牛病毒性腹瀉病毒檢測方法研究進展

賈偉娟，王海鋒，付明山，趙心悅，包雨鑫*，張強

1.內蒙古通遼市農牧科學研究所，內蒙古通遼 028000；

2.內蒙古通遼市農牧業綜合行政執法支隊，內蒙古通遼 028000

牛病毒性腹瀉（bovine viral diarrh，BVD）是由牛病毒性腹瀉病毒（bovine viral diarrh virus，BVDV）感染牛而引起病牛出現發熱、咳嗽、腹瀉、發育遲緩以及懷孕母牛流產或產畸形胎為主要特征的1 種急性、高度接觸性傳染病[1-2]。該病的易感動物以牛為主，其中，幼犢最易感且死亡率較高；此外，其還可感染豬、羊、駱駝等動物[3-4]。

目前，該病被我國認定為三類傳染病，感染后發病機制較為復雜，除了導致呼吸道和消化道損傷、生殖障礙及生長發育遲緩外，還可引起繼發性感染與持續感染，嚴重危害我國肉牛養殖業的健康發展，也給肉牛養殖業造成了巨大的經濟損失[5]。

臨床上常用的檢測方法主要包括病毒的分離鑒定、核酸檢測技術、血清學檢測方法，不同檢測方法的特異性、敏感性、適用的場景及所需的時間也不同，本文綜述了BVDV 常用的檢測技術研究進展，以期為BVDV的檢測、診斷及防控提供思路。

1 BVDV病原特性

BVDV是隸屬于黃病毒科（Flaviviridae）瘟病毒屬（Pestivirus），有外膜、有纖突、形狀為球形的單股正鏈RNA 病毒，長12.3～12.8 kb；包括3 種不同的基因型，即BVDV-1、BVDV-2 和BVDV-3，每種基因型也被分成了不同的亞型，在我國主要流行的是BVDV-1 型的1 m～1 v[6-8]。一般，BVDV 病毒粒子的直徑為40～60 nm，極少部分的病毒粒子直徑超過65 nm，由擬核、核衣殼及脂雙層構成[9]。BVDV 入侵宿主細胞進行復制和生存依靠的是宿主細胞的細胞組成成分和生物多樣性，因此，當BVDV 侵入宿主機體后，其基因組會與宿主蛋白之間發生相互作用，從而使宿主細胞無法維持原有的活性和正常的生物學功能，由此使細胞發生病變死亡并引起機體持續性感染和繼發感染[10]。

BVDV 可以在胎牛腎細胞、豬腎細胞、胎羊睪丸細胞等原代細胞中進行傳代，與豬瘟病毒抗原關系密切，為同屬病毒；對氯仿、乙醚、胰酶等敏感，高溫條件下可殺滅該病毒，50 ℃ 60 min或100 ℃ 2 min可被完全滅活[11]。

2 檢測方法

目前，防控BVDV 最主要的方法是檢測持續感染（persistently infected，PI）動物，消滅并防止PI 動物在動物種群中傳播至關重要，在初期階段尤其是在動物出生不久后就對PI 動物進行檢測對于實施BVDV 的防控計劃來說意義重大。現如今，針對BVDV 可用的檢測方法有很多，總體分為病毒分離法、核酸檢測法和血清學檢測法。每種檢測方法都有其各自的優勢及弊端，需依據不同的診斷情況與動物的年齡來選擇適合的檢測方法。

2.1 病毒分離鑒定

取患病動物的組織樣本進行培養和鑒定BVDV 是實驗室最基礎的鑒別診斷方法，同時也一直是診斷技術中的“金標準”，適用于多種不同的病毒以及新發流行病毒的鑒別診斷[12]。可采集的樣本包括病畜的血液、臟器及淋巴組織等，將樣本進行研磨、反復凍融、離心的方式處理，之后使用原代細胞進行培養，待病毒在細胞中進行增殖后進行鑒定和定量檢測[13]。王勤等[14]將采集的新鮮樣本經反復凍融、研磨、離心處理后，接種于單層MDBK細胞盲傳10 代，之后利用RT-PCR 與間接免疫熒光進行檢測。盲傳10 代后，MDBK 細胞出現細胞圓縮和拉網脫落等明顯的典型細胞病變，同時，RT-PCR 檢測為陽性、間接免疫熒光為特異性綠色熒光。王妍瑾等[15]通過將臨床樣品進行破碎、離心處理后，將其接種于MDBK 細胞中盲傳5 代，隨后經RT-PCR檢測并使用透射電鏡進行觀察。盲傳5 代后，MDBK 細胞雖未明顯出現細胞病變，但RT-PCR 結果顯示陽性，同時在透射電鏡下也觀察到呈球形、有外膜、直徑40～60 nm 的病毒顆粒。趙輝等[16]從寧夏地區采集牛全血，處理后接種至MDBK細胞進行病毒增殖，盲傳7 代后用寇氏法（Karber）公式來計算所分離病毒的半數組織細胞感染量（TCID50值），同時用透射電鏡觀察病毒粒子形態。結果顯示，盲傳3代后，部分細胞出現死亡、聚集、形成空斑，之后不斷圓縮、死亡并脫落，傳至7代時，病變依舊明顯。電鏡下可見直徑40～60 nm的病毒粒子，測得病毒滴度為107.0TCID50/0.1 mL。王慧慧等[17]將牦牛血清中分離的病毒接種至MDBK細胞進行傳代，觀察細胞病變，同時測定TCID50值。接種病毒后5 d，MDBK 細胞出現變圓、間隙增大、胞漿出現空泡，最后出現“蛛網”現象，呈現出典型的細胞病變。Kar‐ber 法測定的TCID50值為5.0×106.5/mL。雖然，病毒分離鑒定法重復性強，比較容易控制，但由于病毒分離法對實驗室要求較高且屬于勞動密集型，往往需要幾天時間才能完成，試驗周期較長，因此，該方法不適用于大規模的樣本監測。

2.2 BVDV核酸檢測

隨著核酸檢測技術的不斷發展，檢測BVDV 的核酸方法除了常規PCR 之外，RT-PCR、微滴式數字RT-PCR（dd-PCR）、納米PCR、二溫式PCR 等檢測方法相繼出現。

鮑顯偉等[18]根據GenBank 中已經公布的BVDV 5'-UTR 基因序列和牛傳染性鼻氣管炎病毒（infectious bovine rhinortracheitis virus，IBRV）的gB基因序列分別合成了特異性的引物，通過不斷優化反應條件，最終建立了可以同時檢測BVDV 和IBRV 的雙重PCR 檢測方法，同時也測試了該方法的特異性、重復性及靈敏性。結果顯示，該方法對BVDV、IBRV、IBRV/BVDV 分別擴增出198、500、500/198 bp 的特異性目的條帶，對其他牛病病毒和牛支原體的檢測結果均為陰性；BVDV+IBRV 混合液中的BVDV 和IBRV 的最低檢測限分別為103、104copies/μL；經3 次重復性試驗后結果均無變化。而采用該方法檢測的79 份臨床可疑樣本中，BVDV、IBRV、IBRV+BVDV 的檢出率分別是12.66%、17.72%和8.86%，與BVDV 和IBRV 的單重PCR 的結果符合率分別為90.00%和93.33%，混合感染符合率達到100%。表明該研究所建立的BVDV 和IBRV 雙重PCR 檢測方法特異性、重復性、敏感性良好。為了能夠快速檢測BVDV 通用型及BVDV-1 型、BVDV-2 型的檢測方法，趙成瑩等[19]根據GenBank 中BVDV 5'-UTR 基因序列分別設計了BVDV 通用引物和BVDV-1 型、BDVD-2 型特異性引物，建立了BVDV 通用型RT-PCR 和BVDV-1 型、BVDV-2型分型RT-PCR并檢測了該方法的重復性、符合性和特異性。結果顯示，用這3 種檢測方法檢測其他病毒均為陰性，靈敏度分別為6.84、1.08、3.03 ng；BVDV 通用型RT-PCR 與BVDV-1 型分型RT-PCR、BVDV-2 型分型RT-PCR 檢測方法的符合率達100%。說明建立的BVDV 通用型RT-PCR 與BVDV-1 型分型RT-PCR、BVDV-2 型分型RT-PCR檢測方法具有良好的特異性、準確性和靈敏性。梁洪等[20]根據GenBank 中豬源BVDV 和豬瘟病毒（clssical swine fever virus，CSFV）5'-UTR 基因序列設計合成特異性引物，建立了既可檢測豬源BVDV又可檢測CSFV 的一步法雙重RT-PCR 方法。該方法分別對豬源BVDV、CSFV、豬源BVDV/CSFV 混合物擴增出185、342、185、342 bp 的特異性條帶；對豬源BVDV、CSFV、BVDV/CSFV 混合物的檢出靈敏度分別達0.95、0.85、8.0 ng；與豬源BVDV、CSFV一步法RT-PCR 檢測方法的符合率均為100%。在對94 份疑似CSFV 感染臨床病例樣品的檢測應用中，豬源BVDV 陽性率為14.89%，CSFV 陽性率為24.47%，二者的混合感染率是5.32%。說明該雙重RT-PCR 檢測方法的敏感性、重復性、特異性及臨床應用性均良好，能夠作為快速鑒別檢測BVDV 和CSFV的檢測方法。

葉京飛等[21]設計了BVDV 的特異性引物和探針，在一步法實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測法的基礎上，將RT-ddPCR 試驗中的反轉錄酶、引物、退火溫度、探針濃度以及該方法的反應條件進行優化，并對該方法的敏感性、特異性和重復性進行測定。結果顯示，商品化數字PCR 試劑盒的配套試劑為該RT-ddPCR 方法的最佳反轉錄體系，引物和探針終濃度分別為900、250 nmol/L，最佳退火溫度為57 ℃；該方法對常規疫病的檢測結果為陰性，3.2 copies/μL 為最低檢測限，重復性好，且變異系數小于5%。表明葉京飛等[21]所建立的RT-ddPCR 方法的敏感性較高、對BVDV 的特異性較強、可重復性較好，可以作為BVDV 早期檢測的快速診斷技術。為了能夠同時檢測BVDV 和牛冠狀病毒（bovine coronavirus，BCoV）2 種病原，魏宇等[22]建立了雙重納米RT-PCR 方法。該方法與牛其他病毒均無交叉反應，特異性較好，使用該方法檢測33 份腹瀉牛的臨床樣品和25 份腹瀉鹿的臨床樣品，得出BVDV、BCoV 和2 種病原混合感染的牛樣品檢出率分別為15.15%、36.36%和6.06%；而鹿樣品感染BVDV、BCoV 和2 種病原混合感染的陽性率分別為28%、8%和8%。敏感性試驗的最低檢出限為1 fg，是常規RT-PCR 的10 倍。表明所建立的方法快速、靈敏且簡捷，同時能夠適用于檢測大批量臨床樣品。范晴等[23]為了建立BVDV 的二溫式PCR 快速檢測方法，根據BVDV的5/端非編碼區設計了特異性引物。結果顯示，該方法只擴增BVDV 模板，檢測其他牛病病毒均為陰性；對BVDV 的RNA 最低可檢測到1 pg。

除上述方法外，環介導等溫擴增（LAMP）和重組酶聚合酶擴增（RPA）作為新型核酸恒溫擴增技術，無需特殊設備，不僅操作簡單而且具有反應時間較短、敏感性高、特異性強的特點，且特別適宜應用于地方基層的檢測。雷麗霞[24]參考了已有檢測方法、在分析BVDV 基因組的基礎上建立了RPA 和LAMP 檢測方法。該LAMP 檢測方法經過不斷優化后，最終確定了其反應體系，最適反應時間為50 min，最適反應溫度為62 ℃；特異性結果表明，可以區分BVDV 毒株與腹瀉相關的其他毒株，具有良好的特異性；敏感性結果表明，1.9×102copies/nL是LAMP 的最低檢測限，靈敏度是普通PCR 的10倍。隨后，雷麗霞[24]根據BVDV基因組的5'-UTR基因序列，建立了BVDV 基礎RPA 檢測方法，確定其最適反應時間為15 min，最適反應溫度為37 ℃。以陽性質粒標準品為模板進行梯度稀釋，確定基礎RPA的最低檢測限為1.9×102copies/nL，與LAMP的最低檢測限一致。最后，雷麗霞[24]在基礎RPA 的基礎上又建立了BVDV 的LFD-RPA 檢測方法，確定其最適反應時間為15 min，最適反應溫度為35 ℃。以cDNA 為模板梯度稀釋，其最低檢出量為5.8×10–2ng/L；以陽性質粒標準品為模板進行梯度稀釋，確定其最低檢測限為1.9×102copies/nL，靈敏度與基礎RPA和LAMP的一致。

核酸檢測因具有特異性高、反應快速的特點在國內外應用非常廣泛，細菌、真菌、病毒以及寄生蟲等均可使用核酸檢測技術進行病原的快速檢測。雖然PCR 檢測方法具有耗時長、工作量大、操作不便等不足，但LAMP 和RPA 檢測技術不僅特異性高、反應快速、靈敏性強、便于操作，而且對儀器設備要求低，為在野外環境的檢測與現場診斷提供了極大的便利。

2.3 BVDV血清學檢測

在BVDV 的血清學檢測中，最常使用的方法是酶聯免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA），不僅可以在短時間內取得準確的結果，而且操作便捷。葛玉鳳等[25]通過原核表達的方式，取得了BVDV 重組E2 蛋白，并利用其作為包被抗原建立了可以檢測BVDV 的間接ELISA 方法。結果顯示，通過此方法檢測其他病毒血清，結果均為陰性，BVDV 的檢測靈敏度可達1:12 800；在組內和組間的重復性試驗中，變異系數分別小于5%和10%，與中和試驗的符合率為94.44%。魏偉[26]將BVDV NS3蛋白中1段具有免疫反應型的重組片段作為包被抗原，建立了檢測BVDV 抗體的間接ELISA 方法。此方法與市場內同類試劑盒的符合率高達91.3%，與8 種臨床上常見牛病的血清無交叉反應，重復性試驗的變異系數小于10%。以上數據表明，該方法有較好的特異性和重復性。李倬等[27]制備了牛抗BVDV 及兔抗BVDV，通過超免疫血清的方式建立了檢測BVDV 的雙抗體夾心ELISA 檢測方法。結果表明，100 μg/mL 為牛抗BVDV IgG 的抗體包被質量濃度，50 μg/mL 為兔抗BVDV IgG 抗體的最佳工作質量濃度，反應時間90 min，酶標抗體的工作濃度是1:8 000，陽性的判定標準為OD490nm≥0.177，重復性小于10%，最低檢出限為1.87 μg/mL，與其他病原無交叉反應。

ELISA 作為臨床上常規的檢測方法之一，一直被廣泛應用，該方法既可以檢測組織及臟器培養物中的BVDV，又能夠用來監測大規模牛群的BVDV抗體水平。但是由于該方法所需的特異性抗原制備比較困難，且易檢出假陽性，也有一定的局限性。

3 展 望

一直以來，BVDV 嚴重危害我國乃至整個世界養牛業的健康發展，給畜牧業帶來極大經濟損失的原因主要是對其檢測不嚴格及活牛的流動量變大。因此，加強對BVDV 的檢測與監測對制定BVDV 防控和凈化策略意義重大。研發快速、高效的檢測技術可以及時檢出畜群中存在或潛在的BVDV，能夠減少該病給養殖業帶來的經濟損失。由此可見，研發新型、高效的檢測方法至關重要。除上述提到的一些檢測方法外，很多新型的檢測技術也正在研發過程中，如金納米顆粒結合PCR 技術、基因芯片技術和交聯與非交聯探針金納米顆粒雜交技術等[28-30]。這些方法檢測準確、快速、敏感、耗時較短，一定程度上避免了假陽性出現的問題，但是部分方法依舊不適用于基層的檢測。因此，研發出不需大量人力及復雜儀器且適用于基層檢測的方法依舊是今后BVDV 檢測技術研發創新的重中之重。如今臨床上所使用的檢測方法均存在缺陷與優勢，不同的應用場景使用的方法也各不相同，還是需根據實際情形選擇最適宜的方法，在提高效率的同時也可以確保檢測的準確率。隨著科技的不斷進步，檢測方法也在飛速優化、更新、完善，為我國的BVDV防控提供支撐。