不同產(chǎn)地覆盆子乙醇提取物中的酚類物質(zhì)及其抗糖尿病活性

王佩欣，盧菲艷，張 露，周雯娜，彭春彥，陳明舜 ，涂宗財,3

（1.江西師范大學(xué)健康學(xué)院，江西南昌 330022；2.江西師范大學(xué)國家淡水魚加工技術(shù)研發(fā)專業(yè)中心，生命科學(xué)學(xué)院，江西南昌 330022；3.南昌大學(xué)食品科學(xué)與資源挖掘全國重點實驗室，江西南昌 330047）

藥用覆盆子（Rubus chingiiHu）是薔薇科懸鉤子屬華東覆盆子的未成熟干燥果實，因葉裂如掌又稱掌葉覆盆子。全世界大約有750 余種藥用覆盆子，大多數(shù)種植于北半球溫帶，少數(shù)種植于熱帶，藥用覆盆子在我國主要分布于江蘇、浙江、安徽、福建、江西、廣西等地[1-2]。近十年來，許多國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，藥用覆盆子中含有酚酸、黃酮、單寧、多糖、生物堿、萜類及甾體等多種活性成分，其中水解單寧、酚酸、黃酮等酚類物質(zhì)為其主要活性成分[3-4]。藥理研究表明，覆盆子具有抗氧化、降血糖、降血脂、抗癌、抗衰老、改善學(xué)習(xí)能力、調(diào)節(jié)性激素水平等作用[5-6]。

然而，受品種、地理位置和生長條件的影響，植物營養(yǎng)成分組成和活性可能存在較大差異。平嘉倩等[7]研究發(fā)現(xiàn)不同品種和產(chǎn)地的覆盆子總糖、糖酸比、VC和氨基酸含量差異顯著，江西覆盆子的果糖含量、糖酸比最高，福建的最低，但福建覆盆子卻含有較高的氨基酸和礦質(zhì)元素。付彩群等[8]研究發(fā)現(xiàn)產(chǎn)地、采收期是造成藥用覆盆子酚類化合物含量差異的主要原因，浙江產(chǎn)地覆盆子中鞣花酸含量明顯高于江西，而向陽與背陽對覆盆子活性成分含量的影響較小。Park 等[9]的研究發(fā)現(xiàn)Gokseong 的覆盆子具有最高的多酚含量，Jeongeup 的覆盆子具有最高的黃酮含量，Gochang、Sunchang、Jeongeup 和Jinan等地覆盆子中花色苷的含量要略多于Gokseong 和Hoengseong。然而，很少有研究集中在來自不同產(chǎn)地的覆盆子酚類物質(zhì)組成及活性的差異。

綜上，產(chǎn)地不同會導(dǎo)致覆盆子中活性成分含量差異顯著，但國內(nèi)外對覆盆子的研究主要集中在活性成分分離鑒定及種質(zhì)資源的評價和利用方面，而關(guān)于產(chǎn)地對覆盆子酚類物質(zhì)及活性影響的研究較少。本文采用40%乙醇提取廣東、廣西、安徽、浙江、江西和四川六個不同產(chǎn)地覆盆子酚類物質(zhì)，評價不同產(chǎn)地覆盆子提取物中總酚、總黃酮和總水解單寧的含量以及酚類物質(zhì)的組成，并對比不同產(chǎn)地覆盆子體外抗糖尿病活性，以期獲得較優(yōu)品質(zhì)的覆盆子，為后續(xù)覆盆子的深度加工提供借鑒，促進覆盆子資源的高值化利用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

覆盆子 2022 年5 月于廣東、廣西、安徽、浙江、江西和四川六個產(chǎn)地采集，江西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院袁濤教授鑒定為薔薇科懸鉤子屬，曬干后-4 ℃保存?zhèn)溆茫粺o水乙醇 天津永大化學(xué)試劑有限公司；牛血清白蛋白、葡萄糖、沒食子酸、槲皮素、維生素C（VC）標(biāo)準(zhǔn)品、三氯化鋁、碳酸鈉、碘酸鉀、福林酚 北京索萊寶科技有限公司；α-葡萄糖苷酶（100 U）、對硝基苯基-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG）、阿卡波糖、2,2'-聯(lián)氨-雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺鹽（ABTS）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）美國Sigma 公司；甲酸、乙腈 色譜純，阿拉丁；所有實驗用水均為雙蒸水。

KH-500DE 型數(shù)控超聲波清洗器 昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；RV10 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國IKA有限公司；Synergy H1 型酶標(biāo)儀 美國Biotek 儀器有限公司；F-7000 型熒光分光光度計 日本日立有限公司；ESJ200-4 型電子天平 沈陽龍騰電子有限公司；5430R 型離心機 艾本德中國有限公司；Triple TOF 5600+液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 AB SCIEX 儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 覆盆子提取物的制備 參照前期優(yōu)化的方法提取覆盆子中的酚類物質(zhì)[5]，將六個產(chǎn)地的藥用覆盆子粉碎成粉末后，按1:10 的料液比（g/mL）加入40%乙醇，混勻后于KH-500DE 數(shù)控超聲波清洗器中400 W，50 ℃超聲提取1 h，抽濾，收集上清液，殘渣再在相同條件下提取一次，合并所有上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后冷凍干燥至粉末狀，制得覆盆子提取物樣品，于4 ℃冷藏備用。

1.2.2 總酚含量的測定 參照文獻步驟，采用福林酚法檢測樣品的總酚含量[10]。取200 μL 0.25 mg/mL樣品與0.1 mL 福林酚試劑于試管中室溫反應(yīng)5 min，加入0.3 mL 20%的碳酸鈉溶液和1.0 mL 雙蒸水，避光反應(yīng)25 min 后，采用酶標(biāo)儀測定反應(yīng)體系在765 nm 處的吸光值。空白組以雙蒸水代替碳酸鈉溶液，以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果以沒食子酸當(dāng)量（μg GAE/mg E）表示。

1.2.3 總黃酮含量的測定 采用三氯化鋁比色法測定樣品中總黃酮的含量[11]。取100 μL 1.0 mg/mL 的樣品與100 μL 10%三氯化鋁于酶標(biāo)板中混勻，室溫反應(yīng)15 min 后，采用Synergy H1 酶標(biāo)儀測反應(yīng)體系在430 nm 處的吸光值。乙醇代替三氯化鋁溶液的反應(yīng)體系為空白組，以槲皮素為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果以槲皮素當(dāng)量（μg QUE/mg E）表示。

1.2.4 總水解單寧含量的測定 采用碘酸鉀法測定樣品中水解單寧的含量[10]。取100 μL 1.0 mg/mL 樣品與150 μL 5%碘酸鉀溶液于酶標(biāo)板中混勻，室溫反應(yīng)15 min 后，測其在550 nm 的吸光值。以乙醇代替碘酸鉀溶液的反應(yīng)體系為空白組，以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品作標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果以沒食子酸當(dāng)量表示（mg GAE/g E）。

1.2.5 不同產(chǎn)地覆盆子提取物HPLC-MS/MS 分析將不同產(chǎn)地覆盆子提取物粉末溶解在甲醇中，配制成2 mg/mL 的溶液，經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾后采用AB Exion LC 高效液相色譜-TripleTOF 5600+高分辨質(zhì)譜聯(lián)用儀（AB Sciex）測定提取物中酚類物質(zhì)。利用PeakView 對樣品進行MS/MS 數(shù)據(jù)分析，通過將獲得的數(shù)據(jù)與參考文獻和Scifinder、Metlin 數(shù)據(jù)庫中記錄的數(shù)據(jù)進行匹配，對化合物的結(jié)構(gòu)進行初步鑒定，并通過峰面積對化合物進行定量分析。

高效液相色譜參數(shù)：色譜柱為SHIM-PACK GIST C18（75 mm×2.1 mm）；流動相A 為0.1%甲酸水溶液，流動相B 為乙腈溶液；梯度洗脫程序條件為0～6 min 4% B，6～32 min 4%～16.5% B，32～45 min 16.5% B；檢測波長為254 nm；柱溫為35 ℃；流速為0.3 mL/min；進樣量為5 μL。

質(zhì)譜參數(shù)：電噴霧離子源為負離子模式，550 ℃ESI 離子源；質(zhì)量掃描范圍為50～2000 Da，離子源霧化氣為50 psi，離子源加熱輔助氣為35 psi；一級質(zhì)譜去簇電壓為-80 V，碰撞能為-10 eV；二級質(zhì)譜去簇電壓為-80 V，CE 為-40±20 eV。

1.2.6 自由基清除能力測定 采用DPPH 和ABTS法比較樣品的自由基清除能力[11]。取50 μL 適宜濃度的樣品與150 μL 新鮮配制的DPPH·溶液（0.15 mmol/L）或ABTS+·溶液于酶標(biāo)板中混勻并進行稀釋，室溫避光孵育30 min（DPPH·溶液）或6 min（ABTS+·溶液）后，分別于517 nm 和734 nm 處測定吸光值。乙醇代替自由基溶液的反應(yīng)體系為樣品空白組，以VC作陽性對照。采用Origin 2018 計算樣品清除DPPH 和ABTS+自由基半抑制濃度，結(jié)果用IC50值（μg/mL）表示。

1.2.7α-葡萄糖苷酶抑制能力測定 參考Tan 等[5]方法測定樣品的α-葡萄糖苷酶抑制能力。取50 μL 適宜濃度樣品與100 μL 0.1 U/mLα-葡萄糖苷酶于酶標(biāo)板中倍稀，室溫反應(yīng)6 min 后加入50 μL 5.0 mmol/L pNPG 反應(yīng)10 min，最后加入100 μL 0.2 mol/L 碳酸鈉終止反應(yīng)，并于405 nm 處測定吸光值（Ai），以不加酶和樣品的反應(yīng)體系為空白組（Aj），不加樣品的反應(yīng)體系為控制組（Ac），阿卡波糖為陽性對照。按照公式（1）計算樣品中α-葡萄糖苷酶抑制能力，結(jié)果用IC50值（mg/mL）表示。

1.2.8 晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）抑制能力測定采用牛血清白蛋白（BSA）-葡萄糖反應(yīng)體系評價樣品抑制AGEs 形成能力[12]。將200 μL 提取物（1 mg/mL）與1.0 mL BSA（20 mg/mL）、1.0 mL 葡萄糖溶液（500 mmol/L）于10 mL 棕色帶蓋玻璃瓶中混勻，恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃孵育4 周后取出，冰水浴終止反應(yīng)。最后用0.1 mol/L pH7.4 的磷酸鹽緩沖溶液稀釋10 倍后，采用F-7000 熒光分光光度計測定稀釋液在激發(fā)波長340 nm，發(fā)射波長420 nm 處的熒光值。以氨基胍為陽性對照，按照公式（2）計算樣品對AGEs 的抑制率。

式中：FIs表示含有樣品、蛋白和糖的反應(yīng)體系的熒光強度；FIc表示不含樣品的反應(yīng)體系的熒光強度；FIb表示不含樣品和蛋白的反應(yīng)體系的熒光強度；FInb表示不含蛋白的反應(yīng)體系的熒光強度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實驗重復(fù)三次，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，采用SPSS 13.0 中的單因素方差分析和t-檢驗進行統(tǒng)計分析，P＜0.05 認為具有顯著性差異，所有圖形用Origin 8.0 繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 總酚、總黃酮和總水解單寧含量分析

六個產(chǎn)地藥用覆盆子提取物的總酚、水解單寧、總黃酮含量如表1 所示。廣東和安徽產(chǎn)的覆盆子提取物中的總酚含量最高，為349.77 和345.16 μg GAE/mg E，廣西和四川覆盆子提取物的總酚含量最低，為294.47 和285.16 μg GAE/mg E，且兩者之間不存在顯著性差異（P＞0.05）。浙江覆盆子提取物中的總黃酮含量最高，達202.55 μg QUE/mg E，其次為廣西、江西和廣東覆盆子提取物，含量為156.92～153.51 μg QUE/mg E，且三者之間不存在顯著性差異（P＞0.05），四川覆盆子提取物的總黃酮含量最低，僅112.77 μg QUE/mg E。四川覆盆子提取物中的可水解單寧含量最高，為125.07 mg GAE/g E，其次為廣西和浙江覆盆子提取物，廣東和安徽覆盆子提取物中的水解單寧含量最低，為62.07 mg GAE/g E 和64.87 mg GAE/g E，且兩者之間不存在顯著性差異（P＞0.05）。

表1 六個產(chǎn)地覆盆子提取物的總酚、水解單寧、總黃酮含量Table 1 Total phenols,hydrolyzed tannins and total flavonoids content of raspberry extracts from six producing areas

2.2 主要化學(xué)成分分析

為了比較六個產(chǎn)地覆盆子之間的差異，本文檢測了六個產(chǎn)地覆盆子提取物中酚類物質(zhì)，色譜圖如圖1 所示。從覆盆子提取物鑒定出34 個酚類化合物，主要是鞣花單寧、黃酮和酚酸類物質(zhì)（表2）。

圖1 六個產(chǎn)地覆盆子提取物的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of raspberry extracts from six producing areas

表2 六個產(chǎn)地覆盆子提取物的定性定量分析Table 2 Qualitative and quantitative analysis of raspberry extracts from six producing areas

鞣花單寧是懸鉤子屬植物中的一類主要活性成分。通過對比母離子、離子碎片可以推斷化合物的初步結(jié)構(gòu)。鞣花單寧在負離子模式下的特征碎片離子包括：沒食子酰基（m/z 151），hexahydroxydiphenoyl（HHDP）基團（m/z 301），HHDP-葡萄糖部分（m/z 463、301 和161）和沒食子酰葡萄糖基（m/z 331）。六個產(chǎn)地都含有豐富的鞣花單寧，共鑒定出12 種鞣花單寧，主要包括鞣花酸、木麻黃鞣寧、花梗鞣素、galloyl-HHDP-glucose、鞣花酸己糖醛酸等，其中四川產(chǎn)地含量占比最高，占其總酚類化合物的56%。盧遇[13]通過HPLC-QTOF-MS/MS 技術(shù)從覆盆子中鑒定了26 個酚類物質(zhì)成分，其中鞣花單寧是覆盆子中主要活性成分，這與本文結(jié)果相一致。

黃酮類化合物也是覆盆子中的主要酚類物質(zhì)，共鑒定出19 種黃酮類化合物，主要以黃酮苷形式存在。包括原花青素二聚體、表兒茶素、報春黃甙、柚皮素己糖苷、蘆丁、槲皮素-3-O-半乳糖苷、異葒草素阿拉伯糖苷、山奈酚-3-O-洋槐糖苷、山奈酚-3-O-蕓香糖苷、芹菜素鼠李糖苷等。除了四川產(chǎn)地，其他五個產(chǎn)地的黃酮類化合物含量的都相對較高，占其總酚類化合物的38%以上。其中浙江產(chǎn)地的含量最高，達55%左右。覆盆子中酚酸含量較少，共鑒定出3 種酚酸，分別為白屈菜酸、沒食子酸和短葉蘇木酚酸。

2.3 自由基清除能力

活性氧自由基（ROS）是人體的正常代謝物，但是過多的ROS 在體內(nèi)積累會造成器官的氧化損傷，從而誘發(fā)各種慢性疾病，如炎癥、癌癥、糖尿病、高血壓等[14]。膳食中的多酚、黃酮類物質(zhì)都是良好的天然自由基清除劑[15]。常用的體外自由基清除能力評價方法包括測定O2-·、·OH、DPPH·、ABTS+·等，本研究采用最常用的DPPH 和ABTS 法探究了不同產(chǎn)地覆盆子提取物的DPPH·和ABTS+·清除能力[16-17]。六個產(chǎn)地藥用覆盆子提取物對DPPH·和ABTS+·清除能力如圖2 所示，IC50值越小，表示達到半數(shù)清除率時所需濃度越小，自由基清除能力越強，該產(chǎn)地覆盆子自由基清除能力越強。和陽性對照VC相比，不同產(chǎn)地覆盆子DPPH·和ABTS+·清除能力差異較大，四川覆盆子的DPPH·和ABTS+·清除能力最強，IC50值分別為63.069 和29.977 μg/mL，廣東、廣西、安徽和浙江覆盆子提取物的DPPH·清除能力相差較小，江西覆盆子提取物的DPPH·和ABTS+·清除能力最弱，IC50值分別為109.750 和52.230 μg/mL。張露等[10]研究發(fā)現(xiàn)江西德興所產(chǎn)覆盆子醇溶多酚提取物的DPPH·的IC50值約為80 μg/mL，與本實驗結(jié)果類似。吳峰華等[18]報道表明浙江覆盆子醇溶提取物的DPPH·的IC50值約為0.177±0.0078 mg/mL，與本實驗不盡相同，也許是由于采摘的時間不同。

Mansouri 等[19]證明懸鉤子果實的自由基清除能力可能與其酚類、黃酮類、單寧和花青素含量有關(guān)，Muniyandi 等[20]證明覆盆子的自由基清除能力與其所含酚類、黃酮類、單寧類化合物含量相關(guān)，曾小艷等[21]、謝欣梅等[22-23]證明原花青素、覆盆子酮、覆盆子提取物可以有效降低大鼠血糖，因此產(chǎn)地的不同影響了覆盆子中酚類、黃酮類、單寧類等化合物的含量，進而導(dǎo)致覆盆子間自由基清除能力的差異。覆盆子活性功能由其含有的活性成分決定，已有研究發(fā)現(xiàn)藥用覆盆子中的主要活性物質(zhì)為水解單寧[13]，四川產(chǎn)地覆盆子提取物中水解單寧含量最高，這可能是四川產(chǎn)地覆盆子提取物具有最高自由基清除能力的原因。

2.4 α-葡萄糖苷酶抑制能力

II 型糖尿病的產(chǎn)生被認為與促胰島素分泌和影響胰島素敏感性的關(guān)鍵酶有關(guān)，如α-葡萄糖苷酶、蛋白酪氨酸磷酸酶、AGEs 等[24-25]。α-葡萄糖苷酶可以水解多糖中的α-（1→4）-糖苷鍵，釋放葡萄糖，而α-葡萄糖苷酶抑制劑則能抑制其活性，從而使機體葡萄糖釋放速率下降，有效地降低血糖濃度[13]。不同產(chǎn)地藥用覆盆子提取物的α-葡萄糖苷酶抑制能力如圖3A所示。和陽性對照阿卡波糖（IC50=1.547 mg/mL）相比，六個產(chǎn)地覆盆子對α-葡萄糖苷酶均具有較強的抑制作用。四川和安徽覆盆子對α-葡萄糖苷酶具有最強抑制效果，IC50值分別為0.086 和0.109 mg/mL。廣東、廣西和浙江覆盆子的α-葡萄糖苷酶抑制能力次之，IC50達0.125～0.142 mg/mL。江西覆盆子的α-葡萄糖苷酶抑制能力最弱，IC50值為0.182 mg/mL。Chen 等[26]發(fā)現(xiàn)河北產(chǎn)地的覆盆子提取物具有很好的α-葡萄糖苷酶的抑制能力，是降糖藥阿卡波糖的9 倍，與本文報道的江西覆盆子類似（8.5 倍）。該結(jié)果為覆盆子作為α-葡萄糖苷酶抑制劑資源和降血糖功能食品的開發(fā)提供了科學(xué)依據(jù)，但其具體降血糖成分和作用機制需要進一步研究。

圖3 六個產(chǎn)地覆盆子提取物的α-葡萄糖苷酶（A）和AGEs（B）抑制能力Fig.3 Inhibition capacities on α-glucosidase (A) and AGEs (B)of raspberry extracts from six producing areas

2.5 AGEs 抑制能力

AGEs 是由還原糖及其衍生物（如甘油醛，乙醇醛，甲基乙二醛和乙醛）與蛋白質(zhì)或脂質(zhì)發(fā)生非酶糖基化生成的終末期產(chǎn)物，機體內(nèi)AGEs 的積累會與蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)，引發(fā)糖尿病的一系列并發(fā)癥，延緩衰老和緩解糖尿病并發(fā)癥的有效方法之一便是抑制AGEs 的累積[27]。本研究以不同產(chǎn)地覆盆子對AGEs的抑制活性作為其抑制糖尿病并發(fā)癥的重要指標(biāo)。以抑制AGEs 生成為指標(biāo)，對不同產(chǎn)地的覆盆子提取物進行抑制糖基化活性檢測，結(jié)果如圖3B 所示，不同產(chǎn)地藥用覆盆子提取物對AGEs 的形成具有很強的抑制效果，當(dāng)提取物為1 mg/mL 時，其對AGEs 形成的抑制率達到了73.92%～81.91%。安徽覆盆子的AGEs 抑制率最高，達到81.91%，與陽性對照氨基胍無顯著差異（P＞0.05）。廣東和廣西覆盆子的AGEs 抑制率次之（78.54%～78.85%），江西、四川和浙江覆盆子的AGEs 抑制率最低（74.94%～73.92%）。

3 結(jié)論

不同產(chǎn)地覆盆子間總酚、總黃酮和總水解單寧含量存在差異，其中廣東和安徽覆盆子提取物總酚含量最高，廣西和四川產(chǎn)地的最低；浙江覆盆子提取物總黃酮含量最高，廣西、江西和廣東產(chǎn)地次之，四川產(chǎn)地的最低；四川覆盆子提取物總水解單寧含量最高，廣西和浙江產(chǎn)地次之，廣東和安徽產(chǎn)地的最低。從六個產(chǎn)地的覆盆子提取物中鑒定出34 種酚類物質(zhì)，主要是鞣花單寧、黃酮和酚酸類物質(zhì)，四川覆盆子提取物含有最豐富的鞣花單寧。不同產(chǎn)地覆盆子提取物都具有一定自由基清除能力、α-葡萄糖苷酶抑制活性以及AGEs 抑制能力，其中四川覆盆子的DPPH·和ABTS+·清除能力和α-葡萄糖苷酶抑制活性遠高于其他產(chǎn)地，而安徽覆盆子提取物的AGEs抑制能力略高于其他產(chǎn)地。本文僅對部分產(chǎn)地覆盆子酚類物質(zhì)及其抗糖尿病活性進行了初步研究，對于不同產(chǎn)地體內(nèi)抗糖尿病活性及機制還有待進一步研究。

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