胃腸道毒性反應(yīng)的差異。利用該策略對含有MMTD結(jié)構(gòu)的頭孢唑林雜質(zhì)等進行評估，可以快速評估他們的胃腸道毒性反應(yīng)能力。

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